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1、6.1 SEM样品制备的基本要求 SEM对样品基本要求：基本性质：干净、干燥、导电、不发光、不发热、磁性弱。大 小：直径最大不宜超过10 mm，高度在3-5 mm之间，在满足观察的情况下，样品尽量小为宜。第1页/共60页对试样的要求试样可以是块状或粉末颗粒，试样大小要适合仪器专用样品座的尺寸，不能过大。样品座尺寸各仪器不尽相同，一般小的样品座为 3 5mm，大的样品座为 30 50mm，以分别用来放置不同大小的试样，样品的高度也有一定的限制，一般在 5 10mm 左右。表面受到污染的试样，要在不破坏试样表面结构的前提下进行适当清洗，然后干燥。新断开的断口或断面，一般不需要进行处理，以免破坏断口
2、或表面的结构状态。有些试样的表面、断口需要进行适当的侵蚀，才能暴露某些结构细节，则在侵蚀后应将表面或断口清洗干净，然后烘干。要求在真空中能保持稳定，含有水分的试样应先干燥除去水分。对磁性试样要预先去磁，以免观察时电子束受到磁场的影响。要求导电，不导电的观察前进行导电处理。第2页/共60页块状试样扫描电镜的试样制备是比较简便的。对于块状导电材料，除了大小要适合仪器样品座尺寸外，基本上不需要进行什么制备，用导电胶把试样粘结在样品座上，即可放在扫描电镜中观察。对于块状的非导电或导电性较差的材料，要先进行镀膜处理，在材料表面形成一层导电膜。以避免电荷积累，影响图象质量。并可防止试样的热损伤。6.1.2
3、块状试样的制备第3页/共60页6.1.3粉体试样的制备粉体可以直接撒在样品座的双面碳导电胶上，用平的表面物体，例如玻璃板压紧，然后用洗耳球吹去粘结不牢固的颗粒。对细颗粒的粉体分析时，特别是形貌观察时，将粉体用酒精或水在超声波清洗机内分散，再用滴管把均匀混合的粉体滴在样品座上，待液体烘干或自然干燥后，粉体靠表面吸附力即可粘附在样品座上。第4页/共60页在制备SEM样品时，必须掌握以下原则：(1)每一操作过程，都应注意防止样品的污染和损伤，使被观察的样品尽可能保持原有的外貌和微细结构；(2)去除样品内水份，以利于维持SEM的真空度和防止镜筒的污染。但在脱水和干燥处理时，要尽量减少避免样品体积变小和
4、收缩变形等人工假象；(3)降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能，以提高二次电子发射率，建立适度的反差和减少样品的充放电效应；(4)观察组织细胞的表面或内部微结构，应注意和保护样品的观察面。第5页/共60页6.1.4常规生物样品制备技术制备过程如下：取材 根据需要，切取适当大小的样品。专门的SEM备有灵活可动，范围较大的样品台，样品可大些。装在透射电镜上的扫描附件，活动范围较小，样品直径应在34mm左右。漂洗 用缓冲液把组织表面洗净，否则会影响正常形态，但以快速和轻巧为宜，尽量保护器官或组织的表面结构，使其不致因不慎的操作造成人为损伤。固定 用2.55戊二醛/缓冲液在室温或4摄氏度下前固定。
5、具体时间可根据样品的需要而定，一般单细胞10-30分钟，较大的或较硬的样品可达1-2h或更长时间。漂洗 用缓冲液洗3次，洗去未结合的戊二醛。重固定 1锇酸/缓冲液4摄氏度下后固定1060min。有时为了提高样品的反差和固定效果，可以综合固定液，如随意选用戊二醛、多聚甲醛、锇酸等按照不同的比例混合使用。第6页/共60页漂洗 用缓冲液洗去未结合的锇酸。脱水 用30、50、70、80、90、95、100、100丙酮或乙醇溶液各10-15分钟，大于1mm的样品可脱水1020分钟。干燥 一般情况下，可把脱水后的样品放在空气中自然干燥或45热风吹干。有些研究工作要求尽量完好保存样品表面的精细结构，可用真空
6、干燥法、冷冻干燥法和临界点干燥法等使样品干燥。这些方法都比空气干燥法效果好，其中临界点干燥法优点多，多被研究工作者采用。导电：离子溅射、真空镀膜或导电染色处理第7页/共60页6.2.1固定与脱水样品的固定：为了把生物样品的微细结构和外部形态真实的保留下来，SEM样品必须进行固定处理。通过固定还可以使组织硬化，从而增强样品在干燥过程中耐受表面张力变化发生龟裂，还能提高样品耐受电子束轰击的能力。常用的固定剂为醛类和四氧化锇，还有多聚甲醛和高锰酸钾等。固定的方式有浸泡固定、灌注固定、微波和化学混合固定。脱水处理：对保证金属镀膜装置和电镜的镜筒真空度和防止样品在高真空状态下的龟裂和变形等有重要的作用。
