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1、实用电子显微镜技术实用电子显微镜技术第一节第一节第一节第一节 电子显微镜发展简史电子显微镜发展简史电子显微镜发展简史电子显微镜发展简史 电子显微镜通常分为透射电子显微镜和扫描电子显微镜两种类型。利用电子显微镜可对样品内部结构及样品表面形貌进行超微结构的观察与研究。第1页/共149页制造者制造者荷兰眼镜制造商荷兰眼镜制造商Janssen英国科学家和发明家罗伯特英国科学家和发明家罗伯特.胡克胡克荷兰业余科学家列文荷兰业余科学家列文.虎克虎克德国物理学家德国物理学家Knoll和和RuskaArdenne德国德国Siemens公司公司英国剑桥科学仪器有限公司英国剑桥科学仪器有限公司中中国国科科学学院院
2、长长春春光光学学精精密密机机械械与与物物理理研究所研究所中国科学院北京科学仪器厂中国科学院北京科学仪器厂瑞瑞 士士 科科 学学 家家 Binnig、Rohrer、Gerber和和Weible中国科学院白春礼中国科学院白春礼年代年代15901665166519321938193919651959197519811990显微镜显微镜发明了放大发明了放大20-30倍的复式光学显微镜倍的复式光学显微镜自自制制复复式式显显微微镜镜。观观察察软软木木薄薄片片，第第一一次描述植物细胞结构次描述植物细胞结构利利用用小小型型高高倍倍透透镜镜制制成成简简单单显显微微镜镜，放放大大倍倍数数达达300倍倍，观观察察动
3、动植植物物活活细细胞胞与与原原生生动动物物，第一次看到许多单细胞生物。第一次看到许多单细胞生物。研制成功第一台透射电子显微镜研制成功第一台透射电子显微镜研制成功第一台扫描电子显微镜研制成功第一台扫描电子显微镜生产了第一台商品用的透射电子显微镜生产了第一台商品用的透射电子显微镜扫描电子显微镜作为商品问世扫描电子显微镜作为商品问世研制成功第一台透射电子显微镜研制成功第一台透射电子显微镜研制成功第一台扫描电子显微镜研制成功第一台扫描电子显微镜发明扫描隧道显微镜发明扫描隧道显微镜主持研制成功首台原子力显微镜主持研制成功首台原子力显微镜表表1-1显微镜发展简史显微镜发展简史 第2页/共149页电子显微镜
4、之父电子显微镜之父E.Ruska 世界上第一台电子显微镜世界上第一台电子显微镜第3页/共149页仪器名称：透射电子显微镜仪器名称：透射电子显微镜生产厂家：荷兰生产厂家：荷兰PhilipsPhilips公司公司仪器型号：仪器型号：Tecnai 12Tecnai 12主要附件：主要附件：Gatan 792 CCDGatan 792 CCD性能指标：性能指标：最最大大放放大大倍倍数数：6565万万倍倍点分辨率：点分辨率：0.24nm0.24nm线分辨率：线分辨率：0.14nm0.14nm最高加速电压：最高加速电压：120KV120KV第4页/共149页一、国外电子显微镜生产简况一、国外电子显微镜生产
5、简况一、国外电子显微镜生产简况一、国外电子显微镜生产简况 19321932年德国物理学家年德国物理学家KnollKnoll和和RuskaRuska研制成功第一台透射电子显研制成功第一台透射电子显微镜。微镜。2020世纪世纪8080年代末，商品透射电子显微镜普遍进入市场。年代末，商品透射电子显微镜普遍进入市场。电镜厂家：日本日立（电镜厂家：日本日立（HitachiHitachi）公司）公司 日本电子光学实验室（日本电子光学实验室（JEOL)JEOL)荷兰菲利浦公司（荷兰菲利浦公司（PhilipsPhilips）（即美国）（即美国FEIFEI公司）公司）德国蔡司（德国蔡司（ZeissZeiss）公
6、司）公司 捷克捷克 英国剑桥英国剑桥第5页/共149页二、国内电子显微镜生产简况二、国内电子显微镜生产简况二、国内电子显微镜生产简况二、国内电子显微镜生产简况 19591959中国科学院长春光学精密机械与物理研究所研制成功第一台透射电中国科学院长春光学精密机械与物理研究所研制成功第一台透射电子显微镜子显微镜 1010万倍万倍 100kv 100kv 重大科学技术成果重大科学技术成果 19751975中国科学院北京科学仪器厂研制成功第一台扫描电子显微镜中国科学院北京科学仪器厂研制成功第一台扫描电子显微镜 电镜厂家：中国科学院北京科学仪器厂研制中心电镜厂家：中国科学院北京科学仪器厂研制中心 上海电
