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1、动物细胞工程制药技术动物细胞工程制药技术摘要生物制药产业以基因工程、抗体工程、细胞工程为主要代表。文 章主要表达动物细胞工程技术。动物细胞工程制药是动物细胞工程技 术在制药行业方面的应用。当前动物细胞工程所涉及的主要技术领域 包括细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术和细胞大量培育技术等方面。关键词：动物细胞工程制药细胞融合细胞大规模培育核移植1、动物细胞工程制药技术1、1.细胞融合细胞融合指在诱导剂或促融剂作用下，两个或两个以上的异源细 胞或原生质体相互接触，进而发融合并形成杂种细胞的现象。细胞融 合技术作为细胞工程的核心根底技术之一，不仅在农业、工业的应
2、用 领域不断扩大，而且在医药领域也取得了开创性的争论成果，如单克 隆抗体、疫苗等生物制品的生产。在动物体细胞融合技术的根底上Kohler G 和 Milstein C 将能产生特异性抗体的原代 B 淋巴细胞与肿瘤细胞进展融合，创立了单克隆抗体制备的方法。国内外已培育出了许 多具有很高有用价值的杂交瘤细胞株系，它们能分泌用于疾病诊断和 治疗的单克隆抗体，如甲肝病毒、抗人 I g M 、抗人肝癌和肺癌、抗M-CSFRMacrophage Colony-Stimulat-ing Factor Receptor，巨噬细胞集落刺激因子受体胞外区的单克隆抗体等。目前单克隆抗体 技术已趋成熟，很多产品已经进
3、入产业化的生产阶段。此外利用细胞融合技术可以生产各种免疫疫苗，肿瘤细胞 / 树突状细胞融合疫苗是近年来国内外恶性肿瘤免疫治疗争论的热点, 在各种动物模型及病人身上观看到肿瘤的消退。Avigan 等将乳腺癌或肾癌病人的自体癌细胞与树突状细胞在含有人粒 - 巨噬细胞集落刺激因子、白介素 - 4 的自体血清中培育，参加聚乙二醇使两种细胞产生融合, 融合细胞疫苗能使肿瘤消退，显示其在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。1、2.转基因动物利用转基因动物乳腺反响器生产药用或食品蛋白是生物制药领域 近年来争论的热点之一。由于乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体 内循环，不会影响到转基因动物本身的生理反响，从转基因
4、动物的乳 汁中猎取的目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白经 过了充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，因此又被称为动物乳腺 生物反响器，所以用乳腺表达人类所需蛋白基因的羊、牛等产量高的 动物就相当于一座药物工厂。20 世纪 80 年月中期，英国科学家克拉克首先在鼠的乳腺组织高效表达了人抗胰蛋白酶因子基因，开创了研 制动物乳房生物反响器的先河。据美国遗传学会推测，到2023 年，全部基因工程药物中利用动物乳房生物反响器生产的份额将高达 95。国外现已有数十家以动物乳腺反响器为核心技术的公司，可生产 1 抗胰蛋白酶、人红细胞生成素、乳铁蛋白、人血清白蛋白、人血红蛋白及人凝血因子 、和抗凝
5、血酶、血纤维蛋白原、t P A 等十余种稀有药品，但只有为数极少的几种药用蛋白上市。2023 年 6 月， 由美国Genzyme 转基因公司研制成功的世界上第一个利用转基因动物乳腺生物反响器生产的基因工程蛋白药物棗重组人抗凝血酶商品名： ATryn 牋已经获准上市。我国自 1998 年在国家“863 ”打算中将“转基因动物乳腺生物反响器”作为重大争论工程以来，也取得了一些较好的成绩。1996 年研制成功的能在乳腺中表达人凝血因子、EPO 的转基因羊；1 998 年曾溢滔等获得了能表达人血清白蛋白的转基因奶牛; 2 0 0 0 年中国农业大学与北京兴绿原生物技术中心合作，成功获得了我国首例转有人