7、采用不同浓度的乙醇或丙酮梯度脱水逐步的除去样品中的水分。第8页/共60页6.2.2 样品的干燥：1.自然干燥法：把样品暴露在空气中直接干燥，只适用于表面比较坚硬或含水分较少的生物样品。如：昆虫、骨骼、牙齿、毛发、种子、果壳、花粉、植物标本，以及微小材料如细菌等。具体做法是：先将样品固定，并系列脱水到100，在大气中让脱水剂自然挥发即可，但注意环境要干燥。因为脱水剂的表面张力系数比水小所以样品在脱水剂中不会过多变形而影响其结构。2.真空干燥法：是直接将固定及脱水的样品放入真空镀膜仪内，在低真空状态下使样品内的溶液逐步挥发，当达到高真空时样品即可干燥，随后进行金属镀膜。这一方法简单易行，但是仍存在
8、一定的表面张力问题，固在缺少其它的干燥手段时才选用。第9页/共60页3 临界点干燥：目前最理想的简单的干燥法。临界点干燥仪利用物质在临界状态下液体表面张力逐渐被消除的特性，减少样品干燥过程中的变形和收缩，从而达到样品的完全干燥。4 冷冻干燥：在此过程中，样品中的水分直接由冰态升华为气态，样品也不受表面张力的影响。但这种方法的不足之处是样品中的水分易形成冰晶而破坏超微结构。第10页/共60页6.2.3 临界点干燥 临界点：在一定的温度和压力下，某物质的液态和气态界面消失，由液态瞬间转化为气态，此时的温度即该物质的临界点温度（C.T），同时也是该物质的临界点（C.P）。而此时的压力和该物质的密度称
9、为临界压力和临界密度。不同的物质有各自的临界点和临界压力。在临界点时表面张力作用消失，分子之间的内聚力等于零。临界点干燥仪的设计就依据了这种物理性质。干燥剂：考虑到生物样品有限的承受力，一般选择低温和低压临界点的干燥剂.有多种物质可以作为临界点干燥的干燥剂，如：液态二氧化碳、干冰（固体二氧化碳）、氟利昂以及一氧化二氮。最常用的为液态二氧化碳。第11页/共60页常用几种干燥剂的临界值干燥剂临界温度/摄氏度一氧化二氮氟利昂13氟利昂23液态二氧化碳、26.528.925.931.1临界压力（kg/cm2）标准大气压下71.238.247.772.8第12页/共60页临界点干燥法原理在干燥过程中，表
10、面张力会使样品变形。因此，为了保持样品的完好形态，必须消除表面张力造成的影响。我们知道，液体表面张力随其温度的升高而急骤变小。对于每一种液体，都有一个表面张力为零的温度，这个温度叫临界温度。与临界温度对应的压力叫临界压力，在临界温度和临界压力下使样品干燥的方法叫临界点干燥法。现在，国内外都有商品临界点干燥仪。照理，含水样品可以直接进行临界点干燥。可是，由于水的临界温度高达374，临界压力高达2.4710Pa(218个大气压)，这样高的温度和压力不仅会破坏样品的形态构造，而且需要耐压很高的仪器。解决这个问题的办法就是选择临界温度接近室温，临界压力接近大气压的液体取代样品中的水，然后对这种液体进行
11、临界点干燥，使样品达到干燥的目的。这种液体叫做转移液。对转移液的要求，除要求其适当的临界温度和临界压力外，还应考虑其毒性、密度、成本和溶剂性质等，一般常用液体CO2。第13页/共60页液态CO2临界点干燥法的过程样品固定后系列乙醇脱水到100。中间液替换：因为样品要从脱水剂乙醇经中间液过渡到转移液。因此，中间液既要和脱水剂互溶，又要和转移液互溶。具体步骤是：脱水后的样品在70乙醇与30醋酸异戊酯混合液中浸1020分钟，然后再在30乙醇与70醋酸异戊酯混合液中浸1020分钟，而后用100中间液(醋酸异戊酯)浸两次，每次各1020分钟。转移液替换：用CO2作转移液替换中间液的过程，是在封闭的耐压室
