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1、动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体技术单克隆抗体技术核移植核移植动物动物细胞细胞工程工程常用常用技术技术其它动物细胞工程的基础其它动物细胞工程的基础第1页/共56页本节内容：本节内容：第2页/共56页一、动物细胞培养的应用和概念一、动物细胞培养的应用和概念1 1、概念：、概念：动物细动物细胞培养就是从动物胞培养就是从动物有机体中取出相关有机体中取出相关的的组织组织,将它分散将它分散成成单个细胞单个细胞,然后然后,放在适宜的放在适宜的培养基培养基中中,让这些让这些细胞生细胞生长和增殖长和增殖。2、原理：、原理：细胞增殖细胞增殖第3页/共56页定义：定义：人们通常将人们通常
2、将动物组织动物组织消化后消化后的的初次培养初次培养称为原代称为原代培养。培养。胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理取出组织取出组织胚胎或幼龄动物器官组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎剪碎分散成单个细胞分散成单个细胞细胞悬液细胞悬液转入培养瓶内培养转入培养瓶内培养（贴壁生长贴壁生长长成长成单层细胞单层细胞。有有接触抑制接触抑制现象）现象）。原代培养原代培养3 3、过程、过程图示图示原代培养原代培养第4页/共56页强调一：细胞贴壁过程强调一：细胞贴壁过程细胞贴壁：细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。附在瓶壁上，称为细胞贴壁。培养瓶或培养皿壁要求：培养
3、瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于表面光滑、无毒、易于贴附。贴附。第5页/共56页当贴壁细胞分裂生当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。细胞的接触抑制。强调二：接触抑制强调二：接触抑制第6页/共56页 定义：定义：当原代培养的细胞处于当原代培养的细胞处于接触抑制后接触抑制后,用用胰蛋白酶胰蛋白酶处理处理,使细胞从瓶壁上使细胞从瓶壁上脱离脱离下来下来,然后加入新的培养液然后加入新的培养液,将将细胞分离稀释细胞分离稀释,并并从原培养瓶内转接到新的从原培养瓶内转接到新的培养瓶内培养瓶内,这个过程称
4、这个过程称传代培养传代培养.（分瓶培养的过程分瓶培养的过程）传代培养传代培养第7页/共56页细胞株：传代细胞一般能传到细胞株：传代细胞一般能传到40-5040-50代，代，遗传物质一般不会发生改变遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。，叫细胞株。强调：细胞系、细胞株（强调：细胞系、细胞株（了解即可，老课本体系了解即可，老课本体系）细胞系：传代细胞系：传代5050代以后不能再传下去，代以后不能再传下去，部分细胞部分细胞遗传物质发生了改变遗传物质发生了改变，能连续传，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。代，获得不死性，叫细胞系。第8页/共56页3 3、总结：动物细胞、总结：动物细胞培养过程培养过程动物
5、胚胎或幼龄动物的动物胚胎或幼龄动物的组织、器官组织、器官配置细胞悬液配置细胞悬液剪碎用胰蛋白酶处理剪碎用胰蛋白酶处理1010代细胞代细胞转入培养瓶转入培养瓶40-5040-50代细胞代细胞传传代代培培养养无限传代无限传代分散成单个细胞分散成单个细胞加培养液稀释加培养液稀释传代传代1010代以内，代以内，遗传物质不改变，遗传物质不改变，保持保持正常正常二倍体核型二倍体核型。传代传代10-5010-50代左右，增长缓慢以代左右，增长缓慢以至于完全停止，至于完全停止，部分细胞核型可部分细胞核型可能发生变化能发生变化（遗传物质可能改变（遗传物质可能改变）为什么用胰蛋白酶处理？为什么用胰蛋白酶处理？分瓶
6、分瓶培养培养原代培养特点：原代培养特点：细胞贴壁、细胞贴壁、接触抑制接触抑制继续传代培养少部分细胞继续传代培养少部分细胞获得不获得不死性死性，细胞突变细胞突变，遗传物质已经遗传物质已经改变改变，等同于癌细胞等同于癌细胞。细细胞胞株株：一一般般说说遗遗传传物物质质未未改改变变细细胞胞系系：遗遗传传物物质质已已改改变变原原代代培培养养第9页/共56页4.4.动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件:1 1）无菌无毒）无菌无毒 的环境：的环境：适宜的温度：适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为人和哺乳动物细胞最适温度为0.5。适宜的酸碱度：适宜的酸碱度：PH：液体合成培养基：液体合成培养基：糖、氨基酸、
7、促生长因糖、氨基酸、促生长因子、水、无机盐、微量元素子、水、无机盐、微量元素等；通常还等；通常还需加入需加入血浆、血清等血浆、血清等天然成分。天然成分。4 4）气体环境：）气体环境：2 2）营养：）营养：3 3）温度和）温度和pHpH：“95空气空气+5CO2”的混合气体培养箱。的混合气体培养箱。氧氧气是细胞代谢必须的；气是细胞代谢必须的；CO2维持培养维持培养液的液的PHPH。对培养液和所有培养用具对培养液和所有培养用具无菌处理；无菌处理；培养液培养液中中添加抗生素添加抗生素防止培养过程中污染；防止培养过程中污染；定期更定期更换培养液换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞以清除代谢产物，防止