6、 a l 一抗胰蛋白酶基因的转基因羊 1131；2023 年中国农业大学和北京济普霖生物技术联合研制的人乳铁蛋白和人乳清白蛋白转基 因奶牛均获得高效表达，含量分别到达 3.4 克 / 升和 1.5 克 / 升，标志了我国首次获得可商业化生产的动物乳腺生物反响器重组人类蛋白。目前科学家们正在加紧开展重组蛋白纯化、临床前试验和临床试验等争论，力争早日实现我国动物乳腺生物反响器制药技术产业化。1、3.细胞核移植技术细胞核移植技术，是指将一个动物细胞的细胞核移植至去核的卵 母细胞中，产生与供细胞核动物的遗传成份一样的动物的技术。科学 家们已经先后在绵羊、小鼠、牛、猪、山羊等动物上获得胚胎细胞核 移植后
7、代，目前，体细胞克隆也在牛、山羊、小鼠等物种上均获得了 成功。假设将转基因与细胞核移植技术获得的克隆动物工厂相结合，在 生物制药方面具有巨大的潜在应用价值。 1998 年，Rohl 等用非静息期胎儿或纤维细胞成功克隆出 3 只安康、同类的携带外源标记基因的转基因克隆。Schnieke 等用此法成功克隆出 3 只携带有人凝血因子 X 基因转染绵羊早期胎儿成纤维细胞，以该细胞系为供体移植到去核卵母细胞中，经过电和化学刺激后，将卵母细胞植入假孕母绵羊体内 发育，获得这 3 只绵羊，这 3 只绵羊能高水平地表达人凝血因子 X125 g/ml 。Cibelli 等同样也获得 3 头转基因牛。这些争论展现
8、了转基因克隆动物技术的可能性，为细胞工程制药带来了光明前景。1、4.动物细胞大规模培育动物细胞的大规模高效培育技术是生物制药的关键技术，通过动物细胞培育生产生物产品已成为全球生物工业的主要支柱。目前动物细胞培育生产较多的生物制剂是蛋白和抗体，通常承受中国仓鼠的卵巢细胞，事先将能产生某种蛋白质药品的基因片段与仓鼠卵巢细胞的 D N A 融合再在培育液中大量培育它们、最终得到所需药品。与微生物发酵法比，虽然产量相对 较低。但设备费用节约得多，如属于小品种、小产品类生物工程产品， 可承受此法。目前用于动物细胞体外培育的生物反响器有机械搅拌式、气升式、中空纤维式、回转生物反响器等。国外占主流优势的是搅
9、拌式生物反 应器悬浮培育，为提高细胞的产率，可承受流加或灌注培育及微载体 培育等相关技术。美国 Genentech 公司使用 CHO 细胞以 12,000L 搅拌式生物反响器培育槽生产 t - P A 重组蛋白以及治疗癌症的生物药物。美国 G i b c o 公司建立的流加悬浮培育 rCHO 表达 r Gal 系统，承受化学修饰的无蛋白 C H O 细胞培育基并增加 T C A 循环，生物反响器中活细胞密度最高可达107cell/ml。国内第四军医大学承受5L CelliGen 反响器连续灌注培育杂交瘤细胞，培育第 9 天细胞密度到达8 106cells/ml 以上 17。目前国内未见有万升级
10、的生物反响器用于生产的报道，同时我国有关商品化大规模动物细胞反响器产品还处于 空白，有待于进一步改进现有生物反响器设计或设计型的生物反响 器。2、制造实例如今，利用动物细胞生产的生物制品已日益增多。美国自1996 年以来批准的 33 个产品中有 25 个是用动物细胞生产的。下面就几个在动物细胞工程制药的进展史上具有重要意义的产品进展介绍。2、1 类淋巴细胞干扰素类淋巴细胞干扰素是由一株从Burkitt 淋巴瘤的患者猎取Namalva 细胞生产的干扰素，它含 80%左右的 IFN-，20%左右的 IFN-。该干扰素首先由英国的 Wellcome 公司的 Fante 和 Finter 等开发成功，
11、 并扩大至 8000L 罐生产。该产品 1986 年先在英国获准进入市场，商品名为“Wellferon”。1999 年 Wellferon 获美国 FDA 批准进入美国。该干扰素获准生产在动物细胞进展技术史上是一个很重要的里程碑，由于这是第一个获准用肿瘤细胞系生产的人用药品。类淋巴细胞干扰素的生产工艺大致如下：先将细胞逐级放大直至4000L 或 8000L 罐，培育基用RPMI1640 培育基，加10%小牛血清。培育方式主要是搅拌式批次培育，当细胞密度达 1106/ml 时，参加2nmol/L 丁酸钠起动 48h，接着用仙台病毒 50HAU/ml诱生，18h 后冷却至 510 ，收集培育液，连