12、内进行的。用酒精或丙酮清洗临界点干燥器的进气管道和耐压室，吹干后，反复12次放入和排出液体CO2，然后在耐压室底部放数层滤纸，并将装有样品的样品架放入。拧紧耐压室盖，慢慢放入液体CO2。然后稍开排气阀，以5L/min的流量排出耐压室原来的气体，此时可闻到醋酸异戊酯味，待醋酸异戊酯味消失后，关闭排气阀。第14页/共60页此时通过观察窗观察室内液体CO2应浸没样品(如果不能浸没样品，说明耐压室温度高，应降温后再行操作)，关闭进气阀，停放约12小时以完成CO2的置换过程。此时压力约为5.6166.46Pa(5765Kgf/cm2)。加热：用60温水或自动调温装置将耐压室加温，压力很快增加，使压力维持
13、在1.117Pa(110Kgf/cm2)左右。510分钟，CO2全部汽化，从观察窗可看到其汽化过程是：液面上升界面模糊完全混浊透亮无液体。这时的压力约为9.36Pa(95Kgf/cm2)。排气：在排气管口放一温水杯，这样既可观察排出的气泡数以控制排气速度，又可避免排气管路产生干冰而造成堵塞。慢慢打开排气阀，使压力缓慢下降，并维持耐压室温度在50左右。排气速度不可太快，否则会损伤样品，一般控制在10泡/秒左右约每分钟45Pa9.8 5Pa(510Kgf/cm2)的降压速度。大约经一个多小时的排气后，压力表指示为“零”，排气口无气泡时，即可打开耐压室，取出已干燥好的样品。第15页/共60页临界点干
14、燥仪第16页/共60页临界点干燥的失误和解决办法1.样品干燥不充分：这是最常见的问题，可能有以下几种原因：（1）脱水不彻底，中间液醋酸异戊酯和液态二氧化碳置换不良，最终导致干燥不充分。（2）醋酸异戊酯反流：在冬季反复使用仪器，可能使醋酸异戊酯凝结在排气管上。如果此时打开样品室盖，由于气压的变化，会使排气管中的醋酸异戊酯反流，并浸湿已干燥好的样品。解决的办法是沿样品室的内壁垫上一层滤纸，用来吸附反流的醋酸异戊酯。（3）一次干燥的样品过多：样品笼的高度一般以不超过样品室深度的一般为宜。否则样品过多，带入的醋酸异戊酯也过多样品不易干燥充分。第17页/共60页2.样品室内压力达不到要求：（1）注入液态
15、二氧化碳量过少：可能会使样品位于二氧化碳的气液面交界处，样品受到液体二氧化碳表面张力的作用，尽管比水的表面张力小的多，但仍会影响样品的精细结构。（2）样品室密闭不良：这可能是因为垫圈老化，有裂纹，或垫圈下有异物等。3.注入液体二氧化碳困难：主要因为样品室的温度高，没有事先降温。夏季室温高于30度时更易造成注入困难。降温的办法有两种：一是用少许液体二氧化碳充盈2-3次，再放掉气体的二氧化碳；二是用控温钮调制低于室温10度。第18页/共60页6.2.4 冷冻干燥法在冷冻干燥过程中，样品中的水分直接由冰态升华为气态，样品也不受表面张力的影响。但这种方法也有不足之处，如：样品中的水分易形成冰晶而破坏超
16、微结构。因此需要大量的冷冻剂和较好的真空装置，使造价提高。再加上所需冷冻时间过长，更限制了这种方法的使用。所以，尽管用这种方法能较好地保存样品中的水溶性和脂溶性 物质，但是使用仍不普遍。有下面两种方法：第19页/共60页一直接冷冻干燥法：这种方法适用于新鲜样品。把样品粘附在小铜片上后快速投入丙烷中进行冷冻固定，丙烷须用液氮预冷。固定好的样品放入真空喷镀仪中，用液氮冷却，保持一定的温度压力连续抽真空若干天，直至样品完全干燥为止。乙醇冷冻干燥法：按照常规方法戊二醛固定，乙醇梯度脱水至100%。把样品投入注满液氮的冷冻干燥仪的金属杯中使样品中的乙醇固化。把金属杯放入冷冻干燥仪的喷度装置中，通过旋转泵
17、抽气使液氮固化并升华，接着固化的乙醇也升华，样品随之干燥。第20页/共60页6.3 导电大多数生物样品的表面电阻很高，直接用扫描电镜观察会产生充放电效应，所以要对样品进行导电处理。常用的导电处理方法有金属喷镀法和导电染色法。金属喷镀法是将干燥后的样品用导电胶粘在样品台上，放入真空喷镀仪内或离子溅射仪内喷约15nm厚的碳或金，随后进行电镜观察。这种方法除可消除充放电效应外，还可提高二次电子发射率。缺点是热辐射和原子轰击会使样品变形。导电染色法是用金属盐类化合物与生物体的蛋白质、脂类、糖类等结合，使表面离子化，或游离出金属分子镶嵌于生物分子间，从而使样品表面电阻值降低，消除充电放电效应，同时在一定