8、对培养细胞造成危害。造成危害。第10页/共56页问题问题3 3：为什么用胰蛋白酶处理？：为什么用胰蛋白酶处理？问题问题1 1、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官、组织做动物细胞、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官、组织做动物细胞培养材料？培养材料？因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。问题问题2 2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，动物组织细胞间隙中含有
9、一定量的弹性纤维等蛋白质，胰胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。问题问题4 4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最适动物细胞培养的最适PH值为，胰蛋白酶作用的适宜值为，胰蛋白酶作用的适宜PH为，为，胃蛋白酶适宜胃蛋白酶适宜PH为为2，胃蛋白酶在，胃蛋白酶在PH为的动物细胞培养为的动物细胞培养中无活性。中无活性。问题问题5 5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消
10、化掉吗？控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。第11页/共56页问题问题6 6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？组培培养基有何独特之处？问题问题7 7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？培养成新个体？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：生素和动物血清等。独特之处有：1 1、液体培养基、液体培养基 2 2、成分中有动物血清等。、成分中有
11、动物血清等。不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体。育成新的动物个体。问题问题8 8、动物细胞培养的原理：、动物细胞培养的原理：细胞增殖。细胞增殖。问题问题9 9、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在1010代以代以内，为什么？内，为什么？1010代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。第12页/共56页5 5、动物细胞培养技术的应用、动物细胞培养技术的应用:1 1、蛋白质生物制品的生产、蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆
12、抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2 2、应用于基因工程、应用于基因工程 主要用于作为受体细胞主要用于作为受体细胞3 3、检测有毒物质，判断某种物质的毒性、检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4 4、细胞的生理、药理、病理研究、细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物如用于筛选抗癌药物 第13页/共56页植物组织培养和动物细胞培养的比较：植物组织培养和动物细胞培养的比较：比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖培养基性质培养基性质固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基培养基特有成分培养基特有成分蔗糖、植物激素蔗糖、植
13、物激素葡萄糖葡萄糖 促促-动物血清动物血清培养结果培养结果植物体植物体细胞株、细胞系细胞株、细胞系培养目的培养目的快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株无病毒植株获得细胞或细胞获得细胞或细胞分泌蛋白分泌蛋白取材取材植物幼嫩部分或植物幼嫩部分或花药花药胚胎或幼龄动物胚胎或幼龄动物的器官或组织的器官或组织其他条件其他条件无菌无毒，适宜无菌无毒，适宜条件条件无菌无毒，适宜无菌无毒，适宜条件条件第14页/共56页二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、定义：定义：动物核移植是将动物的动物核移植是将动物的一个细胞一个细胞的细胞核的细胞核,移入一个已经移入一个已经去掉细胞核
14、的卵母去掉细胞核的卵母细胞中细胞中，使其重组并发育成一个，使其重组并发育成一个新的胚胎新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为这个新的胚胎最终发育为动物个体动物个体。3、分类：分类：胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程胚胎细胞分化程度低，恢复其全度低，恢复其全能性相对容易。能性相对容易。动物体细胞分化动物体细胞分化程度高，恢复其程度高，恢复其全能性十分困难全能性十分困难2、原理：原理：动物细胞核具有全能性动物细胞核具有全能性第15页/共56页4、体细胞核移植过程、体细胞核移植过程示动物克隆示动物克隆无性繁殖无性繁殖1）克隆羊多利培育过程：黑面绵羊去核卵母细胞白面绵羊乳腺细
