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1、第四节转基因动物一、转基因动物的产生和发展转基因动物(transgenic(transgenic animalanimal）:通过基因工程技术将外源DNADNA导入动物生殖细胞，干细胞，早期胚胎，并在受体动物染色体上稳定整合，并能够稳定传给子代的技术，称为转基因技术。通过转基因技术所获得的动物称转基因动物。第1页/共78页转基因动物转基因动物20世纪70年代中期，基因重组技术与细胞工程技术结合，产生了转基因动物和转基因植物。1974年,HJaenisch和MinZe首次报道向小鼠囊胚注射SV40 DNA后，生产的小鼠部分组织中检测到了SV40 rDNA序列。1980年,Gordon等人通过向小
2、鼠的单细胞胚胎原核注射纯化的DNA-人胸苷激酶基因，获得转基因小鼠。这是一只得真正意义的第一只转基因动物。第2页/共78页转基因硕鼠1982年Palmiter等人将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中,获得比普通小鼠生长速度快24倍，震惊了世界。转基因“硕鼠”（右）第3页/共78页生物反应器研发生物反应器研发在此后几年中，以改进经济性状为目的的转基因动物研究成为热点课题。但除转基因鱼外，多数转基因动物并没有达到预想的要求。第4页/共78页Gordon于1987年获得了分泌组织纤溶酶原激活因子tPA的转基因小鼠。以后的数年内，转基因羊、猪、牛的乳腺生物反应器便相继问世，利用此生产出了多种生
3、物药物：凝血因子、凝血因子XIII、抗胰蛋白酶、tPA、红细胞生成素（EPO）等。动物克隆技术、干细胞技术等与转基因动物技术相结合，加快了动物生物反应器的研究与应用进程。第5页/共78页乳汁中分泌人凝血因乳汁中分泌人凝血因子子IXIX的转基因山羊的转基因山羊 美国转基因猪，其体内含有人类的基因，乳汁含有人体蛋白fator。只需300600只这样的母猪就能满足全世界对这种蛋白的需求。第6页/共78页美国麻省生物技术公司（GTC，Biotherapeutics）利用转基因动物技术开发、生产和商业化治疗用蛋白质。ATryn是GTC生物治疗公司开发的一种人抗凝血酶重组蛋白，它是第一个在世界上得到认可的
4、转基因动物生产的蛋白。2006年6月宣布，美国GTC公司用转基因山羊生产的人抗凝血酶“ATryn”（-antithrombin）获得欧洲药品评价局（EMEA）人用药品委员会（CHMP）的批准推荐。2009年2月，FDA首次批准由转基因动物生产药物-人抗凝血酶“ATryn”上市。第7页/共78页二、转基因动物技术的原理和方法（一）基本原理体外构建的重组DNADNA分子通过显微注射，病毒载体转移，胚胎干细胞转染等方法注入动物的受精卵或床前的胚胎细胞，然后将此受精卵或胚胎细胞植入子宫，使其发育成携带外源基因的转基因动物第8页/共78页第9页/共78页外源目的基因的制备外源目的基因有效导入生殖细胞或胚
5、胎干细胞选择获得携有目的基因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及鉴定筛选所得的转基因动物品系第10页/共78页（二）外源目的基因转入动物的早期胚胎方法1.显微注射法 在光学显微镜下，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。第11页/共78页microinjection经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。目前是创造转基因动物的最有效，最成功的途径第12页/共78页基质附着序列第13页/共78页第14页/共78页通过注射妊娠血清和人绒毛膜促进腺激素的激素疗法使小 鼠
6、超数排卵35个（一般情况下排卵5-10个）交配后，从输卵管内取出受精卵；转基因样品注射入受精卵中变大的雄性原核内将25-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内；受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代；从小鼠子代体内取出DNA样品，进行杂交，鉴定转基因的整合 与否及位子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗 传及表达。DNA显微注射法的基本程序第15页/共78页第16页/共78页第17页/共78页优点：转基因范围广转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何病毒基因组片段，绝对安全。非嵌合体已成功制备转基因的鼠，兔，羊，猪缺点：缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因