7、子光学技术研究所上海电子光学技术研究所 南京光学仪器厂南京光学仪器厂三、电子显微镜的发展三、电子显微镜的发展三、电子显微镜的发展三、电子显微镜的发展 分辨率进一步提高，点分辨率优于分辨率进一步提高，点分辨率优于0.3nm0.3nm，晶格分辨率，晶格分辨率0.1-0.2nm0.1-0.2nm 放大倍数从十几倍提高到几十万甚至百万倍放大倍数从十几倍提高到几十万甚至百万倍 种类不断增加，功能不断扩展。（种类不断增加，功能不断扩展。（TEMTEM、SEMSEM、STEMSTEM、分析电子显微镜、分析电子显微镜、高压透射电子显微镜、低温透射电子显微镜等）高压透射电子显微镜、低温透射电子显微镜等）计算机技
8、术开始用于电子显微镜计算机技术开始用于电子显微镜第6页/共149页一、电子显微镜技术的发展一、电子显微镜技术的发展一、电子显微镜技术的发展一、电子显微镜技术的发展 第一台电子显微镜问世后，面临的首要问题是如何将电子第一台电子显微镜问世后，面临的首要问题是如何将电子显微镜技术应用于生物学及其他学科研究。显微镜技术应用于生物学及其他学科研究。电子显微镜结构的改进和功能的改善，样品制备技术的改电子显微镜结构的改进和功能的改善，样品制备技术的改进，使电子显微镜技术在生命科学研究中发挥了重要作用。进，使电子显微镜技术在生命科学研究中发挥了重要作用。第二节第二节第二节第二节 电子显微镜技术的发展与应用电子
9、显微镜技术的发展与应用电子显微镜技术的发展与应用电子显微镜技术的发展与应用第7页/共149页表表表表1-2 1-2 电子显微镜技术发展简史电子显微镜技术发展简史电子显微镜技术发展简史电子显微镜技术发展简史 年代年代19341946194719491950195219561953195519561956195819591961195719631939193919621971197419771978研究者研究者MarotnWilliams和和WyckoffClaudeLatta和和HartmannPaladePalade和和SiekevitzPorter和和BlumMoranHall和和Huxle
10、yLuftGlauertWatsonMoranLuffSteereSabatini及同事及同事Kauschehe和和RuskaHorisbergerFeldherr和和MarshalFaulk和和TaylorRomano及同事及同事Horisberger及同事及同事Rpth及及Bendayan电子显微镜技术电子显微镜技术发表了第一张生物组织茅膏菜属植物叶切片的电子显微图发表了第一张生物组织茅膏菜属植物叶切片的电子显微图将金属投影用于增加电镜图象反差将金属投影用于增加电镜图象反差开始使用铀固定剂开始使用铀固定剂甲基丙烯酸酯被用作包埋介质甲基丙烯酸酯被用作包埋介质用玻璃刀进行组织切片用玻璃刀进行组
11、织切片将缓冲液与锇酸混合，作为组织固定液将缓冲液与锇酸混合，作为组织固定液用电子显微镜分析细胞碎片用电子显微镜分析细胞碎片介绍切片机和切片技术介绍切片机和切片技术使用钻石刀进行超薄切片，并创立冷冻超薄切片术使用钻石刀进行超薄切片，并创立冷冻超薄切片术以磷钨酸为负染色剂观察了灌木病毒及烟草花叶病毒的超微结构以磷钨酸为负染色剂观察了灌木病毒及烟草花叶病毒的超微结构高锰酸钾作为固定剂高锰酸钾作为固定剂环氧树脂作为包埋介质环氧树脂作为包埋介质介绍用重金属铅和铀对组织切片进行染色介绍用重金属铅和铀对组织切片进行染色采用冷冻置换技术制备生物样品采用冷冻置换技术制备生物样品介绍介绍Epon包埋介质包埋介质开
12、始研究冷冻断裂技术开始研究冷冻断裂技术用戊二醛作预固定液保存细胞超微结构及活性，进行细胞化学方面研究用戊二醛作预固定液保存细胞超微结构及活性，进行细胞化学方面研究对蛋白质吸附于胶体金进行探讨对蛋白质吸附于胶体金进行探讨将蛋白质吸附于胶体金方法用于扫描电子显微镜将蛋白质吸附于胶体金方法用于扫描电子显微镜胶体金颗粒作为一种示踪物用于电子显微技术研究胶体金颗粒作为一种示踪物用于电子显微技术研究胶体金作为抗血清特异标记物用于透射电子显微镜胶体金作为抗血清特异标记物用于透射电子显微镜首次制备蛋白质首次制备蛋白质A-金复合物金复合物建立了制备免疫球蛋白建立了制备免疫球蛋白-金颗粒基本方法金颗粒基本方法提出