18、程度上起硬化组织的固定作用。第21页/共60页6.3.1 金属镀膜法金属镀膜法就是把样品镀上一层很薄的并且非常均匀的金属膜（一般20nm厚的金膜）。因为金的化学性质比较稳定，不与样品中的化学成分反应，使既不影响样品本身的结构，样品又有导电性。经过金属镀膜的样品，能产生大量的二次电子从而提高图像的而质量。另外还能加强样品对电子束轰击的抗击力，以减小电子束对样品的损伤。有两种方法，一是离子溅射法，二是真空喷度法。第22页/共60页在电场的作用下，使真空罩内残留的气体分子被电离为阳离子和电子，它们分别飞向阴极和阳极并不断的与其它的气体分子相碰撞，表现为紫色的放电现象。此外，阳离子又可以轰击阴极上的金
19、属靶，使部分金属原子被激发出来，这些金属原子在电场的加速作用下，可从不同的方向和角度飞向阳极呈漫散射的方式覆盖在样品的表面，形成连续而均匀的金属膜。薄膜的厚度可以控制在1-100nm之间，这样既不掩盖样品的表面结构，又使样品具有了良好的导电性。6.3.1.1离子溅射法原理第23页/共60页离子溅射仪第24页/共60页1.因为飞散出来的金属颗粒为原子或分子很小，所以镀膜质地精细。2.因为金属颗粒带负电，样品表面带正电，且各部位的正电位相同，使金属颗粒均匀的飞向带正电的样品表面，所以镀膜均匀。3.镀膜仪通过调节电流强度和真空度来控制飞散出来的金属颗粒的数量，从而有效的控制镀膜的厚度，使其既不遮盖样
20、品表面的微细结构，又能具有良好的导电性。4.离子溅射时原子的能量大约为真空镀膜时原子能量的100倍，所以溅射镀膜的附着力强。离子溅射镀膜的特点第25页/共60页6.3.1.2真空镀膜的原理及特点在真空的条件下，把金属丝加热到一定的温度时，该金属就会急剧地蒸发。此时，如果把样品放在距金属丝5cm左右处，蒸发的金属原子就会洒落在其表面，使其覆盖上一层金属膜，真空镀膜仪就是根据这一原理设计的。由于镀膜是在真空条件下进行的，因此即可以防止样品受传导和对流引起的热损伤，又可以防止样品受金属氧化引起的污染。并且在镀膜的时候样品台旋转使样品表面的镀膜均匀。一般用铝和铜，比离子溅射法成本低。对于样品表面凹凸明
21、显的，最好先喷一层碳以加固其表面结构，而离子溅射法不能喷碳，所以对于这类有特殊要求的样品选用真空镀膜仪。第26页/共60页离子溅射镀膜与真空镀膜相比，其主要优点是：（1）装置结构简单，使用方便，溅射一次只需几分钟，而真空镀膜则要半个小时以上。（2）消耗贵金属少，每次仅约几毫克。（3）对同一种镀膜材料，离子溅射镀膜质量好，能形成颗粒更细、更致密、更均匀、附着力更强的膜。第27页/共60页对不导电的样品，最好在样品加工完毕后，立即蒸镀金或者碳等导电膜，镀膜后应马上分析，避免表面污染和导电膜脱落。金导电膜导电性好，二次电子发射率高，可以拍摄出质量好的图象。如果成分定性、定量分析，必须蒸镀碳导电膜。碳
22、为超轻元素，对所分析元素的X 射线吸收小，对定量分析结果影响小。蒸镀金可以用真空镀膜仪或离子溅射仪，蒸镀碳只能用真空镀膜仪。镀膜要均匀，厚度控制在20nm 左右，为了保证样品与标样镀膜厚度相同，标样和样品应该同时蒸镀。真空镀膜仪在蒸镀过程中会产生1000C2000C 的高温，而样品距蒸发源约为15mm 左右，对熔点低的有机物样品、生物样品及镶嵌材料等都会产生影响。必须控制蒸镀时间，长时间镀膜不但温升影响样品，而且镀膜厚度增加会影响定量分析结果。如果金膜太厚，金粒子会聚集成岛状结构，在高倍图象观察时产生假象，同时也会覆盖样品的微细结构。为了控制镀碳膜厚度，最简单的方法是在镀膜样品的附近放一块经抛
23、光的黄铜，用黄铜表面镀膜后的干涉色判断膜厚，20nm黄铜表面的干涉色为蓝紫色。第28页/共60页比较两种镀膜方法比较项目离子溅射法真空镀膜法要求真空度低（0.01-0.1乇）高（0.5乇）镀膜材料金、铂金银铜铝碳能否喷碳膜不能能镀膜附着力强弱控制镀膜厚度容易较难二次电子获取量较多一般样品损伤程度较大样品污染黑化污染一般无第29页/共60页6.3.2导电染色 导电染色法是一种将极细小的金属颗粒植入生物样品中，以增强样品导电性的染色过程。它要求染液既不污染样品，又能完好保存组织的精细结构，并且使样品有良好的导电性。经导电染色的样品在扫描电镜下能释放较多的二次电子从而加强图像的亮度和反差。特别是对于
