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1、基因工程的基本操作程序v目的基因的获取v基因表达载体的构建v将目的基因导入受体细胞v目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。第1页/共45页一、目的基因的获取(一)、目的基因主要是_编码蛋白质的基因请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成请阅读P8、9第一和二两段第2页/共45页一、目的基因的获取（一）
2、从基因文库中直接获取1.基因文库：概念见P92.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类种类基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库3.基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。4.获取目的基因的根据：见课本P9第3页/共45页5.基因文库的构建方法之一（1）直接分离法(鸟枪法)提取某生物全部DNA用适当限制酶切割许多DNA片段与载体连接导入受体菌群该生物基因组文库第4页/共45页反转录法：cDNA的合成流程图解5.基因文库的构建方法之mRNA与载体连接导入受体菌群逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚
3、合酶双链DNA(cDNA)该生物cDNA文库第5页/共45页基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较第6页/共45页1、概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术 通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因 因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。聚合酶链式反应体外特定DNA片段2、原理：DNA复制二、利用PCR技术扩增目的基因第7页/共45页四种脱氧核苷酸(dNTP)一对引物：热稳定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)Mg2+(激活剂)3.3.条件：条件：缓冲溶液一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据
4、这一序列合成引物4.4.前提：前提：第8页/共45页5/3/GGTC3/5/GACC5/3/引物GG变性复性延伸1.变性(90-95度)：目的基因DNA受热变性，解链为单链；2.复性（55-60）：引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合；3.延伸（70-75）：在DNA聚合酶（Taq酶）作用下，从5端3端进行延伸。5/3/AG引物5、扩增过程第9页/共45页2、具体过程第10页/共45页PCR(多聚酶链式反应)第11页/共45页 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术 条件：_、_、_、_.等原理：_方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）结果：聚合酶链式反应体外特
5、定DNA片段DNA复制四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）第12页/共45页过程：a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。氢键单链DNA双链DNA链第13页/共45页PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸
6、模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子第14页/共45页目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链DNA DNA(cDNA(cDNA）双链双链DNADNA(即目的基因即目的基因)反转录反转录合成合成1）反转录法：以目的基因转录成的信使以目的基因转录成的信使RNARNA为模板，为模板，反转录成互补的单链反转录成互补的单链DNADNA，然后在酶的作用，然后在酶的作用下合成双链下合成双链DNADNA，从而获得所需的基因。，从而获得所需的基因。蛋白质的氨蛋白质的氨基酸序列基酸序列mRNAmRNA的核的核
7、苷酸序列苷酸序列结构基因的核结构基因的核苷酸序列苷酸序列目的基因目的基因推测推测推测推测化学化学合成合成2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：3、人工合成的目的基因第15页/共45页1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同(二)基因表达载体的构建第16页/共45页科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受
8、精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料:第18页/共45页2、基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自的作用是什么?第19页/共45页启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴
9、别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来第20页/共45页载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意第21页/共45页三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射法感受态细胞
10、目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程受体细胞稳定表达第22页/共45页1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法 农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。第23页/共45页过程：优点第24页/共45页（2）基因枪法（3）花粉管通道法第25页/共45页2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物第26页/共45页3、将目的基因导入微生物细胞原核
11、生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子第27页/共45页四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功第28页/共45页（一）、检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因(关键步骤).首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:1515N N1515N N1 14 4N N1 14 4N N探针探针转基因生转基因生物的物的DNADNA变性变性
12、变性变性第29页/共45页归纳步骤第30页/共45页DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。P15思考与探究第31页/共45页（二）、鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法:分子杂交方法:抗原抗体杂交过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA第32页/共45页综上，目的基因的检测与鉴定检查是否成
13、功分子水平检测个体水平鉴定检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗体杂交第33页/共45页小结小结:基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因u从基因文库u利用PCRPCRu化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法4.4.目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：第34页/共45页练习1：(2008理综山东卷)
14、为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的处，DNA连接酶作用于处。（填“a”或“b”）aa第35页/共45页练习2：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用技术，该技术的核心是和。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素
15、标记的作探针进行分子杂交检测，又要用方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。基因枪法（花粉管通道法）植物组织培养脱分化和再分化耐盐基因一定浓度盐水浇灌第36页/共45页 (2)动植物细胞 除去内含子第37页/共45页（0606年江苏卷）基因工程又叫基因拼接技术。（1 1）在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：以目的基因转录的_为模板，_成互补的单链DNADNA，然后在酶的作用下合成_。（2 2）基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、_。若将真核基因在原核细胞中表达，对该目的基因的基本要求是_。（3 3）假设以大肠杆菌质粒作为运载体，并以同一种限制性内切酶切割运载体与目的基因，将切割后
16、的运载体与目的基因片段混合，并加入DNADNA连接酶。连接产物至少有_种环状DNADNA分子，它们分别是_。信使RNA逆转录动植物细胞除去内含子3运载体自连的、目的基因片段自连、运载体与目的基因片段相连的环状DNA分子双链DNA（目的基因第38页/共45页知识点一：1.原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。RNA聚合酶:
17、能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落)第39页/共45页不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质 编码区非编码区原核细胞的 基因结构有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 启动子终止子第40页/共45页编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游 编码区下游 内含子：外显子：知识点一：2.真核细胞的基因结构第41页/共4
18、5页真核细胞的 基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点等。非编码序列：包括非编码区和内含子第42页/共45页原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码第43页/共45页质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA第44页/共45页感谢您的观看！第45页/共45页