13、包埋后免疫金标记技术提出包埋后免疫金标记技术第8页/共149页二、电子显微镜技术的应用二、电子显微镜技术的应用二、电子显微镜技术的应用二、电子显微镜技术的应用样品制备方法主要包括：超薄切片、负染色、金属投影、冷样品制备方法主要包括：超薄切片、负染色、金属投影、冷冻复型、快速冷冻深度蚀刻技术、免疫电子显微镜术、扫描冻复型、快速冷冻深度蚀刻技术、免疫电子显微镜术、扫描电镜常规样品制备及扫描电镜冷冻断裂技术等。电镜常规样品制备及扫描电镜冷冻断裂技术等。利用多种样品制备方法和高性能的电子显微镜，在生命科学利用多种样品制备方法和高性能的电子显微镜，在生命科学领域可以观察到细胞中各种细胞器的超微结构，并以
14、此进一领域可以观察到细胞中各种细胞器的超微结构，并以此进一步研究细胞结构与功能的关系，深入探索细胞通讯与运输、步研究细胞结构与功能的关系，深入探索细胞通讯与运输、分裂与分化、增殖与调控等生命活动的规律。在农林科学方分裂与分化、增殖与调控等生命活动的规律。在农林科学方面，电镜技术对植物各种疾病病因诊断与防治的研究越来越面，电镜技术对植物各种疾病病因诊断与防治的研究越来越重要。利用电镜技术观察高分子、表面活性剂、碳纳米管及重要。利用电镜技术观察高分子、表面活性剂、碳纳米管及纳米粒子等结构形态，为化学及材料科学研究提供了有力的纳米粒子等结构形态，为化学及材料科学研究提供了有力的技术手段。技术手段。第
15、9页/共149页扫描隧道显微技术扫描隧道显微技术扫描隧道显微技术扫描隧道显微技术(STM)(STM)(STM)(STM)原子力显微技术原子力显微技术原子力显微技术原子力显微技术(AFM)(AFM)(AFM)(AFM)激光扫描共焦显微技术激光扫描共焦显微技术激光扫描共焦显微技术激光扫描共焦显微技术第三节第三节第三节第三节 其他显微技术的发展其他显微技术的发展其他显微技术的发展其他显微技术的发展第10页/共149页扫描隧道显微扫描隧道显微技术技术(STM)(STM)原子力显微技术原子力显微技术(AFM)(AFM)激光扫描共焦显微技术激光扫描共焦显微技术利用量子力学中隧道效应产生隧道电流信号，获得反
16、映样品表面原子形态结构和原子排列图象。具有原子尺度的高分辨率。可以观察单原子层的实时结构图象，并能在大气、真空甚至液体环境中观察自然状态下的样品表面结构，因而在半导体、金属、无机材料及生物学研究等方面有广阔的应用前景。第11页/共149页扫描隧道显微技术扫描隧道显微技术(STM)(STM)原子力显微技术原子力显微技术(AFM)(AFM)激光扫描共焦显微技术激光扫描共焦显微技术通过微悬臂上的针尖在样品表面扫描，使针尖与凹凸不平的样品表面的顶端原子相互摩擦产生原子力。在扫描过程中，微悬臂的上下起伏与等位面的样品形貌相互对应，所以可通过针尖与微悬臂之间的隧道电流变化，得到样品表面形貌信息。其分辨率可
17、与透射电镜相比拟。AFM不但能通过探测原子间作用力观察绝缘体，还可在生物环境中直接观察生物样品表面结构。第12页/共149页扫描隧道显微技术(STM)原子力显微技术(AFM)激光扫描共焦显微技术利用共焦光路及激光扫描，在观察较厚样品的内部结构或直接观察细胞时，可使所选定的不同层面每一焦点面影象清晰，从而得到细胞不同切面上的一系列图象，经计算机系统快速分析处理，即可重组出样品三维立体图象，展现细胞瞬间变化的形态结构。第13页/共149页第一章第一章 超薄切片超薄切片技术技术 透透射射电电镜镜的的生生物物样样品品制制备备的的常常用用方方法法包包括括超超薄薄切切片片、冷冷冻冻复复型型、负负染染色色等
18、等。透透射射电电镜镜靠靠电电子子束束穿穿透透样样品品成成像像，对对样样品品厚厚度度有有很很高高要要求求。超超薄薄切切片片方方法法得得到到的的样样品品切切片片厚厚度度为为60-100nm60-100nm，冷冷冻冻复复型型膜膜厚厚度度约约为为30nm30nm。复复型型膜膜制制备备和和样样品品负负染染色色的的实实验验过过程程简简单单、易易于于操操作作，而而制制备备超超薄薄切切片片的的过过程程则则比比较较繁繁杂杂。它它分分为为普普通通超超薄薄切切片片技技术术和和冷冻超薄切片技术两大类。冷冻超薄切片技术两大类。第14页/共149页第一节第一节第一节第一节 普通超薄切片技术普通超薄切片技术普通超薄切片技术
19、普通超薄切片技术 普通超薄切片技术：不需要特殊的冷冻条件的常规包埋切普通超薄切片技术：不需要特殊的冷冻条件的常规包埋切片技术。片技术。包括：取材、固定、清洗、脱水、浸透、包埋、聚包括：取材、固定、清洗、脱水、浸透、包埋、聚合、切片及染色等步骤。每一步都关系到实验成功与否，需合、切片及染色等步骤。每一步都关系到实验成功与否，需步步谨慎认真。步步谨慎认真。具体步骤：具体步骤：取材取材醛类固定液前固定几小时或更长时间醛类固定液前固定几小时或更长时间0.1MPBS0.1MPBS清清洗数次洗数次1%1%锇酸后固定锇酸后固定2h2h或过夜或过夜0.1MPBS0.1MPBS清洗数次清洗数次梯度乙醇或丙酮脱水
