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1、乳制品中蛋白质的测定乳制品中蛋白质的测定内容梗概内容梗概GB 5009.5-2010 GB 5009.5-2010 GB 5009.5-2010 GB 5009.5-2010 内容简介内容简介内容简介内容简介食品中蛋白质检测方法简介食品中蛋白质检测方法简介食品中蛋白质检测方法简介食品中蛋白质检测方法简介第一法：凯氏定氮法（详细）第一法：凯氏定氮法（详细）第一法：凯氏定氮法（详细）第一法：凯氏定氮法（详细）第二法：分光光度法（简介）第二法：分光光度法（简介）第二法：分光光度法（简介）第二法：分光光度法（简介）第三法：燃烧值法（简介）第三法：燃烧值法（简介）第三法：燃烧值法（简介）第三法：燃烧值法
2、（简介）食品安全国家标准食品安全国家标准食品安全国家标准食品安全国家标准 食品中蛋白质的测食品中蛋白质的测食品中蛋白质的测食品中蛋白质的测定定定定于于于于20102010年年年年3 3月月月月2626日发布，日发布，日发布，日发布，20102010年年年年6 6月月月月1 1日实施。日实施。日实施。日实施。本标准本标准本标准本标准代替代替代替代替GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白食品中蛋白食品中蛋白食品中蛋白质的测定、质的测定、质的测定、质的测定、GB/T 14771-1993GB/T 14
3、771-1993GB/T 14771-1993GB/T 14771-1993食品中蛋白食品中蛋白食品中蛋白食品中蛋白质的测定方法和质的测定方法和质的测定方法和质的测定方法和GB/T 5413.1-19GB/T 5413.1-19GB/T 5413.1-19GB/T 5413.1-1997979797婴幼婴幼婴幼婴幼儿配方食品和乳粉蛋白质的测定。儿配方食品和乳粉蛋白质的测定。儿配方食品和乳粉蛋白质的测定。儿配方食品和乳粉蛋白质的测定。统一了食品中蛋白质的测定方法，强制性统一了食品中蛋白质的测定方法，强制性统一了食品中蛋白质的测定方法，强制性统一了食品中蛋白质的测定方法，强制性GB 5009.5-
4、2010GB 5009.5-2010 内容简介内容简介本标准与本标准与本标准与本标准与GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003相比主要修改如相比主要修改如相比主要修改如相比主要修改如下：下：下：下：在第一法中增加了在第一法中增加了在第一法中增加了在第一法中增加了自动蛋白质测定仪自动蛋白质测定仪自动蛋白质测定仪自动蛋白质测定仪的的的的方法；方法；方法；方法；增加了增加了增加了增加了燃烧法燃烧法燃烧法燃烧法，作为第三法；，作为第三法；，作为第三法；，作为第三法；修改了换算系数；修改了换算系数；修改了换算系数；修
5、改了换算系数；（复合配方食品为（复合配方食品为（复合配方食品为（复合配方食品为6.256.256.256.25）对计算结果的有效数字规定进行了修改；对计算结果的有效数字规定进行了修改；对计算结果的有效数字规定进行了修改；对计算结果的有效数字规定进行了修改；（蛋白质含量（蛋白质含量（蛋白质含量（蛋白质含量1 g/100 g 1 g/100 g 1 g/100 g 1 g/100 g 时，结果保留三时，结果保留三时，结果保留三时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量位有效数字；蛋白质含量位有效数字；蛋白质含量位有效数字；蛋白质含量1 g/100 g 1 g/100 g 1 g/100 g 1 g/10
6、0 g 时，时，时，时，结果保留两位有效数字）结果保留两位有效数字）结果保留两位有效数字）结果保留两位有效数字）增加增加增加增加pHpHpHpH计计计计对滴定终点的判定。对滴定终点的判定。对滴定终点的判定。对滴定终点的判定。GB 5009.5-2010 内容简介内容简介蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C C C C、H H H H、O O O O、N N N N、S S S S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量五种
7、元素组成。某些蛋白质中还含有微量五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的的的的 P P P P、CuCuCuCu、FeFeFeFe、I I I I 等。等。等。等。在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮
8、的色素）。生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。蛋白质概况蛋白质概况测定蛋白质含量的常规方法有五种：测定蛋白质含量的常规方法有五种：测定蛋白质含量的常规方法有五种：测定蛋白质含量的常规方法有五种：1 1、凯氏定氮法、凯氏定氮法、凯氏定氮法、凯氏定氮法 2 2、乙酰丙酮比色法？、乙酰丙酮比色法？、乙酰丙酮比色法？、乙酰丙酮比色法？3 3、双缩脲比色法等，、双缩脲比色法等，、双缩脲比色法等，、双缩脲比色法等，（这些方法均存在着样品需要预处理、操作繁（这些方法均存在着样品需要预处理、操作繁（这些方法均存在着样品需要预处理、操作繁（这些方法均存在着样品需要预处
9、理、操作繁琐耗时等缺点。但凯氏定氮法和乙酰丙酮比色琐耗时等缺点。但凯氏定氮法和乙酰丙酮比色琐耗时等缺点。但凯氏定氮法和乙酰丙酮比色琐耗时等缺点。但凯氏定氮法和乙酰丙酮比色法作为我国食品卫生标准检测方法，分析成本法作为我国食品卫生标准检测方法，分析成本法作为我国食品卫生标准检测方法，分析成本法作为我国食品卫生标准检测方法，分析成本低，测定结果准确，应用十分广泛。）低，测定结果准确，应用十分广泛。）低，测定结果准确，应用十分广泛。）低，测定结果准确，应用十分广泛。）蛋白质检测方法简介蛋白质检测方法简介4 4、近红外光谱技术是、近红外光谱技术是、近红外光谱技术是、近红外光谱技术是2020世纪世纪世纪
10、世纪8080年代后期迅速年代后期迅速年代后期迅速年代后期迅速发展起来的一项物理测试技术。近红外透射或发展起来的一项物理测试技术。近红外透射或发展起来的一项物理测试技术。近红外透射或发展起来的一项物理测试技术。近红外透射或反射光谱具有分析样品用量少、分析速度快和反射光谱具有分析样品用量少、分析速度快和反射光谱具有分析样品用量少、分析速度快和反射光谱具有分析样品用量少、分析速度快和结果稳定等优点，在食品分析领域已经逐步得结果稳定等优点，在食品分析领域已经逐步得结果稳定等优点，在食品分析领域已经逐步得结果稳定等优点，在食品分析领域已经逐步得到了应用。到了应用。到了应用。到了应用。5 5、杜马斯燃烧法
11、比凯氏定氮法还早，近年来、杜马斯燃烧法比凯氏定氮法还早，近年来、杜马斯燃烧法比凯氏定氮法还早，近年来、杜马斯燃烧法比凯氏定氮法还早，近年来杜马斯燃烧法测定饲料、肥料等农产品中氮含杜马斯燃烧法测定饲料、肥料等农产品中氮含杜马斯燃烧法测定饲料、肥料等农产品中氮含杜马斯燃烧法测定饲料、肥料等农产品中氮含量在我国也有了应用。量在我国也有了应用。量在我国也有了应用。量在我国也有了应用。蛋白质检测方法简介蛋白质检测方法简介目前国家标准中用于检测食品中蛋白质的方法共目前国家标准中用于检测食品中蛋白质的方法共目前国家标准中用于检测食品中蛋白质的方法共目前国家标准中用于检测食品中蛋白质的方法共有三种：有三种：有
12、三种：有三种：1 1、凯氏定氮法、凯氏定氮法、凯氏定氮法、凯氏定氮法（适用于各种食品中蛋白质的测定）（适用于各种食品中蛋白质的测定）（适用于各种食品中蛋白质的测定）（适用于各种食品中蛋白质的测定）2 2、乙酰丙酮分光光度法、乙酰丙酮分光光度法、乙酰丙酮分光光度法、乙酰丙酮分光光度法（适用于各种食品中蛋白质的测（适用于各种食品中蛋白质的测（适用于各种食品中蛋白质的测（适用于各种食品中蛋白质的测定）定）定）定）3 3、燃烧法、燃烧法、燃烧法、燃烧法（适用于蛋白质含量在（适用于蛋白质含量在（适用于蛋白质含量在（适用于蛋白质含量在10 g/100 g 10 g/100 g 以上的粮食、以上的粮食、以上
13、的粮食、以上的粮食、豆类、奶粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的筛选测定）豆类、奶粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的筛选测定）豆类、奶粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的筛选测定）豆类、奶粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的筛选测定）不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品测定。物质的食品测定。物质的食品测定。物质的食品测定。蛋白质检测方法简介蛋白质检测方法简介凯氏定氮方法简介凯氏定氮方法简介凯氏定氮法是凯氏定氮法是凯氏定氮法是凯氏定氮法是18831883年年年年Kjeldahl