7、不表达整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺失等需显微操作仪，技术性要求强。成功率低第18页/共78页l2.2.反转录病毒感染法将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的）获得转基因动物的方法在培育转基因禽类研究中有广泛应用，是目前制备转基因鸡最有效和最成功的方法，主要集中在鸡的良种培育及抗病毒感染研究方面。第19页/共78页第20页/共78页如果在第一次卵裂之前外源DNA整合到胚胎基因组中，可获得转基因动物在第一次卵裂之后整合，会产生嵌合体，其第二代可能出现转基因动物。
8、第21页/共78页（1 1）反转录病毒基因反式作用序列顺式作用序列第22页/共78页（2）反转录病毒感染法的载体的构建复制型缺陷重组病毒载体的构建：只能产生病毒RNA 不编码结构蛋白 提取病毒未整合的环状形式DNA；将环状DNA克隆到适当的载体中；选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除；将外源目的基因克隆到载体中第23页/共78页（3 3）包装细胞 在受体细胞中的重组病毒由于没有包装信号，能生产病病毒RNARNA和所有蛋白质，但不能包装成病毒颗粒；病毒包装细胞：染色体整合除序列的整个病毒基因组，为重组蛋白载体转录的RNARNA提供包装蛋白病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信号将使包装蛋白把载体
9、包装成为侵染生的病毒颗粒。第24页/共78页（4 4）通过物理方法将重组DNADNA分子转入包装细胞利用反转录病毒DNADNA的LTRLTR区域具有转录启动子的特点，外源基因随病毒RNARNA转录，并在载体上 序列的作用下，重组病毒转录的RNARNA和包装细胞提供的包装蛋白就可以组装成有感染性的病毒颗粒病毒收获后感染早期胚胎或直接感染受精卵。或构建好的DNADNA注射入囊胚腔中和重组病毒及辅助病毒共培养进行转染第25页/共78页优点：同时感染大量胚胎整合率高，转基因整合后能稳定地遗传单拷贝整合型不需复杂设备 缺点：外源基因难植入生殖系统，成功率低载量较小，一般只有8 kb，不能插入大片段，缺少
10、邻近的调控元件而影响转基因表达；第26页/共78页l3.胚胎干细胞方法胚胎干细胞（embryonic embryonic stem cellstem cell，ESES）是从早期胚胎内细胞团（ICMICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞。含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。第27页/共78页胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。猪的胚胎干细胞克隆系，牛的胚胎干细胞。第28页/共78页ESES细胞成为个体1.1.将ESES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体转基因动物。第29页/共78页2.2
11、.通过核移植将ESES导入去核的卵母细胞，在子宫种植发育成个体第30页/共78页胚胎干细胞转基因过程第31页/共78页1.ES细胞的建立与维持动物的准备：受精后3.5天的母鼠分离鼠胚。胚胎的分离和初培养：3.5天孕鼠 鼠断颈处死 解剖小鼠取出胚胎 体外培养胚胎 4-6天 后，离散ICM。ICM的离散与ES的分离：分离ICM 酶解细胞团 培养离散细胞 ES细胞集落ES细胞的扩增：离散ES细胞 置四孔培养板中 培养 ES细胞的常规培养：ES细胞由四孔板转至培养皿进 行常规培养第32页/共78页2.ES细胞的基因组操作 将外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不影响ES细胞的各种功能。
12、这就要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对原有基因结构及功能没有影响或影响最小。第33页/共78页与整合位点两端区域同源的两段DNA序列（HB1和HB2）转入的目的基因（TG）编码抗G418的新霉素磷酸转移酶基因（neor）两个不的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2）定点参入第34页/共78页3.转基因ES细胞的筛选正负选择法 正选择法筛选出转基因整合型ES细胞：重组DNA导入ES细胞，在含有G418的培养基中，没有整合外源基因的细胞将全部死亡，只有整合了外源基因的细胞才可以存活下来。负选择法筛选出特异整合型ES细胞：如果非特异性整合发生，则两个tk基因或其中一个基因很大可能