15、胞核细胞核移植细胞核移植重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期重组胚胎胚胎移植胚胎移植另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利特别注意：特别注意：克隆动物性状克隆动物性状与供体动物完全一样吗？与供体动物完全一样吗？不可能！不可能！因为：因为：一、供体动物只提供细胞核，一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如而细胞质中的遗传物质（如线粒体线粒体DNA）来自于受体卵）来自于受体卵母细胞。母细胞。二、生物的性状不仅与遗传二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。物质有关，还受环境的影响。供体供体受体受体代孕代孕受体受体第16页/共56页黑面绵羊去核卵母细胞白面绵羊乳腺细胞核a重组细
16、胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期重组胚胎b另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利1 1、写出、写出abab所代表细胞工程名称：所代表细胞工程名称：a a表示：表示：b b表示表示:2 2、实施细胞工程时，所需、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞受体细胞大多采用卵母细胞的原因：的原因：体积大，易操作。含有促使细胞核体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。表达全能性的物质和营养条件。3 3、多利面部毛色是：、多利面部毛色是：根据遗传学原理说明判断依据。根据遗传学原理说明判断依据。4 4、若黑面绵羊的基因型为、若黑面绵羊的基因型为AA,AA,白白面绵羊的基因型为面绵羊的
17、基因型为aaaa，则克隆羊，则克隆羊的基因型为的基因型为 核移植核移植胚胎移植胚胎移植白色白色多利全部的核基因都来自白面绵羊多利全部的核基因都来自白面绵羊aa第17页/共56页 取供体细胞取供体细胞传代培养传代培养1010代代以内的细胞以内的细胞.为什么？为什么？用的是去用的是去核的减数核的减数第二次分第二次分裂中期细裂中期细胞（胞（M中中期期）为什）为什么？么？激活方法：激活方法：激活目的：激活目的：促融方法：促融方法：电刺激电刺激胚胎移植至胚胎移植至代孕受体内代孕受体内 妊娠、分娩妊娠、分娩2）核移植流程）核移植流程供体：优质高产奶牛供体：优质高产奶牛受体：普通奶牛（卵受体：普通奶牛（卵母
18、细胞的采集与培养）母细胞的采集与培养）1.体积大，易体积大，易操作。操作。2.含有含有促使细胞核表促使细胞核表达全能性的物达全能性的物质和营养条件。质和营养条件。有人说它三个母有人说它三个母亲，对吗？亲，对吗？第18页/共56页核移植流程核移植流程:1、供体细胞的采集与培养、供体细胞的采集与培养5、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减数分裂进程。数分裂进程。6、电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建、电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。重组胚胎。4、将供体细胞注入去核卵母细胞、将供体细胞注入去核卵母细胞3、显微操作去除卵母细胞中的核
19、、显微操作去除卵母细胞中的核2、受体卵母细胞的采集与体外培养、受体卵母细胞的采集与体外培养7、胚胎移植入代孕母牛体内、胚胎移植入代孕母牛体内8、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。第19页/共56页4 4、体细胞核移植技术的应用前景、体细胞核移植技术的应用前景第20页/共56页广而告之：你还在为身体有残疾而苦恼吗？你还在为器官移植找不到合适的工体而焦虑吗？你能再这样下去了，看看我们的体细胞核移植技术吧，只需要从你身上取出一个小小的体细胞，通过核移植培养出胚胎干细胞，再用胚胎干细胞诱导分化出各种组织器官，这样的器官的组织相容性抗原跟你的一模一样，用这样的
20、器官进行器官移植，根本不会发生免疫排斥。不夸张的说，如果这项技术研究成熟了，以后大家换条胳膊换条腿就跟给汽车换个轮胎一样。你听明白了吗？这不是天方夜谭，巨大的前景就在眼前，你还在等什么呢？赶紧加入到生命科学的研究中来吧！第21页/共56页第22页/共56页5.体细胞核移植技术存在的问题看书看书P49-50页页第23页/共56页第24页/共56页动物细胞融合 回忆已学知识，你是否已经见到过动物细胞融合的实例？人鼠细胞融合实验第25页/共56页1 1、定义：、定义：也称细胞杂交，是也称细胞杂交，是指用自然或人工方法使两指用自然或人工方法使两个或多个不同的细胞融合个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过