14、Kjeldahl发明，当时凯氏只发明，当时凯氏只发明，当时凯氏只发明，当时凯氏只使用使用使用使用H2SO4H2SO4来分解试样，来定量谷物中的蛋白质，来分解试样，来定量谷物中的蛋白质，来分解试样，来定量谷物中的蛋白质，来分解试样，来定量谷物中的蛋白质，后来由后来由后来由后来由GunningGunning加入改进，在消化时加入加入改进，在消化时加入加入改进，在消化时加入加入改进，在消化时加入K2SO4K2SO4使沸点上升，加快分解速度，凯氏定氮法至今仍使沸点上升，加快分解速度，凯氏定氮法至今仍使沸点上升，加快分解速度，凯氏定氮法至今仍使沸点上升，加快分解速度，凯氏定氮法至今仍在使用。在使用。在使
15、用。在使用。根据食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量根据食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量根据食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量根据食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。一样的。一样的。一样的。原理：食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，原理：食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，原理：食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，原理：食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成
16、硫酸铵，然使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或者盐酸后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或者盐酸后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或者盐酸后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或者盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。其反应方程式如下：即为蛋白质的含量。其反应方程式如下：即为蛋白质的
17、含量。其反应方程式如下：即为蛋白质的含量。其反应方程式如下：蛋白质蛋白质+H2SO4 H2SO4 （NH4NH4）2SO42SO4（NH4NH4）2SO4+NaOH=NH4OH+Na2SO42SO4+NaOH=NH4OH+Na2SO4 NH4OH H2O+NH3 NH4OH NH4OH H2O+NH3 NH4OH NH3+(NH3+(标准标准标准标准)H2SO4)H2SO4（NH4NH4）2SO42SO4 (标准标准标准标准)H2SO4+NaOHNa2SO4+H2O)H2SO4+NaOHNa2SO4+H2O第一法：凯氏定氮法第一法：凯氏定氮法注：注：凯氏定氮法所测得的含氮量为食品的总氮量，其凯
18、氏定氮法所测得的含氮量为食品的总氮量，其凯氏定氮法所测得的含氮量为食品的总氮量，其凯氏定氮法所测得的含氮量为食品的总氮量，其中还包括少量的非蛋白氮，如尿素氮、游离氨氮、中还包括少量的非蛋白氮，如尿素氮、游离氨氮、中还包括少量的非蛋白氮，如尿素氮、游离氨氮、中还包括少量的非蛋白氮，如尿素氮、游离氨氮、生物碱氮、无机盐氮等，由凯氏定氮法测得的蛋生物碱氮、无机盐氮等，由凯氏定氮法测得的蛋生物碱氮、无机盐氮等，由凯氏定氮法测得的蛋生物碱氮、无机盐氮等，由凯氏定氮法测得的蛋白质称为粗蛋白质。白质称为粗蛋白质。白质称为粗蛋白质。白质称为粗蛋白质。除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，除非另有规定，本方
19、法中所用试剂均为分析纯，除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为水为水为水为GB/T 6682 GB/T 6682 规定的三级水规定的三级水规定的三级水规定的三级水。4.1 4.1 硫酸铜（硫酸铜（硫酸铜（硫酸铜（CuSO45H2OCuSO45H2O）。）。）。）。4.2 4.2 硫酸钾（硫酸钾（硫酸钾（硫酸钾（K2SO4K2SO4）。）。）。）。4.3 4.3 硫酸（硫酸（硫酸（硫酸（H2SO4 H2SO4 密度为密度为密度为密度为1.84Kg/L1.84Kg/L）。）。）。）。4.4 4.4 硼酸（硼酸（硼酸（硼酸（H3BO3H3BO3）。）