24、一些需要进行血管灌流或穿刺灌流的动物组织样品，如：心脏、气管、肠管胃等，最好进行导电染色，使在清洗样品的同时，又能提高样品的导电性能。常用的导电染液由缓冲液/固定液配制而成，同时具有固定作用。第30页/共60页单宁酸/锇酸：基于特殊的分子结构，单宁酸对酸性和中性溶液中的蛋白质具沉淀作用，对一些金属酸或金属盐类具有还原作用。特别是单宁酸/锇酸同时存在的情况下，单宁酸和锇酸结合，形成单宁酸锇酸复合物，使单宁酸/锇酸混合液除了具有固定作用之外，又能将金属颗粒植入生物样品中。但需要注意的是，用单宁酸/锇酸处理样品之后，一定要彻底清洗，以防止污染。第31页/共60页 一般用0.1mol/l的磷酸缓冲液或
25、二甲胂酸钠缓冲液配制单宁酸/锇酸导电染液，单宁酸的浓度燥0.5-4之间，锇酸的浓度燥0.1-1之间，可以根据样品的需要进行选择。为防止为例污染新配制的单宁酸溶液，最好在过滤后使用。染色时间根据样品的大小来确定，对于3mm3左右的组织块，须用导电液在室温下或4摄氏度下处理1-2h，而单细胞只处理10-30分钟就可以了。经过导电染色处理的样品，可以省略金属镀膜。有人对导电染色后的样品进行镀膜和不镀膜的比较观察，发现图像在亮度和反差方面没有明显的区别。第32页/共60页锇酸：常用1OsO4/缓冲液作为后固定液，一般4摄氏度下处理10分钟至1h。因为锇酸含金属锇颗粒，对生物样品中的某些蛋白质有亲和性，
26、所以在固定样品的同时，向样品中植入了金属颗粒，因而增强了样品的导电性。锇酸对组织的渗透性不强，与戊二醛的前固定相比较，往往需要更长的时间，但锇酸处理的时间过长，又会腐蚀破坏生物样品的精细结构，使之产生空洞。所以要根据样品的具体情况，灵活掌握用锇酸处理的时间。第33页/共60页扫描电镜观察样品整体表面一.直接观察法：这种方法比较简单、快捷，对样品的损伤较少，虽然在分辨力上受一定的限制，但也比较常用。下面介绍两种直接观察法。1.固体样品的直接观察法：对于含水少，本身就比较干燥且有有定导电能力的固体样品，如：骨骼、牙齿、矿石、土壤、干果、竹木以及植物的干标本等，可以直接用导电双面胶带将样品粘到样品台
27、上，省略喷涂就可以用扫描电镜观察。但要注意以下几点：（1）样品的底面应尽量平整，以扩大与样品台的接触面，改善导电状况。如果需要，可在粘样品之前适当修整样品的底面。（2）用这种方法的图像分辨力不高，在调试仪器时应选择较低的加速电压（约5KV），并且放大倍数为几百倍为宜。（3）如果图像的质量不行，可以适当进行导电喷涂。第34页/共60页2.活体样品的直接观察法：对于一些体积小，且含水少的活的昆虫等样品，如：蚊子、蚂蚁、螨虫、蛾等，也可以省略化学固定等一系列步骤，使之在生活状态下就可以在扫描电镜下观察，具体步骤如下：（1）取样：注意不要碰伤样品。（2）清洗：用生理盐水或PBS洗1-3次。注意不要致死
28、样品，清洗液的pH值与样品本身的一致。如果样品干净可以不清洗。（3）粘样：用导电胶带将样品粘在样品台上，注意既要粘牢，防止样品脱落阻塞通道，又要使样品能轻微运动。（4）观察：一般用低电压（2-5kV）。注意操作要熟练，迅速抓住时机在20分钟之内拍照完毕。因为在真空状态下，活体样品内的水分易蒸发，从而导致样品收缩变形甚至死亡。有的扫描电镜配有高速摄影和录相装置，可以获取样品的动态变化图像，如：细胞分裂的全过程等。第35页/共60页二、游离细胞的观察法 用扫描电镜观察游离细胞的表面结构已相当普遍，样品制备的关键是如何把样品粘在样品台上，具体方法很多。1.滤纸吸附法：用1戊二醛/缓冲液固定，1000
29、r/m 离心10分钟，去上清液。将细胞的浓悬液滴在一小片滤纸上，系列乙醇脱水，临界点干燥，喷涂后观察。这种方法简便易行，但图像容易混杂滤纸的显微。2.金属片法：与第一种方法类似，只是改为将细胞 浓悬液滴在有微孔的金属片上，再进行一系列操作。3.玻璃片法：现在盖玻片上镀一层金属膜以减少放电现象，改善观察效果。再把浓细胞悬液（此时已经过每步离心脱水到100）滴到玻片上，接着进行干燥。或把盖玻片浸入0.3-0.5孚尔瓦/氯仿液中，约10s后取出，自然干燥，使玻片上均匀地涂上一层膜，容易吸附细胞，再按照前法操作。第36页/共60页三、常规方法1.取材：取材准确、体积不宜过大，以减少不必要的观察量。2.