20、（梯度乙醇或丙酮脱水（3030、5050、7070、8080、9090、9595、100100、100100）浸透（浸透（1 1：1 1、1 1：2 2、纯包埋剂）、纯包埋剂）包埋包埋聚合（聚合（373712h12h、6060 48h 48h）超薄切片超薄切片染色（双重染色）染色（双重染色）第15页/共149页对超薄切片的基本要求对超薄切片的基本要求对超薄切片的基本要求对超薄切片的基本要求 为了获得清晰的电镜图像，超薄切片应达到以下几点要求：为了获得清晰的电镜图像，超薄切片应达到以下几点要求：（1 1）细胞的超微结构得到良好的保存，没有人工假象；）细胞的超微结构得到良好的保存，没有人工假象；（
21、2 2）切切片片厚厚度度一一般般为为50-70nm50-70nm左左右右，较较薄薄的的切切片片分分辨辨率率较较高高，但但反反差差较较弱弱，而较厚的切片反差虽好，但分辨率则而较厚的切片反差虽好，但分辨率则稍差；稍差；（3 3）切片的包埋介质不变形、不分解、不升华，可耐受电子束的照射；）切片的包埋介质不变形、不分解、不升华，可耐受电子束的照射；（4 4）切片平展均匀，没有刀痕、皱褶、震颤及染色剂的沉淀污染；）切片平展均匀，没有刀痕、皱褶、震颤及染色剂的沉淀污染；（5 5）切片染色后，具有良好的反差并可获得清晰的图像）切片染色后，具有良好的反差并可获得清晰的图像第16页/共149页第二节第二节第二节
22、第二节 制样前的准备工作制样前的准备工作制样前的准备工作制样前的准备工作一一 实验设计的准备实验设计的准备二二 实验器具和实验试剂的准备实验器具和实验试剂的准备三三 实验材料的准备实验材料的准备第17页/共149页一、实验设计的准备一、实验设计的准备应充分考虑电镜技术的复杂性和高消耗性等特点，在没有周应充分考虑电镜技术的复杂性和高消耗性等特点，在没有周全的实验设计之前不要轻易的动手进行实验。全的实验设计之前不要轻易的动手进行实验。应考虑实验是进行一般的超微结构观察还是进行细胞化学或应考虑实验是进行一般的超微结构观察还是进行细胞化学或免疫电镜观察，实验涉及的是哪些组织和器官，对取材的组免疫电镜观
23、察，实验涉及的是哪些组织和器官，对取材的组织和器官的部位都要考虑周密。织和器官的部位都要考虑周密。根据实验目的采用合适的缓冲液、固定液和固定方法。如在根据实验目的采用合适的缓冲液、固定液和固定方法。如在细胞化学工作中，一般细胞化学工作中，一般 要求选用二甲砷酸盐缓冲液，一些特要求选用二甲砷酸盐缓冲液，一些特定的离子细胞化学技术需要特定的缓冲液。定的离子细胞化学技术需要特定的缓冲液。包埋介质有时也需要考虑，如在免疫电镜时需要低温包埋剂，包埋介质有时也需要考虑，如在免疫电镜时需要低温包埋剂，这样抗原性可以保存得更好。这样抗原性可以保存得更好。第18页/共149页二二 实验器具和实验试剂的准备实验器
24、具和实验试剂的准备要考虑到各个环节所需要的玻璃器皿、实验器材以及实验要考虑到各个环节所需要的玻璃器皿、实验器材以及实验试剂等。试剂等。三、实验材料的准备三、实验材料的准备应根据实验目的选择合适的实验材料应根据实验目的选择合适的实验材料在实验时不仅要有正常组，还需设立与实验组相同条件的在实验时不仅要有正常组，还需设立与实验组相同条件的对照组对照组第19页/共149页第三节第三节第三节第三节 取材与固定取材与固定取材与固定取材与固定一一一一 取取取取 材材材材取材是超薄切片制样的第一步，也是非常关键的一步。取材是超薄切片制样的第一步，也是非常关键的一步。定义：从动植物机体上或从细胞及微生物的培养物
25、定义：从动植物机体上或从细胞及微生物的培养物中取得所需材料的操作过程。中取得所需材料的操作过程。所需溶液主要有缓冲液、戊二醛等。所需溶液主要有缓冲液、戊二醛等。所需器材有吸管、封口膜、称量瓶、烧杯、双面刀所需器材有吸管、封口膜、称量瓶、烧杯、双面刀片和医用剪刀、镊子、牙签、解剖镜等片和医用剪刀、镊子、牙签、解剖镜等.第20页/共149页“快快”：不不管管是是从从麻麻醉醉或或处处死死动动物物身身上上取取材材，还还是是临临床床手手术术取取材材，都都应应注注意意保保持持样样品品的的微微细细结结构构，使使其其最最大大限限度度的的近近于于生生活活状状态态。一一定定要要目目标标明明确确，操操作作迅迅速速，