20、。）。）。4.54.5 甲基红指示剂（甲基红指示剂（甲基红指示剂（甲基红指示剂（C15H15N3O2C15H15N3O2）。）。）。）。4.6 4.6 溴甲酚绿指示剂（溴甲酚绿指示剂（溴甲酚绿指示剂（溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5SC21H14Br4O5S）。）。）。）。4.7 4.7 亚甲基蓝指示剂（亚甲基蓝指示剂（亚甲基蓝指示剂（亚甲基蓝指示剂（C16H18ClN3S3H2OC16H18ClN3S3H2O）。）。）。）。4.8 4.8 氢氧化钠（氢氧化钠（氢氧化钠（氢氧化钠（NaOHNaOH）。）。）。）。4.9 95%4.9 95%乙醇（乙醇（乙醇（乙醇（C2H5OHC2H5OH
21、）。）。）。）。试剂和材料试剂和材料4.10 4.10 硼酸溶液（硼酸溶液（硼酸溶液（硼酸溶液（20 g/L20 g/L）：）：）：）：称取称取称取称取20 g 20 g 硼酸，加水溶解后并硼酸，加水溶解后并硼酸，加水溶解后并硼酸，加水溶解后并稀释至稀释至稀释至稀释至1000 mL1000 mL。4.11 4.11 氢氧化钠溶液（氢氧化钠溶液（氢氧化钠溶液（氢氧化钠溶液（400 g/L400 g/L）：）：）：）：称取称取称取称取40 g 40 g 氢氧化钠加水溶氢氧化钠加水溶氢氧化钠加水溶氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至解后，放冷，并稀释至解后，放冷，并稀释至解后，放冷，并稀释至100 m
22、L100 mL。4.12 4.12 硫酸标准滴定溶液（硫酸标准滴定溶液（硫酸标准滴定溶液（硫酸标准滴定溶液（0.0500 mol/L0.0500 mol/L）或盐酸标准滴定）或盐酸标准滴定）或盐酸标准滴定）或盐酸标准滴定溶液（溶液（溶液（溶液（0.0500 mol/L0.0500 mol/L）。）。）。）。4.13 4.13 甲基红乙醇溶液（甲基红乙醇溶液（甲基红乙醇溶液（甲基红乙醇溶液（1 g/L1 g/L）：称取）：称取）：称取）：称取0.1g 0.1g 甲基红，溶于甲基红，溶于甲基红，溶于甲基红，溶于95%95%乙醇，用乙醇，用乙醇，用乙醇，用95%95%乙醇稀释至乙醇稀释至乙醇稀释至乙
23、醇稀释至100 mL100 mL。4.14 4.14 亚甲基蓝乙醇溶液（亚甲基蓝乙醇溶液（亚甲基蓝乙醇溶液（亚甲基蓝乙醇溶液（1 g/L1 g/L）：称取）：称取）：称取）：称取0.1g 0.1g 亚甲基蓝，溶亚甲基蓝，溶亚甲基蓝，溶亚甲基蓝，溶于于于于95%95%乙醇，用乙醇，用乙醇，用乙醇，用95%95%乙醇稀释至乙醇稀释至乙醇稀释至乙醇稀释至100 mL100 mL。试剂和材料试剂和材料4.15 4.15 溴甲酚绿乙醇溶液（溴甲酚绿乙醇溶液（溴甲酚绿乙醇溶液（溴甲酚绿乙醇溶液（1 g/L1 g/L）：称取）：称取）：称取）：称取0.1g 0.1g 溴甲溴甲溴甲溴甲酚绿，溶于酚绿，溶于酚绿
24、，溶于酚绿，溶于95%95%乙醇，用乙醇，用乙醇，用乙醇，用95%95%乙醇稀释至乙醇稀释至乙醇稀释至乙醇稀释至100 mL100 mL。4.16 4.16 混合指示液：混合指示液：混合指示液：混合指示液：2 2 份甲基红乙醇溶液（份甲基红乙醇溶液（份甲基红乙醇溶液（份甲基红乙醇溶液（4.134.13）与）与）与）与1 1 份亚甲基蓝乙醇溶液（份亚甲基蓝乙醇溶液（份亚甲基蓝乙醇溶液（份亚甲基蓝乙醇溶液（4.144.14）临用时混合。也可）临用时混合。也可）临用时混合。也可）临用时混合。也可用用用用1 1 份甲基红乙醇溶液（份甲基红乙醇溶液（份甲基红乙醇溶液（份甲基红乙醇溶液（4.134.13）
25、与）与）与）与5 5 份溴甲酚绿乙份溴甲酚绿乙份溴甲酚绿乙份溴甲酚绿乙醇溶液（醇溶液（醇溶液（醇溶液（4.154.15）临用时混合。）临用时混合。）临用时混合。）临用时混合。试剂和材料试剂和材料天平：感量为天平：感量为天平：感量为天平：感量为1mg1mg1mg1mg。定氮蒸馏装置：如图定氮蒸馏装置：如图定氮蒸馏装置：如图定氮蒸馏装置：如图自动凯氏定氮仪。自动凯氏定氮仪。自动凯氏定氮仪。自动凯氏定氮仪。仪器和设备仪器和设备称取称取称取称取充分混匀的固体试样充分混匀的固体试样充分混匀的固体试样充分混匀的固体试样0.2 g-2 g0.2 g-2 g、半固体试样、半固体试样、半固体试样、半固体试样 2