30、固定：一般双固定，即戊二醛前固定，锇酸后固定。3.清洗：生理盐水或缓冲液4.系列乙醇脱水和醋酸异戊酯置换5.干燥：临界点干燥、空气干燥、冷冻干燥等6.导电处理：离子溅射或真空喷镀第37页/共60页扫描电镜样品断裂面结构的观察为了扩大扫描电镜的应用范围，越来越多的研究工作者采用不同的方法，用扫描电镜揭示组织块和细胞等样品断裂面的超微结构，得到的图像立体感强更加逼真，并且可与透射电镜的观察效果互补长短。液氮冷冻割断法：1.一般方法：A冷冻：把已干燥好的样品浸入液氮，或放在已经用液氮制冷的金属块上冷冻。B割断：用双面刀片把样品切成两块。C喷涂：把样品粘在样品台上，注意断裂面朝上，再真空喷金。第38页
31、/共60页2.使用扫描电镜冷冻切割装置附设在扫描电镜上的冷冻割断装置由冷冻剂罐、冷刀装置、预冷真空控制装置、样品台调节装置、温度控制装置和观察窗等组成。用这种装置，可连续地进行样品的冷冻、割断、喷涂和观察等一系列操作。程序如下：A冷冻：将样品安放在一个金属台支架上，用样品携带杆固定好后，迅速放入液氮冷冻（使用样品携带杆可以减少样品表面的结霜）B断裂：用样品携带杆把预冷的样品送入扫描电镜的冷冻割断小室中，用到断裂样品。（小室与冷冻剂罐相连，使样品台和刀都制冷）C喷涂：通过调节加热控制装置，使样品的断裂面升华，接着用喷金装置喷涂，这一步可以提高样品的导电性和图像的反差。D观察：接着将样品送入扫描电
32、镜的样品室，就可以观察了。第39页/共60页3.树脂冷冻割断法这种方法容易掌握，应用也比较广泛。可选用多种树脂，如：EPON812等。在操作过程中共同的问题是，既要防止树脂聚合，又要使树脂固化，所以采用冷冻方法处理样品。具体步骤如下:A修样：取新鲜组织，切成1mm*1mm*5mm的棒状。B固定和脱水:常规方法C置换：将样品浸入氧化丙烷30min，在换氧化丙烷/树脂混合液浸数小时。D包埋：医用2号胶囊中注满树脂（注意不含加速剂），在放入样品，9-12h。E固化：80度下固化，可用液氮或乙醚/干冰等冷冻剂。F割断：用刀具等在木板态上槌打。槌打时用力要适当，使断面平整 光洁犹如玻璃为佳。G脱树脂：将
33、割断的样品浸入氧化丙烯中处理2h，其间换3-5次新鲜的氧化丙烯，以彻底洗去样品中的树脂。H按照常规方法临界点干燥和喷涂。第40页/共60页其它割断方法1.苯乙烯树脂割断法：这种方法的特点是操作简单，一方面包埋树脂要完全聚合，所以样品可保存较长时间；另一方面样品易被断裂，包埋的树脂也好溶解，所以应用比较广泛。特别对于较微小的样品，方向性较强的样品和用其它方法不易断裂的较硬的样品，如：结缔组织、软骨等更加适宜。具体步骤如下：（1）修整样品，常规方法固定、脱水。（2）置换：将样品浸入1：1乙醇/苯乙烯单体混合液中30min，在于-4度下用苯乙烯单体处理约12h。（3）包埋：向苯乙烯单体中加入2-3%
34、的过氧化苯乙酰，充分搅拌均匀之后，注入 以放有样品的医用胶囊中，随机盖好。（4）聚合：60度，24h以上。（5）割断：先剥去胶囊，在用割断器操作。（6）脱树脂：将割断的带有树脂的样品投入氧化丙烯中，约2h，期间换3-4次氧化丙烯。（7）置换和干燥：用乙酸异戊酯处理20min以上，临界点干燥第41页/共60页游离细胞割断法：（1）固定：采用低浓度短时间的固定较好。如：1戊二醛/0.1mol/l磷酸缓冲液，10-30min。（2）离心：1000g，10min，离心成团，去上清液。（3）加固：按体积1：1加入蛋清，搅拌均匀，使之成为蛋白/细胞混合液。（4）后固定：用滴管缓缓加入戊二醛固定液，固定2h