21、程。成一个细胞的过程。一、动物细胞融合一、动物细胞融合杂交细胞：杂交细胞：融合后形成的具融合后形成的具有原来有原来两个或多个细胞遗传两个或多个细胞遗传信息信息的的单核细胞单核细胞成为杂交细成为杂交细胞胞。第26页/共56页 基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体。来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体。同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。第27页/共56页 细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用第28页/共56页动物细胞融合第29页/共56页2、诱导融合的因素诱导
22、融合的因素生物法：生物法：灭活的病毒灭活的病毒诱导融诱导融合合.(.(利用利用灭活仙台病毒灭活仙台病毒是动物细是动物细胞融合所特有的。胞融合所特有的。这是由于病这是由于病毒的磷脂外壳与动物细胞的膜十毒的磷脂外壳与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某分相似的缘故。病毒外壳上的某些些糖蛋白糖蛋白可能还有促进细胞融合可能还有促进细胞融合的功能。的功能。)化学法：化学法：聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)诱诱导融合导融合.物理法：物理法：电激电激融合融合病毒颗粒黏病毒颗粒黏 附细胞表面附细胞表面细胞膜连接细胞膜连接细胞膜被细胞膜被 病毒颗粒穿通病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞细胞融合、形成杂
23、种细胞第30页/共56页思考讨论：思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？病毒需要灭活？不灭活行吗？因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。第31页/共56页3 3、动物细胞融合技术的应用、动物细胞融合技术的应用细胞融合技术突破了细胞融合技术突破了有性杂交有性杂交的局限，使的局限，使远缘杂交远缘杂交成为可能。成为可能。利用利用杂交瘤技术，
24、杂交瘤技术，制备制备单克隆抗体。单克隆抗体。第32页/共56页植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合理论基础理论基础融合前处理融合前处理诱导方法诱导方法结果结果应用应用相同点相同点制备单克隆抗体培育新品种杂交细胞杂交植株突破了远缘杂交不亲和的障碍，打破了生殖隔离电激、振动、离心、聚乙二醇纤维素酶、果胶酶胰蛋白酶(或胶原蛋白酶）细胞膜的流动性细胞膜的流动性、细胞的全能性电激、灭活的病毒、聚乙二醇融合的原理相同，诱导方法相似植物细胞杂交与动物细胞融合的比较植物细胞杂交与动物细胞融合的比较植物细胞杂交与动物细胞融合的比较植物细胞杂交与动物细胞融合的比较第33页/共56页人们获得抗体的传
25、统方法是人们获得抗体的传统方法是?将抗原注入动物体将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体然后从动物血清中提取抗体这种方法的缺点是什么这种方法的缺点是什么?效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。能否用单个能否用单个B B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？B B淋巴细胞在体外不能无限增殖。淋巴细胞在体外不能无限增殖。二：动物细胞融合的成功应用二：动物细胞融合的成功应用二：动物细胞融合的成功应用二：动物细胞融合的成功应用 单克隆抗体的
26、制备单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备思考思考第34页/共56页抗原吞噬细胞摄取处理T细胞暴露、呈递暴露、呈递B细胞直直接接刺刺激激浆细胞增殖、分化增殖、分化抗体产生产生从动物血清中分离淋巴因子淋巴因子获取抗体的传统方法 该方法的缺点是？第35页/共56页传统获得抗体方法的缺点：产量低，纯度低，特异性差如何获得大量的、特异性强的抗体？利用动物细胞培养技术克隆单一的经免疫的B细胞这就是“单克隆抗体”第36页/共56页单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备极富创造性的方案极富创造性的方案 将能够产生特定抗体的将能够产生特定抗体的B B淋巴细胞淋巴细胞和具有无限增殖和具有无限增殖能力的能力的
27、骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。米尔斯坦米尔斯坦(阿根廷阿根廷)和科勒和科勒(德国德国)因此在因此在19841984年获诺年获诺贝尔奖。贝尔奖。第37页/共56页1.如何取得B淋巴细胞？2.把B淋巴细胞与骨髓瘤细胞放在一起，有几种融合方式？3.如何筛选出所需的细胞?4.细胞培养有几种方式?5.如
28、何提取单克隆抗体？制备过程提示:第38页/共56页制备单克隆抗体制备单克隆抗体2.单克隆抗体制备的原理每一个每一个每一个每一个 只分泌一种特异性抗体。只分泌一种特异性抗体。只分泌一种特异性抗体。只分泌一种特异性抗体。具有无限增殖的特性。具有无限增殖的特性。具有无限增殖的特性。具有无限增殖的特性。技术将两种细胞融合获得杂交瘤细胞。技术将两种细胞融合获得杂交瘤细胞。技术将两种细胞融合获得杂交瘤细胞。技术将两种细胞融合获得杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能杂交瘤细胞既能杂交瘤细胞既能杂交瘤细胞既能 ，又能产生足够数量的，又能产生足够数量的，又能产生足够数量的，又能产生足够数量的 。利用利用利用利用 技术大量