26、 g-5 g2 g-5 g 或或或或液体试样液体试样液体试样液体试样10 g-25 g10 g-25 g（约相当于（约相当于（约相当于（约相当于30 mg-40 mg 30 mg-40 mg 氮），精氮），精氮），精氮），精确至确至确至确至0.001 g0.001 g，移入干燥的，移入干燥的，移入干燥的，移入干燥的100 mL100 mL、250 mL250 mL 或或或或500 mL 500 mL 定氮瓶中，加入定氮瓶中，加入定氮瓶中，加入定氮瓶中，加入0.2 g 0.2 g 硫酸铜、硫酸铜、硫酸铜、硫酸铜、6 g 6 g 硫酸钾及硫酸钾及硫酸钾及硫酸钾及20 mL 20 mL 浓硫浓硫浓硫
27、浓硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以4545角斜支于有角斜支于有角斜支于有角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热液体呈蓝
28、绿色并澄清透明后，再继续加热液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5 h-1 h0.5 h-1 h。取下放冷，小心加入取下放冷，小心加入取下放冷，小心加入取下放冷，小心加入20 mL 20 mL 水。放冷后，水。放冷后，水。放冷后，水。放冷后，移入移入移入移入100 mL 100 mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。再加水至刻度，混匀备用。再加水至刻度，混匀备用。再加水至刻
29、度，混匀备用。同时做试剂空白试验。同时做试剂空白试验。同时做试剂空白试验。同时做试剂空白试验。样品处理样品处理按图装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至按图装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至按图装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至按图装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至2/3 2/3 2/3 2/3 处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液（处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液（处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液（处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液（1 g/L1 g/L1 g/L1 g/L）数）数）数）数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，滴及数毫升
30、硫酸，以保持水呈酸性，滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气加热煮沸水蒸气加热煮沸水蒸气加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。发生器内的水并保持沸腾。发生器内的水并保持沸腾。发生器内的水并保持沸腾。向接收瓶内加入向接收瓶内加入向接收瓶内加入向接收瓶内加入10.0 mL 10.0 mL 10.0 mL 10.0 mL 硼酸溶液硼酸溶液硼酸溶液硼酸溶液(4.10)(4.10)(4.10)(4.10)及及及及1 1 1 1 滴滴滴滴-2-2-2-2 滴滴滴滴混合指示液并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样混合指示液并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样混合指示液并使冷凝管的下端插入液面下，根据试