26、而而且且使使样样品品必必须须在在离离体体半半分分钟钟或或最最多多2 2分分钟钟内内浸浸入入固固定定液液，以以免免时时间间过过长长，出出现现细细胞胞自自溶溶。尤尤其其在在暑暑热热情情况况下下，还还会出现微生物繁殖导致样品腐败，细胞的精细结构当然会全部破坏。会出现微生物繁殖导致样品腐败，细胞的精细结构当然会全部破坏。“准准”：取取材材的的部部位位一一定定要要准准确确可可靠靠，同同时时还还应应注注意意材材料料的的方方向向性性，例例如如选选取取肌肌组组织织时时，就就要要考考虑虑肌肌原原纤纤维维在在将将来来切切片片时时是是纵纵断断还还是是横横断断；其它组织当然也要考虑到定位和定向的问题。其它组织当然也要
27、考虑到定位和定向的问题。“轻轻”：所所谓谓“轻轻”，是是指指一一切切操操作作都都应应始始终终贯贯彻彻动动作作轻轻柔柔，不不仅仅要要避避免免对对组组织织的的挤挤压压及及钳钳拉拉，还还要要注注意意器器械械的的锋锋利利，否否则则将将引引起起组组织织结结构的人工损伤性变化。构的人工损伤性变化。“小小”：固固定定液液的的穿穿透透能能力力都都比比较较弱弱，所所以以为为了了保保持持样样品品近近于于生生活活状状态态的的微微细细结结构构，取取材材大大小小当当然然要要与与固固定定液液的的穿穿透透速速率率相相适适应应，一一般般以以1mm1mm3 3为为宜宜。样样品品过过大大时时内内部部固固定定不不良良，过过小小时时
28、观观察察的的目目标标又又会会受受到到局限。局限。“低低”：低温操作，：低温操作，4 4，所用试剂、器具均需预冷。，所用试剂、器具均需预冷。第21页/共149页取材方法：取材方法：1 1）动动物物：将将动动物物麻麻醉醉或或急急性性处处死死，在在1-21-2分分钟钟内内解解剖剖出出所所需需要要的的组组织织器器官官，用用锋锋利利的的解解剖剖刀刀取取小小块块材材料料，迅迅速速投投入入冷冷的的戊戊二二醛醛固固定定液液中中。然然后后取取出出放放在在滴滴有有预预冷冷的的戊戊二二醛醛载载玻玻片片上上，用用新新的的锋锋利利刀刀片片把把材材料料切切成成1mm1mm3 3的的小小方方块块，再再投投入入盛盛有有冷冷的
29、的固固定定液液的的小小瓶瓶中中，置置4 4 条条件件下下进进行行低低温温固固定定。对对于于某某些些特特殊殊材材料料，如如神神经经组组织织等等，应先进行原位固定或灌流固定，待组织适度硬化后再取材。应先进行原位固定或灌流固定，待组织适度硬化后再取材。2 2）植植物物：植植物物组组织织的的取取材材较较容容易易，离离体体后后的的变变化化不不象象动动物物材材料料那那样样迅迅速速，但但同同样样要要求求尽尽快快投投入入冷冷的的固固定定液液。一一般般植植物物叶叶片片常常切切成成宽宽1mm1mm、长长3-4mm3-4mm的的小小条条。茎茎和和根根可可切切成成小小条条，也也可可切切成成1mm1mm3 3的的小小方
30、方块块。表表面面有有毛毛刺刺的的植植物物材材料料，需需先先用用酶酶处处理理使使之之软软化化，表表面面有有蜡蜡质质的的叶叶片片在在50%50%乙乙醇醇溶溶液液中中浸浸泡泡几几秒秒至至几几十十秒秒进进行行脱脱蜡蜡，取取出出后用双蒸水清洗数次，再切取。后用双蒸水清洗数次，再切取。第22页/共149页3 3）体外培养细胞的取材：先倒去培养液，然后倒入适量的戊二醛固定）体外培养细胞的取材：先倒去培养液，然后倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴条件下放置液，在冰浴条件下放置5-10min5-10min，弯头滴管吹打或用刀轻轻刮下贴，弯头滴管吹打或用刀轻轻刮下贴壁的细胞。将含有细胞的固定液转移到离心管中，低速离心
31、壁的细胞。将含有细胞的固定液转移到离心管中，低速离心10-2010-20分钟，使细胞聚成团块，用擦镜纸包好细胞团块，置于新鲜的固定分钟，使细胞聚成团块，用擦镜纸包好细胞团块，置于新鲜的固定液中固定。液中固定。4 4）野外取材：冰壶内放一瓶冷的戊二醛固定液，先切取比标准要求稍）野外取材：冰壶内放一瓶冷的戊二醛固定液，先切取比标准要求稍大的组织块，放入冰壶内保存的固定液中，带回实验室后，按要求大的组织块，放入冰壶内保存的固定液中，带回实验室后，按要求切成标准小块或小条进行固定。对于田间植物材料，还可以采集植切成标准小块或小条进行固定。对于田间植物材料，还可以采集植株保湿带回实验室，再进行取材。株保