12、续离心分别细胞，对上清液进展分别纯化。类淋巴细胞干扰素已被广泛应用于临床治疗多种病毒性疾病，如乙型肝炎、丙型肝炎，以及多种肿瘤病的治疗，如毛细血管白血病、Kaposi 肉瘤等。2、2 组织型纤溶酶原激活剂据不完全统计，各种血栓病已成为很多国家人口死亡和致残的第 一位缘由。我国患各种血栓病的患者估量在1300 万以上。对于血栓病的治疗方法多种多样，但目前主要的疗法仍是溶血栓法。组织型纤溶 酶原激活剂做为其次代特异性的溶栓药于 1987 年被 FDA 批准上市。它是由美国 Genetich 公司用 CHO 细胞表达的，也是第一个用动物细胞大规模培育生产的基因工程产品。2、3 尿激酶原作为其次代的又
13、一个特异性的溶栓药，单链尿型纤溶酶原激活剂尿激酶原目前在很多国家进展临床期试验，估量不久即可上市。 在国内，南京大学是用大肠杆菌表达的，而军事科学院生物工程争论 所则是用 CHO 细胞表达的，目前正和天津天士力公司一起进展试验。尿激酶原是一种碱性蛋白，具有特异的溶血栓作用，具有很好的进展前景。2、4 促红细胞生成素促红细胞生成素，又称血细胞生成素、红细胞刺激因子，是一种酸性糖蛋白，是第一个被觉察并批准应用于临床的造血生长因子，也是迄今为止产值最高的基因工程产品。它主要用于多种贫血，包括慢性肾衰性贫血、恶性肿瘤放疗和化疗引起的贫血等。由于该药的用量很小，因此有的单位仍承受传统的转瓶生产工艺。也有
14、单位为了到达高产目的，承受了固定化灌流培育的生产工艺。2、5 凝血因子由先天性缺乏凝血因子而引起的出血称为甲型血友病，早期治 疗承受输入全血或血浆，但由于血浆内凝血因子的浓度很低，因此 效果不抱负。20 世纪 80 年月以后，承受单克隆抗体亲和层析，使产品的纯度进一步提高。尤其是由于争论成功了一系列血浆的病毒灭菌法后，使由血浆制备的“极纯”产品，如 Monoclate 等始终沿用至今。2、6 乙型肝炎疫苗乙型肝炎是由乙肝病毒引起的，约占全部病毒性肝炎的 40%，它可以急性发病也可以形成慢性肝炎，并进而引发肝硬化、肝癌，而其 中很大的一局部人是安康的病毒携带者，不消灭病症，但外表抗原阳性，常常是
15、重要的传染源。在我国，这样的慢性病毒携带者约有一亿人，是对公共卫生的一个重要威逼。至今已被批准的乙肝工程疫苗有两种宿主细胞的，一种是酵母表 达的，另一种是CHO 细胞表达的。我国病毒争论所的任贵方等在1987 年就争论成功了用 CHO 细胞表达的疫苗。他们用的是 NBS 公司生产的微载体篮式生物反响器连续灌注培育CHO 细胞，然后以14000r/min 连续离心去除细胞残骸提取上清， 再经 Butyl S Sepharose Fast Flow 疏水柱层析 Sephadex G 25 脱盐 DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换柱层析Sepharose 4 Fast Fl
16、ow 凝胶过滤，即可得纯品。结论文章主要表达了细胞融合、转基因动物、细胞核移植技术、动物 细胞大规模培育等动物细胞工程制药技术，又介绍了几个细胞工程制 药的实例。我国动物细胞工程制药目前仍处于起步阶段，与欧美国家 相比还有很大差距，虽然目前可生产多种有重要价值的蛋白质生物制 品，如病、干扰素、单克隆抗体等，但大局部还处于试验和临 床阶段。作为现代生物技术之一的细胞工程技术在近半个世纪来突飞 猛进,并已在医药领域取得了很多具有开创性的争论成果,如通过细胞融合技术形成的杂交瘤细胞生产的单克隆抗体已广泛用于临床治疗, 并显示出独特的疗效, 获得了很好的社会和经济效益。随着细胞工程技术争论的不断深入,它的前景及其产生的影响将会日益地显示出来。注：可编辑下载，假设有不当之处，请指正，感谢!