31、样混合指示液并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取中氮含量，准确吸取中氮含量，准确吸取中氮含量，准确吸取2.0 mL-10.0 mL2.0 mL-10.0 mL2.0 mL-10.0 mL2.0 mL-10.0 mL（旧（旧（旧（旧10101010）试样处试样处试样处试样处理液由小玻杯注入反应室，以理液由小玻杯注入反应室，以理液由小玻杯注入反应室，以理液由小玻杯注入反应室，以10 mL10 mL10 mL10 mL水洗涤小玻杯并使水洗涤小玻杯并使水洗涤小玻杯并使水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将之流入反应室内，随后塞紧棒状玻
32、塞。将之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将10.0 mL 10.0 mL 10.0 mL 10.0 mL 氢氢氢氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。紧螺旋夹，开始蒸馏。紧螺旋夹，开始蒸馏。紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏蒸馏蒸馏蒸馏蒸馏蒸馏10 min1
33、0 min (旧旧旧旧5 5）后移动蒸馏液接收瓶，液面后移动蒸馏液接收瓶，液面后移动蒸馏液接收瓶，液面后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏离开冷凝管下端，再蒸馏离开冷凝管下端，再蒸馏离开冷凝管下端，再蒸馏1 min1 min。然后用少量。然后用少量。然后用少量。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其中以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其中以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其中以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其
34、中2 2 份甲基红乙醇溶液与份甲基红乙醇溶液与份甲基红乙醇溶液与份甲基红乙醇溶液与1 1 份亚甲基蓝乙醇溶液份亚甲基蓝乙醇溶液份亚甲基蓝乙醇溶液份亚甲基蓝乙醇溶液指示剂，指示剂，指示剂，指示剂，颜色由紫红色变成灰色，颜色由紫红色变成灰色，颜色由紫红色变成灰色，颜色由紫红色变成灰色，pH 5.4pH 5.4；1 1 份甲基红乙醇溶液与份甲基红乙醇溶液与份甲基红乙醇溶液与份甲基红乙醇溶液与5 5 份溴甲酚绿乙醇溶液指份溴甲酚绿乙醇溶液指份溴甲酚绿乙醇溶液指份溴甲酚绿乙醇溶液指示剂，示剂，示剂，示剂，颜色由酒红色变成绿色，颜色由酒红色变成绿色，颜色由酒红色变成绿色，颜色由酒红色变成绿色，pH 5.1
35、pH 5.1。同时同时同时同时作试剂空白。作试剂空白。作试剂空白。作试剂空白。接收、滴定接收、滴定分析结果的表述分析结果的表述X 试验中蛋白质含量，g/100g（旧标准中有g/100 mL）V1 试样消耗硫酸或盐酸标准滴定溶液的体积，mLV2 空白消耗硫酸或盐酸标准滴定溶液的体积，mL V3 吸取消化液的体积，单位为毫升（mL）c 硫酸或盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/Lm 试样质量，g分析结果的表述分析结果的表述0.0140 1.0 mL0.0140 1.0 mL0.0140 1.0 mL0.0140 1.0 mL 硫酸硫酸硫酸硫酸c(1/2H2SO4)c(1/2H2SO4)1.000 mo
36、l/L1.000 mol/L或或或或盐酸盐酸盐酸盐酸c(HCl)c(HCl)1.000 mol/L1.000 mol/L标准滴定溶液相当的氮的标准滴定溶液相当的氮的标准滴定溶液相当的氮的标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为克（质量，单位为克（质量，单位为克（质量，单位为克（g g）；）；）；）；MM 试样的质量，单位为克（试样的质量，单位为克（试样的质量，单位为克（试样的质量，单位为克（g g）；）；）；）；F F 氮换算为蛋白质的系数。一般食物为氮换算为蛋白质的系数。一般食物为氮换算为蛋白质的系数。一般食物为氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.256.25；纯；纯；纯；纯乳与纯乳制品为乳与纯乳
