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1、在宿主细胞内大量复制并稳定在宿主细胞内大量复制并稳定存在存在具有一个至多个限制酶切割位具有一个至多个限制酶切割位点，以供外源点，以供外源DNADNA片段插入片段插入具有标记基因，供重组具有标记基因，供重组DNADNA的的鉴定和选择鉴定和选择第1页/共56页四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因人胰岛素基因人胰岛素基因目的基因目的基因插入点插入点第3页/共56页目的基因DNA连接酶连接酶目的基因目的基因插入点插入点目的基因人胰岛素基因人胰岛素基因第4页/共56页目的基因含有含有四环素四环素的的完全培养基完全培养基含有含有氨苄青霉素氨苄青霉素的完全培养基的完全培养基死死亡亡死死亡亡存存活活存存活活死死亡
2、亡存存活活第5页/共56页1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定第6页/共56页1 1、从、从基因文库基因文库中获取（序列未知）中获取（序列未知）2 2、利用、利用PCRPCR技术技术扩增（序列已知）扩增（序列已知）基因文库基因文库基因组文库基因组文库部分基因文库如：部分基因文库如：cDNAcDNA文库文库聚合酶链式反应聚合酶链式反应一、目的基因的获取一、目的基因的获取3 3、人工合成、人工合成
3、(基因比较小，序列已知基因比较小，序列已知)反转录法反转录法根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA（化学合成）（化学合成）第7页/共56页第8页/共56页依据：依据：目的基因的有关信息。目的基因的有关信息。如：如：根据基因的核苷酸序列根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性从基因文库中获取目的基因第9页/共56页利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_
4、复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。原理：原理：_多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列第10页/共56页蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测推测推测人工合成法人工合成法（基因较小，核苷酸序列已知基因较小，核苷酸序列已知）mRNAmRNARNARNADNADNA杂合双链杂合双链单链单链DNADNA双链双链DNADNA逆转录酶逆转录酶DNADNA聚合酶聚合酶反转录法反转录法化学合
5、成法化学合成法第11页/共56页二、基因表达载体的构建（核心）1.目的A.使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在 并并遗传遗传给子代给子代B.同时使目的基因能表达和发挥作用第12页/共56页2.2.基因表达载体的基因表达载体的组成组成：a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因第13页/共56页质粒质粒目的基因目的基因限制酶限制酶DNA连接酶连接酶重组重组DNA3.基因表达载体的构建过程第14页/共56页（1 1）用）用_切割质粒，切割质粒，使其出现切口露出使其出现切口露出_。（2 2）用）用_切割目切割目 的基因，使其产生的基因，使
6、其产生_ _ _。（3 3）将目的基因插入质粒的）将目的基因插入质粒的_处，加入处，加入_，形成了一个重组，形成了一个重组DNADNA分子分子限制酶限制酶黏性末端黏性末端同种限制酶同种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同第15页/共56页三、将目的基因导入受体细胞-转化目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程稳定稳定表达表达受体细胞受体细胞第16页/共56页方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化
7、法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法CaCa2+2+处理法处理法第17页/共56页1、将目的基因导入、将目的基因导入植物植物细胞细胞（1）农杆菌转化法农杆菌转化法特点特点:a.能感染能感染双子叶双子叶植物和植物和祼子祼子植物植物,对单子叶植物无感染能力对单子叶植物无感染能力b.Ti质粒的质粒的TDNA可转移至可转移至受体细胞并受体细胞并整合到其染色体上整合到其染色体上第18页/共56页Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表表达达载载体体转入转入农农杆杆菌菌整合整合 植物细胞染植物细胞染色体色体DNA表达表达新新性性状状外源基因外源基因导入导入植植物物细细胞
8、胞第19页/共56页（2 2）基因枪法基因枪法特点：成本高特点：成本高适用于适用于适用于适用于单子叶植物单子叶植物单子叶植物单子叶植物第20页/共56页（3）花粉通道法）花粉通道法我国转我国转我国转我国转基因抗基因抗基因抗基因抗虫棉就虫棉就虫棉就虫棉就是用这是用这是用这是用这种方法种方法种方法种方法获得获得获得获得第21页/共56页2 2、将目的基因导入、将目的基因导入动物细胞动物细胞方法：方法：显微注射法显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物第22页/共56页3、将目的基因导、将目的基因
9、导入微生物细胞入微生物细胞（1）方法：）方法：Ca2+处理法（处理法（增加细胞膜通透性增加细胞膜通透性）（2）微生物作受体细胞原因：）微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少（3）过程：）过程：Ca2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNA第23页/共56页四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检测（检测（分子水平分子水平）:是否是否插入插入目的基因目的基因是否是否转录转录是否是否翻译翻译鉴定鉴定:个体生物学水平鉴定个体生物学水平鉴定第24页/共5
10、6页（1 1）检测转基因生物染色体的）检测转基因生物染色体的DNADNA上上是否插是否插入了目的基因入了目的基因 A A 方法方法:DNADNA分子杂交分子杂交 B B 过程过程:1.检测检测第25页/共56页 基因探针基因探针通过分子杂交与目的基因结合，通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交带，能从浩翰的基因组中把目的基因产生杂交带，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。显示出来。第26页/共56页(2)(2)检测目的基因检测目的基因是否转录出了是否转录出了mRNAmRNA方法方法:分子杂交法分子杂交法过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNAmRNA杂交杂交,若出现若
11、出现杂交带杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNAmRNA。第27页/共56页（3 3）检测目的基因）检测目的基因是否翻译成蛋白质是否翻译成蛋白质方法方法:抗原抗原-抗体杂交抗体杂交第28页/共56页提提取取方法抗原-抗体杂交苏云金杆菌苏云金杆菌Bt毒素蛋白将将Bt毒蛋白注毒蛋白注射小鼠体内射小鼠体内从小鼠血管抽出从小鼠血管抽出血液分离出抗血液分离出抗Bt毒素的抗体毒素的抗体抗体抗体蛋白质蛋白质 出现出现杂交带杂交带脱脱分分化化组组织织培培养养第29页/共56页2.2.鉴定（个体生物学水平鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等第30页