35、以上，直到蛋白从表面到底部都变硬，期间可换几次新鲜的固定液。（5）修整：取出蛋白/细胞混合块，用双面刀片切成小条。（6）割断：可选任意一种方法，操作同组织块一样。第42页/共60页超高压电镜样品的制备超高压电镜电子束的波长更短，速度更快，穿透力比普通透射电镜要强得多。对于较厚的生物样品，亦能穿透，并且既能增加图像的立体感，又不影响图像的分辨力，所以可用超高压电镜观察比较厚的样品。但由于透射电镜的场深比较大，较厚的样品中各层次都会在焦使图像包含的内容过多，最终影响图像分析的质量。所以，超高压电镜在生物领域应用不十分广泛。只作简单介绍。第43页/共60页一、厚切片的制备一、制备厚切片的原则 厚切片
36、指1.5-3微米的厚切片。制备厚切片的过程与普通超薄切片相似，只是在某些步骤有一些特殊的要求。第一，样品块相对要软一些，以便连续切片和保护刀口；第二，要用较厚的支持膜，并喷碳加固，以防电子束的轰击；第三，可选用折叠式的单缝载网，以防止切片从载网上脱落；第四，最好用浸没法染色，且染色的时间可适当延长，以便使染液浸透样品。此外，在包埋之前进行块染，亦能加强染色的效果。在这些基本原则的指导下，可以根据具体条件选用可行的办法。第44页/共60页制备厚切片的方法1.取材与固定；与超薄切片近似，用25多聚甲醛或戊二醛在室温下固定1-3h，1锇酸后固定 30min1h。2.块染（需要时加用）：用醋酸双氧铀/
37、乙醇饱和溶液或2磷钨酸/乙醇溶液，在室温下浸没样品块1-2h，可增加图像的反差。3.脱水：用系列梯度乙醇或丙酮脱水。4.包埋与聚合：用812，这种包埋剂聚合后较软，又有一定的韧性。为了加强染色效果，可用5醋酸双氧铀/75乙醇溶液，在60度下浸泡聚合好的包埋块，24-36h。5.准备载网：（1）载网的选择：因为厚切片不易粘牢，所以可选用折叠式载网。这种载网可把切片夹住以防脱落。但是这种载网不易覆盖支持膜，电镜观察时切片在电子束轰击下容易漂移或开裂。解决的办法之一是用普通单缝载网，并覆盖较厚的孚尔瓦/碳膜。另外，在电镜操作的时候，注意电子束斑的调节要得当，防止过亮。第45页/共60页（2）载网的清
38、洗：为了把样品粘牢和防止污染，一定要彻底清洗载网，尤其是旧网。具体办法是：先把载网浸入去污剂中，用超声波清洗；再用重蒸水冲洗；接着用100丙酮冲洗。最后，为解决捞片难的问题，还可以对载网进行辉光放电处理。（3）制备支持膜：与制备超薄切片中的相似，但需制备较厚的支持膜，改用0.8孚尔瓦/二氯乙烯溶液，并真空喷镀20-60nm厚的碳膜。6.切片与捞片：程序与超薄切片相似，只是调解切片的厚度和切速有所不同。用切片的干涉色来判断切片的厚度，紫色以上为宜。捞片时注意，如果用单缝载网捞连续切片，一定要对正，使切片局域单缝中，否则就观察不到了。另外，如果载网经一系列清洗后仍有静电排斥切片，不易捞取和粘牢，可
39、以先在1异丁烯/二甲苯溶液中浸一下，在进行捞片。7.电子染色：用浸泡染色法，使厚切片的上下两面都能浸透染液，可加强染色效果。并适当延长染色时间，用饱和醋酸双氧铀染1-2h，用柠檬酸铅染30-60min。第46页/共60页二、制备整装样品整装样品是指经过一系列处理后，直到电镜观察，始终保持完整状态的样品。即：不经过切片和断裂等破坏性处理的样品。用超高压电镜观察的整装生物样品多是完整的细胞或细菌等。因它们的直径已足够小，超高压电镜可以穿透，不必切片亦能进行观察。下面以整装细胞的样品制备为例，介绍具体方法。一、准备工作1.载网的准备：载网上覆盖孚尔瓦膜并喷碳膜加固，紫外线照射灭菌。2.培养细胞：把载
40、网的膜面朝上，浸没载培养液中，并接种培养的细胞，载37度温箱中培养3-4天，注意无菌操作。第47页/共60页二、电镜样品制备程序1.清洗：用吸管缓缓吸掉培养皿中的培养液，载注入缓冲液静置5min以洗去细胞表面多于的培养液。2.前固定：先洗去缓冲液，载注入戊二醛 在室温下固定20-30min。3.清洗：同1.4.锇酸后固定。5.清洗6.脱水:系列乙醇梯度脱水。8.临界点干燥。9.电镜观察。第48页/共60页电镜观察在从事电镜是工作中学会观察也是很重要的。首先，要有正确的态度和方法，既要洞察每一个细节，又要抓住每一个主要目标，还要善于分析，区分真伪。另外，观察之前还需要了解和掌握定的有关超微结构方