13、与TG和neor一起整合，这时用GCV筛选，tk基因表达的胸苷激酶能反GCV转化成有毒的化合物，使细胞死亡。第35页/共78页第36页/共78页4.转基因ES细胞的检测第37页/共78页5.5.移植将胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宫内，繁育转基因小鼠。第38页/共78页（6）获得纯合的转基因鼠第39页/共78页优点：整合率高同源重组实现定点整合，而非随机整合缺点：不容易建立胚胎干细胞系长期培养，导入外源基因的胚胎干细胞会由于细胞分化使生产的动物成为嵌合体第一代是嵌合体，获得转基因动物的周期较长第40页/共78页4.4.精子载体导入法 将外源将外源DNADNA与破坏细胞膜的精子一起孵育，与破坏细胞膜
14、的精子一起孵育，精精子可捕获外源子可捕获外源DNADNA，并通过，并通过受精过程将外源受精过程将外源DNADNA导入导入受精卵。受精卵。第41页/共78页意大利LavitranoLavitrano等19891989年首次报道利用精子作为载体获得了转基因小鼠。改进的方法是精子头部纤维注射此法不仅可免去复杂而昂贵的设备，且可省去不少繁杂的操作和条件准备。但该法有些结果不稳定，不能重复,外源外源DNADNA分分子可能会受到受精液中内切酶的作用而影响整子可能会受到受精液中内切酶的作用而影响整合后的功能合后的功能需在继续改进第42页/共78页5.5.基因打靶 (gene targeting)(gene
15、targeting)包括基因敲除(Knock-out)(Knock-out)：靶基因被灭活.无功能的外源基因转入细胞与基因组中同源序列进行同源重组，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活.基因敲入(Knock-in):(Knock-in):引入不存在的新基因.将外源有功能的基因转入基因组中不存在或已失活的细胞中与其基因组中同源序列进行同源重组，在细胞内获得表达，基因替代：基因修正(gene repairment)(gene repairment)第43页/共78页基因打靶的必备条件胚胎干细胞(ES细胞)能在体外培养，保留发育的全能性打靶载体Neo（新霉素）阳性筛选标志HSV-t
16、k阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)第44页/共78页第45页/共78页基因敲除的技术路线如下：（1 1）构建重组基因载体（2 2）打靶载体导入ESES细胞：重组置换（3 3）基因敲除ESES细胞注射入胚泡（4 4）胚泡植入假孕小鼠的子宫中（5 5）嵌合体的杂交育种第46页/共78页第47页/共78页第48页/共78页O型载体，序列插入型载体，这类载体与靶基因组同源重组配对，经过一次交换，前者插入后者，它发生单交换而将载体序列插入靶基因内，致使染色体DNA部分重复，可能破坏内在正常基因而发生突变，也可代替原来缺
17、陷基因，纠正遗传特征，使靶基因特异失活。型载体，也称序列取代载体，外来载体DNA和靶细胞染色体DNA同源配对，经过两次交换，前者取代后者，此类载体可与靶序列发生双交换，以外源序列取代靶序列，其基因组大小并无改变。基因打靶载体第49页/共78页第50页/共78页6.YAC(Yeast Artificial 6.YAC(Yeast Artificial Chromosome)Chromosome)人工酵母染色体法transfer transfer large large gene/cluster genegene/cluster gene (100kb):YAC(100kb):YAC具有自主复制序
18、列、克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；可接受1001001000kb1000kb的外源DNADNA片段 avoid DNA damage:YACavoid DNA damage:YAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具；第51页/共78页方方法法显微注射显微注射核移植核移植胚胎干细胞胚胎干细胞逆转录病毒逆转录病毒基因基因敲除敲除精子介导精子介导优优点点外源基因整合外源基因整合效率较高，不效率较高，不需要载体，目需要载体，目的基因的长度的基因的长度可达可达100Kb100Kb转基因效率转基因效率高；预测基高；预测基因表达水平；因表达水平；可以使用定
19、可以使用定点整合技术点整合技术外源外源DNADNA的的整合率高；整合率高；整合在生殖整合在生殖细胞中的比细胞中的比例也很高。例也很高。可在整合点可在整合点整合转移基整合转移基因的单个拷因的单个拷贝；贝；该方法简该方法简单、方便单、方便 缺缺点点精密仪器，精密仪器，技术操作较难，技术操作较难，易造成宿主动易造成宿主动物基因组的插物基因组的插入突变入突变供体细胞易供体细胞易衰老衰老ESES细胞株不细胞株不易建立，长易建立，长期培养后出期培养后出现分化现象；现分化现象；生产的转基生产的转基因动物都是因动物都是嵌合体嵌合体 插入的基因插入的基因有大小限度；有大小限度；嵌合性很高；嵌合性很高；外源外源D