29、培养杂交瘤细胞。技术大量培养杂交瘤细胞。技术大量培养杂交瘤细胞。技术大量培养杂交瘤细胞。B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞动物细胞融合动物细胞融合动物细胞融合动物细胞融合动物细胞培养动物细胞培养动物细胞培养动物细胞培养大量增殖大量增殖大量增殖大量增殖特定抗体特定抗体特定抗体特定抗体第39页/共56页单克隆抗体制备过程注射特定抗原骨髓瘤细胞在具有筛选作用的培养基上培养体外培养注射到小鼠腹腔免疫的B淋巴细胞（浆细胞）细胞培养诱导融合杂交瘤细胞专一抗体检验专一抗体检验阳性细胞克隆细胞单克隆抗体第一次筛选第二次筛选第40页/共56页BMMBMBMBB
30、MM筛选1融合体外培养体内培养注射入小鼠体内培养抗原培养瓶中筛选2小鼠动物细胞培养骨髓瘤细胞单克隆抗体抗原免疫处理动物细胞融合筛选动物细胞培养提取第41页/共56页 例：已知细胞增殖时合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将两种细胞在培养液中混合，加聚乙二醇促融，在培养液中有 种细胞。加入氨基喋呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的 及其彼此融合的细胞不能增殖。人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交细胞中可利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖。从培养液中分离出杂交细胞。如何
31、筛选出培养液中的杂交瘤细胞？如何筛选出培养液中的杂交瘤细胞？5骨髓瘤细胞第42页/共56页多孔细胞培养板有限稀释法 将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞群。如何筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞？如何筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞？第43页/共56页动物特异性免疫动物特异性免疫分离分离B淋巴细胞（淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意）。注意B淋淋巴细胞是一个系列。（巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,-Bn）细胞融合细胞融合三种融合方式三种融合方式:（BB;BG;GG）第一次筛选：在第
32、一次筛选：在“选择培养基培养选择培养基培养”上培养筛选上培养筛选杂交瘤细杂交瘤细胞胞（只有（只有BG杂交瘤细胞存活。但杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个杂交瘤细胞也是一个系列：如系列：如B1G,B2G-BnG。而。而BB,GG在此培养基上不能在此培养基上不能存活。）存活。）第二次筛选：在第二次筛选：在“多孔培养板上多孔培养板上”培养培养杂交瘤细胞系列杂交瘤细胞系列 ，每孔只放一个杂交瘤细胞。每孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养克隆化培养”每个杂交瘤细每个杂交瘤细胞，并进行胞，并进行“单一抗体检测单一抗体检测”，“检测阳性检测阳性”的孔内即是的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。所需要的杂交瘤细胞
33、。选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养体外培养或注射到或注射到小鼠小鼠腹腔内增殖腹腔内增殖。提取单克隆抗体。提取单克隆抗体。1、单抗的制备过程要点：、单抗的制备过程要点：第44页/共56页3 3 3 3）、为何要进行两次筛选？）、为何要进行两次筛选？）、为何要进行两次筛选？）、为何要进行两次筛选？4 4）、如何进行第）、如何进行第2 2次筛选？次筛选？培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。第第1 1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2 2次筛选得次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞
34、群。到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。问题强化：问题强化：1 1）、本过程利用了哪些原理？）、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2 2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B B细胞融合？细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有不仅具有B B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体本领，因而可以获得大量单克隆抗体第45页/共56页单克隆抗体的特点单克隆抗体的特点