41、面的基本知识和电镜拍照的方法。第49页/共60页观察的原则和技巧一、树立全局的和立体的观点电镜样品很小，如：超薄切片的载网直径只有3mm，扫描电镜的你股票虽然大些但也不过几个厘米。因此，对于千万的整体来说，小小的电镜样品只代表你观察样品极小的一个侧面。认识到这一点在电镜观察和分析时候就不会一叶障目，而是把观察到得结果和实际联系起来。思考和分析。例如：在某一个细胞的超薄切片中没有观察到中心粒，不能轻易下结论在这种细胞中不存在中心粒的结论。另外，超薄切片是二维的样品，观察时要尽量从立体效果 去想象和分析。因此，为了正确地分析观察到得资料，必须树立从全局的和立体的观点。第50页/共60页2.观察的技
42、巧电镜观察犹如大海捞针，决不能走马观花，一定要严谨认真，否则精华的东西很可能就从您的眼下溜过了，而且很可能再也找不回了。在加上已做好的电镜样品用肉眼和光学显微镜都看不出个所以然来，只有到电镜下观察时，才知道样品的优劣，所以在观察时，最好先用低倍（200-800）纵观全局，找到样品的优质区（厚度适宜、均匀平展、无污染无空洞和漂移）等，并由此开始依次观察，当发现重点目标时，再局部连续放大。这样做既可以提高观察的效果，减少盲目性。另外，样品在电子束的轰击下是很容易损伤的，特别是超薄切片，极易破裂、变形和曲卷。为了为了把握住有用的资料，特别是难得的结构，最好先按低倍至高倍的顺序拍照，在仔细观察和相互讨
43、论。以免在热烈讨论分析中样品在电子束的轰击下破裂毁于一瞬。对于同一个视野，先拍低倍好片，再拍高倍照片。因为在拍高倍照片是电子束流集中在一个很小的区域轰击，容易造成热损伤，再转到低倍时会发现刚拍过的区域形成一个圆的明亮区，使拍照的视野亮度不均匀。由此看来，电镜观察时，要掌握先低倍在高倍以及先拍照再据需观察和讨论的技巧。第51页/共60页电镜观察中人工假象和原因与识别电镜样品的制备过程是复杂的，要经过多种处理，难免使样品受到这样或那样的损伤。另外观察过程中电子束的轰击也会使样品造成不同程度饿损伤。在加上其他因素，如：聚焦和象散，往往使拍出的照片显示不出样品的真实情况。我们把这类图像统称为人工假象。
44、产生人工假象的原因很多，但总的可以划分为两类：一类是样品制备的原因，一类是电镜观察的原因。第52页/共60页样品制备的过程的原因制备样品的方法不同，引起损伤的原因也不同，如：在制备超薄切片过程中，最容易造成损伤的因素是固定、脱水、修快、切片和染色。在制备扫描电镜样品的过程中，最容易在成损伤的因素是干燥和喷涂，在制备冷冻蚀刻的样品中容易造成损伤的因素是冷冻、断裂、喷涂和清洗等。只有把握好每一个制样的环节才能尽可能的减少损伤。第53页/共60页2、电镜观察的原因这主要和电镜的调试和操作有关。电镜观察之前，要把仪器的状态调节到最佳，使能清晰成像和无畸形。如果光阑或透镜受到污染，使电子束的通道受阻，就
45、会形成象散，即：图像失真，使高放大倍数时图像模糊不清。观察过程中，过强的电子束轰击样品时，会使样品受热，结果一方面使包埋的材料升华，导致结构模糊；另外，使样品极度扩张，会使样品撕裂，进而还会引起样品的漂移和卷曲。最终导致无法观察和拍照。另外，聚焦不当也会影响照片的质量，一般认为肉眼聚焦好之后，恰是欠焦状态。因为欠焦时物象的周围显现一种衍射环，使反差有所增加，但同时却降低了分辨率，为了妥善解决反差和分辨率的矛盾，一般先稍欠焦拍照，或正焦、欠焦和过焦条件下各拍一张，冲印出来后在选择。第54页/共60页第55页/共60页第56页/共60页第57页/共60页第58页/共60页手指纹第59页/共60页感谢您的观看！第60页/共60页