20、NA DNA 在在动物各种组动物各种组织中的分布织中的分布不均不均 应用应用具有具有一定一定局限局限性性有些结果有些结果不能重复不能重复 第52页/共78页三、转基因动物反应器三、转基因动物反应器动物生物反应器（bioreactor）:目的片段在器官或组织中表达的转基因动物生产克药物蛋白质，用细胞基因工程需800-5000美元，而利用转基因动物只需0.02-0.50美元。一种新药从研制到上市通常需要10-15年，而转基因动物乳腺生物反应器，生产周期仅为年左右。第53页/共78页几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便
21、产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了乳腺生物反应器,血液生物反应器和膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。第54页/共78页（一）动物乳腺反应器（一）动物乳腺反应器乳腺生物反应器的研制，就是通过基因转移技术，乳腺生物反应器的研制，就是通过基因转移技术，将外源基因导入动物体内，通过乳腺特异启动子的将外源基因导入动物体内，通过乳腺特异启动子的控制，获得乳腺生产外源蛋白质的转基因动物。控制，获得乳腺生产外源蛋白质的转基因动物。药用蛋白基因 表达细胞株 细胞核供体动物 受精卵 无核受精卵 组装的核细胞 胚胎药用蛋白 乳汁雌性 转基因动物 动物幼崽 假孕动物受体
22、动物第55页/共78页商业要求：商业要求：1g/L1g/L乳腺是外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影乳腺是外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响到转基因动物本身的生理反应，从转基因动物的响到转基因动物本身的生理反应，从转基因动物的乳汁中获取的目的基因产物，不但产量高、易提纯，乳汁中获取的目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，因此又被称为的生物活性，因此又被称为动物乳腺生物反应器动物乳腺生物反应器20062006年年8 8月，欧洲药品估计局（月，欧洲药品估计局（EMEAEMEA）批准了哺乳）批准了
23、哺乳动物细胞乳腺生物反应器（改名为动物细胞乳腺生物反应器（改名为乳腺生物反应器乳腺生物反应器）第56页/共78页1 1、动物乳腺是一个、动物乳腺是一个封闭的系统封闭的系统：表达的蛋白绝大：表达的蛋白绝大部分不会回到血液循环部分不会回到血液循环,避免大量表达的外源蛋避免大量表达的外源蛋白对动物健康的危害。白对动物健康的危害。2 2、乳腺组织是一种、乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器有效的蛋白质合成器。奶牛一。奶牛一年生产乳蛋白年生产乳蛋白250-300kg,250-300kg,山羊生产乳蛋白山羊生产乳蛋白25-25-30kg,30kg,家兔生产乳蛋白也可达到家兔生产乳蛋白也可达到3-5kg3-5k
24、g。3 3、乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确的修饰和、乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确的修饰和后加工，生物学后加工，生物学活性接近天然产品活性接近天然产品。4 4、动物乳腺表达的外源基因可以遗传，获得生产、动物乳腺表达的外源基因可以遗传，获得生产有价值蛋白质的动物个体后有价值蛋白质的动物个体后,可以可以常规繁殖常规繁殖生产群生产群体。体。第57页/共78页8080年代，在鼠的乳腺组织高效表达了人年代，在鼠的乳腺组织高效表达了人AATAAT，开，开创了此研究的先河创了此研究的先河全世界有全世界有20-3020-30家公司致力于开发动物乳腺生物家公司致力于开发动物乳腺生物反应器重组蛋白药物，可进行
25、商业生产的有近反应器重组蛋白药物，可进行商业生产的有近3030种种,包括人包括人AATAAT、EPOEPO、乳铁蛋白、乳铁蛋白、BSABSA、血红蛋白，、血红蛋白，、和抗凝血酶和抗凝血酶、血纤维蛋白原、血纤维蛋白原、tPAtPA等十等十余种稀有药品，临床试验的有余种稀有药品，临床试验的有l0l0余种，研发阶段余种，研发阶段的有上百种的有上百种20062006年年6 6月，由美国月，由美国GenzymeGenzyme公司研制成功的第公司研制成功的第一个转基因动物乳腺生物反应器生产的重组人抗一个转基因动物乳腺生物反应器生产的重组人抗凝血酶凝血酶IIIIII（商品名：（商品名：ATrynATryn）
26、已经获准上市）已经获准上市第58页/共78页第59页/共78页第60页/共78页AATAAT转基因羊，其乳汁中含有a-a-抗胰蛋白酶(AAT)(AAT)，可治疗遗传性肺气肿病。每升羊奶售60006000美元。英国PPLPPL公司与德国拜耳公司生产第61页/共78页第62页/共78页我国乳腺反应器的研制19961996年研制成功的能在乳腺中表达人凝血因子、EPO EPO 的转基因羊19981998年获得了能表达人BSABSA的转基因奶牛20002000年获得了我国首例转有人AATAAT的转基因羊20052005年研制的人乳铁蛋白和人乳清BSABSA转基因奶牛均获得高效表达，含量分别达到3.4g/