35、项目项目合成分泌细胞合成分泌细胞提取途径提取途径功能特性功能特性生产特点生产特点传统抗体传统抗体体内的多种体内的多种B B淋巴细胞淋巴细胞从血清中从血清中种类多样，种类多样，特异性差特异性差纯度低，纯度低，产量低产量低单克隆抗体单克隆抗体体外培养或移体外培养或移植到小鼠腹腔植到小鼠腹腔培养的单一杂培养的单一杂交瘤细胞产生交瘤细胞产生的细胞群的细胞群从杂交瘤从杂交瘤细胞的培细胞的培养液或小养液或小鼠腹腔的鼠腹腔的腹水中腹水中种类单一，特异性强纯度高，产量高第46页/共56页1、作为诊断试剂作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等体内肿瘤的定位等,
36、与常规抗体相比与常规抗体相比,具有具有准确、高效、准确、高效、简易、快速简易、快速特点特点.2、用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物：主要用于癌症治疗。优点：疗效高，毒副作用小。主要用于癌症治疗。优点：疗效高，毒副作用小。生物导弹：生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素放射性同位素+化化学药物或细胞毒素学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向作用。准确。（单克隆抗体：导向作用。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）2 2、单克隆抗体的优点：、单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，可大量制备。特异性强，灵敏度高，可大量制备。3 3
37、3 3、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用第47页/共56页一种诱导细胞融合的新方法一种诱导细胞融合的新方法一种新细胞一种新细胞灭活病毒灭活病毒杂交瘤细胞杂交瘤细胞一个优势一个优势单克隆抗体特异性强、单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势灵敏度高的优势第48页/共56页例题例题例题例题1 1 1 1：1975197519751975年，英国剑桥大学分子生物学年，英国剑桥大学分子生物学年，英国剑桥大学分子生物学年，英国剑桥大学分子生物学实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠的淋巴细胞
38、（脾细胞）和小鼠的骨的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细胞，实现在体外大量生产抗体的目胞，实现在体外大量生产抗体的目胞，实现在体外大量生产抗体的目胞，实现在体外大量生产抗体的目的。实验过程如图所示。的。实验过程如图所示。的。实验过程如图所示。的。实验过程如图所示。(1)(1)(1)(1)淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细
39、胞，两种细胞膜也能淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能“融合融合融合融合”在一起，说明细胞膜在一起，说明细胞膜在一起，说明细胞膜在一起，说明细胞膜 。(2)(2)(2)(2)单克隆抗体的准确定义应为单克隆抗体的准确定义应为单克隆抗体的准确定义应为单克隆抗体的准确定义应为 ()()()()A A A A一类特殊抗体一类特殊抗体一类特殊抗体一类特殊抗体 B B B B无性繁殖系无性繁殖系无性繁殖系无性繁殖系 C C C C单一抗体细胞的无性繁殖第产生的抗体单一抗体细胞的无性繁殖第产生的抗体单一抗体细胞的无性繁殖第产生的抗体单一抗体细胞的无性繁殖第产生的抗体 D D D D单一抗体细
40、胞的有性繁殖系产生的抗体单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体(3)(3)(3)(3)杂交瘤细胞繁殖进行的是杂交瘤细胞繁殖进行的是杂交瘤细胞繁殖进行的是杂交瘤细胞繁殖进行的是_分裂，其遗传性状分裂，其遗传性状分裂，其遗传性状分裂，其遗传性状_。(4)(4)(4)(4)单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原(病原体或癌变细胞等病原体或癌变细胞等病原体或癌变细胞等病原体或癌变细胞等)并并并并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为
41、与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为“生物导弹生物导弹生物导弹生物导弹”这是利用了这是利用了这是利用了这是利用了 _ 。具有一定的流动性具有一定的流动性具有一定的流动性具有一定的流动性C C C C有丝有丝有丝有丝不变不变不变不变抗体能与抗原发生特异性结合的特点抗体能与抗原发生特异性结合的特点抗体能与抗原发生特异性结合的特点抗体能与抗原发生特异性结合的特点第49页/共56页 例题例题例题例题22（1 1）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，）在用动物细胞融合技术制备单克