37、制品为乳与纯乳制品为乳与纯乳制品为6.386.38；面粉为；面粉为；面粉为；面粉为5.705.70；玉米、高粱为；玉米、高粱为；玉米、高粱为；玉米、高粱为6.246.24；花生为；花生为；花生为；花生为5.465.46；大米为；大米为；大米为；大米为5.955.95；大豆及其粗加工制品为；大豆及其粗加工制品为；大豆及其粗加工制品为；大豆及其粗加工制品为5.715.71；大豆蛋白制品为；大豆蛋白制品为；大豆蛋白制品为；大豆蛋白制品为6.256.25；肉与肉制品为；肉与肉制品为；肉与肉制品为；肉与肉制品为6.256.25；大麦、；大麦、；大麦、；大麦、小米、燕麦、裸麦为小米、燕麦、裸麦为小米、燕麦
38、、裸麦为小米、燕麦、裸麦为5.835.83；芝麻、向日葵为；芝麻、向日葵为；芝麻、向日葵为；芝麻、向日葵为5.305.30；复合复合复合复合配方食品为配方食品为配方食品为配方食品为6.256.25。乳制品中蛋白质的含量要结合具体的产品标准进行转乳制品中蛋白质的含量要结合具体的产品标准进行转乳制品中蛋白质的含量要结合具体的产品标准进行转乳制品中蛋白质的含量要结合具体的产品标准进行转换和计算。换和计算。换和计算。换和计算。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，术平
39、均值表示，术平均值表示，术平均值表示，蛋白质含量蛋白质含量蛋白质含量蛋白质含量1 g/100 g 1 g/100 g 时，结时，结时，结时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量果保留三位有效数字；蛋白质含量果保留三位有效数字；蛋白质含量果保留三位有效数字；蛋白质含量1 g/100 g 1 g/100 g 时，结果保留两位有效数字。时，结果保留两位有效数字。时，结果保留两位有效数字。时，结果保留两位有效数字。结果表示结果表示 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算
40、术平均值的对差值不得超过算术平均值的对差值不得超过算术平均值的对差值不得超过算术平均值的10%10%。精密度精密度各步骤详解各步骤详解整个过程分四步：整个过程分四步：1、消化、消化2、蒸馏、蒸馏3、吸收与滴定、吸收与滴定4、计算、计算第一步：样品消化第一步：样品消化样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，使有机物中的物脱水。并破坏有机物，使有机物中的C、H氧化为氧化为CO2和和H2O蒸汽逸出，而蛋白质蒸汽逸出，而蛋白质则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。在酸性溶液中。下面注意几种试剂的作用：下面注意
41、几种试剂的作用：硫酸钾的作用：硫酸钾的作用：添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点一般纯硫酸加热沸点一般纯硫酸加热沸点一般纯硫酸加热沸点330330，而添加硫酸钾后，而添加硫酸钾后，而添加硫酸钾后，而添加硫酸钾后，温度可达温度可达温度可达温度可达400400，加速了整个反应过程。，加速了整个反应过程
42、。，加速了整个反应过程。，加速了整个反应过程。硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。浓硫酸的作用浓硫酸的作用:1 1、脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生成碳，碳将、脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生成碳，碳将、脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生成碳，碳将、脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生成碳，碳将H2SO4H2SO4还原为
43、还原为还原为还原为SO2SO2，本身则变为，本身则变为，本身则变为，本身则变为CO2CO22 2、氧化、氧化、氧化、氧化3 3、蛋白质与浓、蛋白质与浓、蛋白质与浓、蛋白质与浓H2SO4H2SO4生成生成生成生成NH3NH3，CO2CO2，SO2SO2，H2OH2O4 4、与、与、与、与NH3NH3生成硫酸铵生成硫酸铵生成硫酸铵生成硫酸铵 其他试剂的作用其他试剂的作用硫酸铜，氧化汞或硒粉，催化剂，加快反应硫酸铜，氧化汞或硒粉，催化剂，加快反应硫酸铜，氧化汞或硒粉，催化剂，加快反应硫酸铜，氧化汞或硒粉，催化剂，加快反应速速速速度（但为了防止污染通常使用硫酸铜，所以有度（但为了防止污染通常使用硫酸铜