27、L3.4g/L和1.5g/L1.5g/L，标志了我国首次获得可商业化生产的动物乳腺生物反应器重组人类蛋白第63页/共78页乳腺产品的缺点post-translational modificationspost-translational modifications1.human protein C human protein C不能正确的形成亚基不能正确的形成亚基2.human antithrombin IIIhuman antithrombin III未能完全的糖基化未能完全的糖基化第64页/共78页转基因高等哺乳动物乳液蛋白糖基化仍有别于人，可能导致抗原性的变化。欧盟人用医学制品委员会（C
28、HMPCHMP）曾对ATrynATryn上市提出过反对意见，理由是临床例数太少。另外，美国GenzymeGenzyme公司重组人酸性-葡萄糖酶（商品名MyozymeMyozyme），原本在转基因兔奶中生产，最终换为CHOCHO细胞生产并获得FDAFDA批准上市 第65页/共78页（二）血液血液生物反应器比较适合生产人血红蛋白、抗体和生产非生物学活性状态的融合蛋白而有活性的蛋白或多肽(如激素、细胞分裂素、组织血纤维溶酶因子等)由于进入了动物血液循环系统而影响动物的健康。到目前为止，已有多种通过转基因动物生产的具有生物学功能的人血红蛋白问世。第66页/共78页大家畜的血液容量较大,利用动物血液生产
29、某些蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物可直接从血清中分离出来,血细胞组分可通过裂解细胞获得。第67页/共78页促红细胞生成素(EPO)(EPO)：以转基因猪生产。这种药物存于转基因猪的血液中。目前转基因猪血球素合成的遗传控制机制已十分清楚，用基因重组技术合成的EPOEPO已在多个国家上市。第68页/共78页（三）尿液动物膀胱生物反应器体液容易收集；动物出生后即可表达；外源蛋白不进入血液循环膀胱尿乳头顶端表面可表达一组尿血小板溶素的膜蛋白,这种蛋白在膀胱中表达具有专一性,而且它的基因是高度保守的,将外源基因插入55端调控序列中,就可以指导外源基因在尿中表达。多用哺乳动物中保守性
30、高的UroplakinUroplakin启动子第69页/共78页（四）精液猪等，精液是体积较大的液体，容易收集可在雄性动物中表达还处于研究状态第70页/共78页（五）鸡蛋在卵黄蛋白和清蛋白中表达人类基因有进一步成为生物反应器的潜能还需进一步解析鸡的基因图谱转基因鸡的蛋清可高水平表达重组药物，但目前尚无任何一个转基因鸡制备的药物被批准，主要问题仍是糖基化问题。第71页/共78页尚待解决的问题转基因动物的成功率较低。目的基因在宿主染色体的整合及其特异性表达问题。产品纯化问题。安全性问题。第72页/共78页第五节 动物细胞工程在制药工业上的应用一、动物细胞大规模生产重组蛋白CHOCHO细胞表达HBs
31、AgHBsAg细胞株：CHO-C28CHO-C28（1919代)细胞培养：转瓶培养，DEMEDEME培养基纯化：盐析，离心，层析检测第73页/共78页二、转基因动物生产药物EPOEPO的生产EPOEPO为糖蛋白，由肾脏产生，刺激造血细胞分化，保持外周血红细胞水平，用于治疗贫血 1.1.材料：pEPOpEPO质粒，pWAP(pWAP(乳清蛋白），pWAP3pWAP3（乳清蛋白基因3 3非翻译区UTRUTR）2.2.构建表达载体：乳腺特异性表达载体 pWAP-EPO-WAP3pWAP-EPO-WAP33.3.导入大鼠乳腺：脂质体与质粒混合物注射入乳腺4.4.表达：ELISAELISA检测乳汁中表达
32、第74页/共78页三、转基因动物作为药物筛选模型三、转基因动物作为药物筛选模型转基因动物可建立敏感动物系以及人类相同疾病的动物模型用于药物筛选，避免了传统的动物模型与人类相似的疾病致病原因、机理不尽相同的缺点，其结果准确、经济，试验次数少，试验时间大大缩短，现已成为人们试图进行药物“快速筛选”的一种手段目前，已经培育出较多的转基因动物用于药物筛选研究，并已在抗肿瘤药物、抗艾滋病病毒药物、抗肝炎病毒药物、肾脏疾病药物的筛选中取得突破性进展。第75页/共78页转基因动物是当今分子药理学研究的重要手段，是作为疾病模型用于药物筛选的一种重要工具。但仍存在选择的实验动物的种族差异、性别不均衡、转基因产物不一定能长期表达、目的基因能否准确地定位于等位基因上等技术问题第76页/共78页近期主要研究和改进方向改进表达载体，提高表达水平和产量利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本抑制细胞凋亡，延长培养周期采用糖基化工程，提高产品质量转基因动物的研究组织工程的研究第77页/共78页感谢您的观看！第78页/共78页