12、/共56页v目的基因的表达和检测抗虫鉴定 抗病鉴定活性鉴定等抗原抗体杂交法抗原抗体杂交法DNA-RNADNA-RNA分子杂交法分子杂交法DNADNA分子杂交法分子杂交法受体是否具有受体是否具有转基因特征转基因特征个体个体水平水平目的基因是否翻译目的基因是否翻译目的基因是否转录目的基因是否转录目的基因是否插入转目的基因是否插入转基因生物的染色体基因生物的染色体分子分子水平水平方法方法方法方法检测对象检测对象检测对象检测对象第31页/共56页非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区外显子外显子内含子内含子终止子终止子基因的结构基因的结构启动子启动子原核原核真核真核第32页/共56页原核细胞原核
13、细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码第33页/共56页编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区mRNA前体前体mRNA单链单链DNAcDNA转录转录
14、剪接逆转录复制启动子启动子终止子基因基因不含非编码系列。即不含非编码区和内含子第34页/共56页模板DNA第35页/共56页PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物95第36页/共56页PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶第37页/共56页基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较第38页/共56页PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束第2轮开始第39页/共56页PCRPCR的基本原理的基本原理
15、PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaq第40页/共56页PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束第41页/共56页过程：过程：a a、变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA在受热下，在受热下，_断裂，形成断裂，形成_b b、复性复性（55-6555-65）：温度降低，）：温度降低，引物引物与单链与单链DNADNA结合，形成局部结合，形成局部_。c c、延伸延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，合成与的作用下，合成与模板互补的模板互补的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链
16、DNADNA链链第42页/共56页方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_条件：前提条件条件：前提条件:_:_ 结果：结果：指数指数2 2n n短时间内大量扩增目的基因短时间内大量扩增目的基因已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列第43页/共56页DNA复制复制PCR技术技术场所场所解旋方式解旋方式酶酶PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较高温高温解旋酶解旋酶体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶聚合酶第44页/共56页（3）人工合成法：）人工合成法：在在基因较小，核苷酸序列已基因较小，核苷酸序列已知知的情
17、况下，的情况下，可以利用可以利用DNA合成合成仪仪人工合成人工合成化学合成法、反转录法第45页/共56页蛋白质蛋白质mRNADNA推测推测推测推测DNADNA合成仪合成合成仪合成根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNA法法：第46页/共56页生物生物某个发育时期某个发育时期的的mRNAmRNA单链单链DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段重组重组DNADNA与载体连接cDNAcDNA文库文库反转录酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶导入受体菌中储存 cDNA文库的构建-逆转录法：逆转录法：第47页/共56页目的基因所在片段目的基因所在片段运载体运载体PStDNA连接酶连接酶重
18、组重组DNA运载体自连运载体自连目的基因目的基因 自连自连CTTAAGCTTAAGCTTAACTTAAGGPSt 运载体的特点运载体的特点3：有标记基因有标记基因 第48页/共56页导入导入接种接种培养培养接种接种培养培养接种接种培养培养接种接种培养培养含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基完全培养基大大肠肠杆杆菌菌不不含含抗抗四四环环素素基基因因证明：证明：不存活不存活含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基证明：证明：大大肠肠杆杆菌菌含含抗抗四四环环素素基基因因证明：证明：大肠杆菌大肠杆菌的受体细胞含的受体细胞含有目的基因有目的基因 四环素四环素抗性基因抗性基因 四环素四环素抗性
19、基因抗性基因完全培养基存存活活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？第49页/共56页导入导入接种接种培养培养接种接种培养培养接种接种培养培养接种接种培养培养含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基完全培养基大大肠肠杆杆菌菌不不含含抗抗四四环环素素基基因因证明：证明：不存活不存活含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基证明：证明：大大肠肠杆杆菌菌含含抗抗四四环环素素基基因因证明：证明：大肠杆菌大肠杆菌的受体细胞含的受体细胞含有目的基因有目的基因 四环素四环素抗性基因抗性基因 四环素四环素抗性基因抗性基因完全培养基存存活活如何把导入了目的基因的受
20、体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？第50页/共56页基因文库基因文库 将含有某种生物将含有某种生物不同基因不同基因的许多的许多DNA片断，片断，导入到导入到受体菌受体菌的群体中，的群体中，各个受体菌分别含有各个受体菌分别含有这种生物的不同基因这种生物的不同基因，称为基因文库。，称为基因文库。（便于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下，获得所需的目的基因。）第51页/共56页某种生物的某种生物的全部全部DNADNA限制酶限制酶DNADNA片段片段DNADNA片段与载体连接片段与载体连接重组重组DNADNA基因组文库基因组文库导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库的构建基因
21、组文库的构建第52页/共56页导入导入接种接种培养培养含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基死死亡亡如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？接种接种培养培养含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素的完全培养基的完全培养基死死亡亡目的基因第53页/共56页导入导入接种接种培养培养含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基存存活活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？接种接种培养培养含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素的完全培养基的完全培养基存存活活运载体自连运载体自连第54页/共56页导入导入接种接种培养培养含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基死死亡亡如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？接种接种培养培养含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素的完全培养基的完全培养基存存活活第55页/共56页感谢您的观看。第56页/共56页