44、，所以有度（但为了防止污染通常使用硫酸铜，所以有度（但为了防止污染通常使用硫酸铜，所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，还可机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，还可机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，还可机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，还可以作为碱性反应指示剂）。以作为碱性反应指示剂）。以作为碱性反应指示剂）。以作为碱性反应指示剂）。有的加少量过氧化氢、次氯酸钾作为氧化剂。有的加少量过氧化氢、次氯酸钾作为氧化剂。有的加少量过氧化氢、次氯酸钾作为氧化剂。有的加少量过氧化氢、次氯酸钾作为氧化剂。50%NaOH50%NaOH的作用的作用的作用的作用 蒸馏时使溶液呈碱性蒸馏时使溶液呈碱性蒸馏时
45、使溶液呈碱性蒸馏时使溶液呈碱性 第二步第二步蒸馏：样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中。作中。作中。作中。一是加入氢氧化钠溶液要过量，如果一是加入氢氧化钠溶液要过量，如果一是加入氢氧化钠溶液要过量，如果一是加入氢氧化钠溶液要过量，如果NaOHNaOH量加量加量加量加的不够就变成的不够就变成的不够就变成的不够就变成H2SH2S，H2S H2S是强酸，使颜色变红。是强酸，使颜色变红。是强酸，使颜色变红。是强酸，使颜色变红。二是要防止样液中氨气逸出。二是要防止样液中
46、氨气逸出。二是要防止样液中氨气逸出。二是要防止样液中氨气逸出。第三步第三步吸收与滴定：吸收与滴定：蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量。过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量。过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量
47、。过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量。（全量）（全量）（全量）（全量）半微量或微量定氮半微量或微量定氮半微量或微量定氮半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。（变色反应，它有吸收氨的作用。（变色反应，它有吸收氨的作用。（变色反应，它有吸收氨的作用。（用硼酸代替用硼酸代替用
48、硼酸代替用硼酸代替H2SO4H2SO4，这样可省略了反滴定，这样可省略了反滴定，这样可省略了反滴定，这样可省略了反滴定，H2SO4H2SO4是强酸，要求较严，是强酸，要求较严，是强酸，要求较严，是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在外硼酸为吸收液浓度在外硼酸为吸收液浓度在外硼酸为吸收液浓度在3%3%以上可将氨完全吸收，为保以上可将氨完全吸收，为保以上可将氨完全吸收，为保以上可将氨完全吸收，为保险起见一般用
49、险起见一般用险起见一般用险起见一般用4%4%）。）。）。）。实验注意事项实验注意事项uu1.1.样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。混合均匀。混合均匀。混合均匀。uu2.2.样品放入样品放入样品放入样品放入KK氏烧瓶时，不要粘在瓶颈上，万一粘附可用氏烧瓶时，不要粘在瓶颈上，万一粘附可用氏烧瓶时，不要粘在瓶颈上，万一粘附可用氏烧瓶时，不要粘在瓶颈上，万一粘附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。少量水缓慢冲下，以免被
50、检样消化不完全，使结果偏低。少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。uu3.3.消化时，如不容易呈透明溶液，可将消化时，如不容易呈透明溶液，可将消化时，如不容易呈透明溶液，可将消化时，如不容易呈透明溶液，可将KK氏烧瓶放冷后，氏烧瓶放冷后，氏烧瓶放冷后，氏烧瓶放冷后，加入加入加入加入30%30%过氧化氢催化剂过氧化氢催化剂过氧化氢催化剂过氧化氢催化剂23ml23ml，促使氧化。，促使氧化。，促使氧化。，促使氧化。uu4.4.在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使在整个消化过程中