32、湿带回实验室，再进行取材。5 5）骨组织取材：除某些鱼类骨组织可不脱钙，大部分骨组织均需脱钙。）骨组织取材：除某些鱼类骨组织可不脱钙，大部分骨组织均需脱钙。用锋利锯条将骨组织锯成约用锋利锯条将骨组织锯成约3mm3mm碎骨片，放入固定液中固定过夜或碎骨片，放入固定液中固定过夜或更长时间，缓冲液漂洗后放入脱钙液中脱钙约更长时间，缓冲液漂洗后放入脱钙液中脱钙约3 3周后再切成小块。周后再切成小块。第23页/共149页二二二二 固固固固 定定定定 定定义义：用用化化学学或或物物理理法法迅迅速速杀杀死死细细胞胞，使使所所取取材材料料各各种种细细胞胞或或大大分分子子尽尽可可能能保保持持生生活活状状态态的的
33、结结构构，尽尽可可能能地地减减少少细细胞胞的的死死后变化，使细胞及其细胞器的精细结构完好无损地得以保存。后变化，使细胞及其细胞器的精细结构完好无损地得以保存。固固定定的的目目的的：防防止止组组织织细细胞胞的的离离体体后后变变化化，防防止止自自溶溶，以以保保持持组织细胞的成分和结构与其生活状态尽量一致组织细胞的成分和结构与其生活状态尽量一致 在在固固定定以以后后的的漂漂洗洗、脱脱水水和和包包埋埋等等样样品品处处理理过过程程中，保护样品使其物质不致溶解和流失中，保护样品使其物质不致溶解和流失 为为以以后后样样品品的的处处理理（包包括括染染色色和和经经受受电电子子束束轰轰击击）作准备，并使组织适当地
34、硬化作准备，并使组织适当地硬化第24页/共149页（一）、固定方法（一）、固定方法物物理理固固定定法法 是是指指用用冷冷、热热或或微微波波等等物物理理方方法法对对生生物物组组织织进进行行固固定定。在在超超微微结结构构研研究究中中，冷冷冻冻固固定定和和微微波波固固定定是是较较为为常常用的物理固定方法。用的物理固定方法。化化学学固固定定法法 是是采采用用一一定定的的化化学学试试剂剂对对组组织织或或细细胞胞进进行行固固定定。这这种种化化学学试试剂剂称称“固固定定剂剂”。它它能能和和细细胞胞内内的的大大分分子子物物质质，主主要要是是蛋蛋白白质质发发生生化化学学结结合合形形成成交交联联，使使蛋蛋白白成成
35、分分得得以以凝凝固固稳稳定定，与与此此同同时时也也能能保保存存糖糖类类和和脂脂肪肪，使使其其保保持持生生活活时时的的状状态和位置，从而达到把细胞的精细形态结构保存下来的目的。态和位置，从而达到把细胞的精细形态结构保存下来的目的。理理想想的的固固定定剂剂，应应具具备备以以下下条条件件：能能迅迅速速而而均均匀匀地地渗渗入入组组织织细细胞胞内内部部，稳稳定定细细胞胞内内各各种种成成分分；能能即即刻刻将将细细胞胞“杀杀死死”，尽尽可可能能保保持持细细胞胞微微细细结结构构，减减少少死死后后变变化化；对对细细胞胞不不产产生生收收缩缩及及膨膨胀胀作作用用，不不产产生生人人工工假假象象及及变变形形；可可保保存
36、存一一定定的酶的活性，以利于细胞化学测定工作的进行。的酶的活性，以利于细胞化学测定工作的进行。第25页/共149页在化学固定过程中，组织微细结构保存的质量不仅受到固定液特性的在化学固定过程中，组织微细结构保存的质量不仅受到固定液特性的影响，而且还受到固定组织所使用方法的影响。影响，而且还受到固定组织所使用方法的影响。1.1.浸泡固定浸泡固定 是最常用的固定方法。组织块切小后，立即浸到大量是最常用的固定方法。组织块切小后，立即浸到大量固定液中。使用青霉素小瓶，每瓶放固定液中。使用青霉素小瓶，每瓶放1010块左右组织，固定液块左右组织，固定液2-4ml2-4ml，44固定固定2-42-4小时或更长
37、时间。适用于各种实质性器官，如心、肝、肾、小时或更长时间。适用于各种实质性器官，如心、肝、肾、肌肉等。肌肉等。2.2.原位固定原位固定 是指在保持实验动物血流不断的情况下，进行固定渗是指在保持实验动物血流不断的情况下，进行固定渗透，避免因为缺氧和死后的组织自溶引起微细结构的变化。将动物麻透，避免因为缺氧和死后的组织自溶引起微细结构的变化。将动物麻醉后暴露出所需器官的表面，剥开包膜，将冷的固定液滴加到被取器醉后暴露出所需器官的表面，剥开包膜，将冷的固定液滴加到被取器官上，直至组织达到适当的硬度。或将固定液直接注射到所需固定的官上，直至组织达到适当的硬度。或将固定液直接注射到所需固定的组织中或者空