42、隆抗体时，）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，将抗原注射到小鼠体内，可获得将抗原注射到小鼠体内，可获得将抗原注射到小鼠体内，可获得将抗原注射到小鼠体内，可获得(多选多选多选多选)（）A AT T淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞 B B效应效应效应效应B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞 C C抗体抗体抗体抗体 D D记忆细胞记忆细胞记忆细胞记忆细胞（2 2）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，正确的是正确的是正确的是正确的是 (多选多选多选多选)（）A AB
43、B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台 病毒或聚乙二醇诱导病毒或聚乙二醇诱导病毒或聚乙二醇诱导病毒或聚乙二醇诱导 B B融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克 隆抗体隆抗体隆抗体隆抗体 C C体外培养时，一个体外培养时，一个体外培养时，一个体外培养时，一个B B淋巴细胞可以产生一种抗体，但不淋巴细
44、胞可以产生一种抗体，但不淋巴细胞可以产生一种抗体，但不淋巴细胞可以产生一种抗体，但不 能无限增殖能无限增殖能无限增殖能无限增殖 D D单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，优越性明显优越性明显优越性明显优越性明显 BCDBCD ACDACD第50页/共56页已知细胞已知细胞已知细胞已知细胞合成合成合成合成DNADNA有有有有D D和和和和S S两条途径两条途径两条途径两条途径，其中，其中，其中，其中D D途径能被途径能被途径能被途径能被氨基嘌呤氨基嘌
45、呤氨基嘌呤氨基嘌呤阻断。阻断。阻断。阻断。人淋巴细胞中有这两种人淋巴细胞中有这两种人淋巴细胞中有这两种人淋巴细胞中有这两种DNADNA的合成途径，但一般不分裂增殖。的合成途径，但一般不分裂增殖。的合成途径，但一般不分裂增殖。的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨鼠骨鼠骨鼠骨髓瘤细胞中尽管没有髓瘤细胞中尽管没有髓瘤细胞中尽管没有髓瘤细胞中尽管没有S S途径途径途径途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：
46、试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：（1 1）试管中除融合的杂种细胞外，还有）试管中除融合的杂种细胞外，还有）试管中除融合的杂种细胞外，还有）试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞。种融合细胞。种融合细胞。种融合细胞。（2 2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出 杂种细胞，并说原理。杂种细胞，并说原理。杂种细胞，并说原理。杂种细胞，并说原理。方法：方法：方法：方法：。原理：
47、原理：原理：原理：培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞加入氨基嘌呤后加入氨基嘌呤后加入氨基嘌呤后加入氨基嘌呤后,使使使使D D合成的途径阻断合成的途径阻断合成的途径阻断合成的途径阻断,所以仅所以仅所以仅所以仅D D合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不能增殖能增殖能增殖能增殖,但杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的但杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的但杂种细胞则可以利用淋巴细胞
48、中的但杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的S S途径合成途径合成途径合成途径合成DNADNA而增殖而增殖而增殖而增殖第51页/共56页B体外培养骨髓瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群注射到小鼠腹腔AC 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中B为_过程，常用_作为诱导剂，该细胞继承_的遗传特性，既能_,又能_。1、该实验方案的目的是_3、A是从小鼠的脾脏中取得_,该细胞能够产生_5、C过程指细胞培养，该过程包括_培养和_培养两个阶段，其中_代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体B细胞抗体细胞融合灭活病毒双亲细胞分泌抗体无限增殖原代传代50例例3 3：第52页/共56页1.动物细胞工程技术的基础是：（）A动物细胞融合B胚胎移植C动物细胞培养D核移植课堂练习课堂练习;第53页/共56页在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）A结果是相同的B杂种细胞的形成过程基本相同C操作过程中酶的作用相同D诱导融合的手段相同第54页/共56页.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞A BC D C第55页/共56页感谢您的观看！第56页/共56页