38、腔器官的内部，最后将所需的组织取出作常规浸泡固定。组织中或者空腔器官的内部，最后将所需的组织取出作常规浸泡固定。适用于较软的组织（如脑、眼球等）。适用于较软的组织（如脑、眼球等）。3 3血血管管灌灌注注固固定定 利利用用血血液液循循环环的的途途径径将将固固定定液液灌灌注注到到所所要要固固定定的的组组织织中中，其其特特点点是是固固定定迅迅速速、均均匀匀。将将固固定定液液注注入入特特制制的的带带有有针针头头与与皮皮管管的的容容器器中中，而而后后选选择择到到达达要要取取材材器器官官的的最最短短循循环环途途径径，将将固固定定液液灌灌注注到到动动物物的的相相应应部部位位。待待被被灌灌流流的的组组织织适适
39、度度硬硬化化后后，再再细细致致解解剖剖取取材材，并并按按浸浸泡泡固固定定法法操操作作。适适用用于于解解剖剖关关系系比比较较复复杂杂的的组组织织器器官官（如如垂体、脊髓、甲状旁腺等）。垂体、脊髓、甲状旁腺等）。第26页/共149页（二）常用固定液的性质（二）常用固定液的性质1 1醛类醛类醛醛类类固固定定剂剂包包括括戊戊二二醛醛、丙丙烯烯醛醛、甲甲醛醛、多多聚聚甲甲醛醛等等。此此类类固固定定剂剂的的特特点点是是对对样样品品的的穿穿透透力力较较强强，能能固固定定较较大大的的组组织织块块，既既能能很很好好地地固固定定蛋蛋白白质质和和糖糖元元等等结结构构，也也不不易易使使酶酶丢丢失失活活性性，且且长长时
40、时间间固固定定不不会会使使组组织织变变脆脆，因因此此能能较较好好的的保存组织的超微结构。保存组织的超微结构。（1 1）.戊戊二二醛醛 是是电电镜镜样样品品制制备备中中，最最常常用用的的固固定定剂剂之之一一。它它作作为为超超薄薄切切片片术术的的固固定定剂剂是是从从19631963年年开开始始的的，至至今今已已得得到到广广泛泛使使用用。戊戊二二醛醛对对细细胞胞的的精精细细结结构构有有很很强强的的亲亲和和力力，因此是一种良好的固定剂。商品多为因此是一种良好的固定剂。商品多为2525的戊二醛水溶液的戊二醛水溶液.第27页/共149页戊戊二二醛醛作作为为生生物物样样品品的的固固定定剂剂，具具有有以以下下
41、优优点点：对对组组织织的的渗渗透透力力比比锇锇酸酸大大，而而且且能能保保存存组组织织内内某某些些酶酶活活性性；与与蛋蛋白白质质之之间间的的反反应应较较快快，能能较较好好地地保保存存蛋蛋白白质质的的结结构构；对对细细胞胞内内的的微微管管及及滑滑面面内内质质网网、线线粒粒体体等等膜膜性性结结构构保保存存较较好好；可可以以较较好好地地固固定定和和保保存存组组织织里里的的糖糖原原，用用大大白白鼠鼠的的肝肝脏脏可可证证明明大大约约有有6565的的糖糖原原可可被被戊戊二二醛醛保保存存下下来来；能能够较好的固定植物组织。够较好的固定植物组织。戊二醛作为固定剂的主要缺点：戊二醛作为固定剂的主要缺点：没有电子染
42、色作用，单没有电子染色作用，单独用它固定的生物样品电子反差不好；独用它固定的生物样品电子反差不好；脂类及其他一些脂类及其他一些微细结构，在脱水时易被提取出来。微细结构，在脱水时易被提取出来。第28页/共149页为充分发挥戊二醛固定效果，使用和储存过程中应注意：为充分发挥戊二醛固定效果，使用和储存过程中应注意：pHpH和温度和温度 中性或碱性均能使戊二醛聚合，失去醛基。中性或碱性均能使戊二醛聚合，失去醛基。PHPH降降至至3.53.5以下时固定效力也将大幅降低。以下时固定效力也将大幅降低。PHPH为为5 5时在时在44或更低或更低温度可保持稳定状态几个月。温度可保持稳定状态几个月。氧气和浓度氧气
43、和浓度 氧气对戊二醛溶液影响较大，应密封保存。浓氧气对戊二醛溶液影响较大，应密封保存。浓度大于度大于5050时在室温下容易聚合成胶状，低于时在室温下容易聚合成胶状，低于4 4的溶液较的溶液较为稳妥。为稳妥。杂质污染杂质污染 可能产生白色沉淀物，应确保玻璃器皿及水的洁可能产生白色沉淀物，应确保玻璃器皿及水的洁净。净。第29页/共149页（2 2）.丙烯醛丙烯醛 其渗透和反应速度均较快，稍大一些组织可其渗透和反应速度均较快，稍大一些组织可用丙烯醛作固定液。丙烯醛和戊二醛混合液可较好保存微用丙烯醛作固定液。丙烯醛和戊二醛混合液可较好保存微管。丙烯醛易燃，是危险化学品，可由呼吸系统吸入，或管。丙烯醛易
44、燃，是危险化学品，可由呼吸系统吸入，或通过皮肤吸收，并对皮肤有强烈刺激作用。通过皮肤吸收，并对皮肤有强烈刺激作用。（3 3）.甲醛甲醛 多用于光学显微镜技术研究。电镜样品固定多用于光学显微镜技术研究。电镜样品固定多用纯化的多聚甲醛，为白色粉末。多用纯化的多聚甲醛，为白色粉末。分子较小，渗透组分子较小，渗透组织的能力比强。但不能较好的固定细胞基质，脱水后大部织的能力比强。但不能较好的固定细胞基质，脱水后大部分细胞基质将丢失。一般与戊二醛混合使用。分细胞基质将丢失。一般与戊二醛混合使用。（4 4）.高锰酸钾高锰酸钾 一种强氧化剂一种强氧化剂,主要用于保存细胞的膜性主要用于保存细胞的膜性结构，对质膜
45、、内质网及髓鞘等结构保存良好，其他结构结构，对质膜、内质网及髓鞘等结构保存良好，其他结构则保存很差。只用于研究某些常用固定液难以固定的植物则保存很差。只用于研究某些常用固定液难以固定的植物和酵母样品。和酵母样品。第30页/共149页戊二醛的配制戊二醛最终浓度(%)11.522.53450.2M磷酸缓冲液(ml)50505050505050市售25%戊二醛(ml)46810121620加双蒸水至(ml)100100100100100100100第31页/共149页2 2四氧化锇（四氧化锇（O OS SO O4 4，锇酸），锇酸）四四氧氧化化锇锇是是一一种种淡淡黄黄色色、具具有有强强烈烈刺刺激激味
46、味的的晶晶体体，它它的的水水溶溶液液呈呈中中性性，故故“锇锇酸酸”二二字字实实为为一一种种误误称称。强强氧氧化化剂剂，具具有有强强烈烈的的挥挥发发作作用用，挥挥发发的的蒸蒸气气具具有有一一定定毒毒性性，对对皮皮肤肤、呼呼吸吸道道粘粘膜膜和和角角膜膜等等都都有有固固定定损损伤伤作作用用，所所以以在在配配制制时时应应注注意意通通风风，最最好好在在毒毒气气橱橱中中进进行行操作。操作。优优点点：能能与与不不饱饱和和脂脂肪肪酸酸反反应应，使使脂脂肪肪酸酸得得以以固固定定，所所以以也也是是唯唯一一能能保保存脂类的固定剂。存脂类的固定剂。能能固固定定脂脂蛋蛋白白，使使生生物物膜膜结结构构的的主主要要成成分分
47、磷磷脂脂蛋蛋白白稳稳定定；还还可可与与变性变性DNADNA以及核蛋白起反应。以及核蛋白起反应。当当经经O OS SO O4 4固固定定后后，金金属属锇锇可可被被结结合合在在细细胞胞结结构构里里，因因而而在在电电镜镜观观察察时可以获得很好的图像反差，起到电子染色的辅助作用。时可以获得很好的图像反差，起到电子染色的辅助作用。对缓冲液要求不高。对缓冲液要求不高。缺缺点点：四四氧氧化化锇锇对对糖糖类类和和天天然然DNADNA、RNARNA保保存存作作用用极极差差，因因此此单单独独用用四四氧氧化锇固定时，大部分碳水化合物包括糖原皆可被溶掉。化锇固定时，大部分碳水化合物包括糖原皆可被溶掉。其其分分子子较较
48、大大，渗渗透透能能力力较较弱弱，在在l l1.51.5小小时时内内，仅仅渗渗透透 0.10.10.5mm0.5mm，因因此此在在取取材材时时更更应应注注意意其其大大小小，一一般般不不应应超超过过0 0.5.51.0mm1.0mm3 3。四氧化锇还是酶的钝化剂，因而不适于作细胞化学的固定。四氧化锇还是酶的钝化剂，因而不适于作细胞化学的固定。第32页/共149页经经四四氧氧化化锇锇长长时时间间的的固固定定会会造造成成脂脂蛋蛋白白复复合合体体的的溶溶解解，使使组组织织变变脆脆，给给切切片片带带来来困困难难，所所以以四四氧氧化化锇锇固固定定的的时时间间不不宜宜过过长长，一一般般应应控控制制在在1 14
49、 4小小时时内内（4 4）。四四氧氧化化锇锇还还可可与与乙乙醇醇或或醛醛类类等等发发生生氧氧化化还还原原反反应应而而产产生生沉沉淀淀，故故用用四四氧氧化化锇锇固固定定后后的的样样品品，必必须须用缓冲液或双蒸水彻底清洗后，才能进入乙醇溶液中脱水。用缓冲液或双蒸水彻底清洗后，才能进入乙醇溶液中脱水。配好的四氧化锇储存液（配好的四氧化锇储存液（2 2的水溶液），必须贮存于棕色带磨的水溶液），必须贮存于棕色带磨口塞子的试剂瓶中，用蜡封好，外包黑纸，置口塞子的试剂瓶中，用蜡封好，外包黑纸，置44冰箱中保存待冰箱中保存待用。存放锇酸溶液的容器不干净，或配制时间过久，锇酸就会被用。存放锇酸溶液的容器不干净，
50、或配制时间过久，锇酸就会被氧化还原为黑色的氧化还原为黑色的O OS SO O2 2、深褐色的、深褐色的O OS SO O4 42H2H2 2O O和和O OS S(OH)(OH)，总称为，总称为“锇黑锇黑”，此时预先配制的四氧化锇水溶液逐渐失去原有的固定效，此时预先配制的四氧化锇水溶液逐渐失去原有的固定效力。因此，锇酸溶液最好在使用前配制力。因此，锇酸溶液最好在使用前配制.第33页/共149页3.3.四氧化钌四氧化钌 与锇酸性质相近，对细胞膜、核膜及胞质膜结构固与锇酸性质相近，对细胞膜、核膜及胞质膜结构固定效果极佳。与蛋白质、糖原和单糖反应强烈。易分解，定效果极佳。与蛋白质、糖原和单糖反应强烈