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1、 1 妻 顾 工 花程 枕 釜 、。生塑 墨生型 1 2 1=Q 口服轮状 病毒活疫苗规 模化生产工艺研究 魏至 栋,李 红 万文 辉,郜 勇,鱼 柯 刘 溯,王玉 琳 ,班 丁 呈 一制品研究 所疫苗一室,兰 I 7 3 0 0 4 6)2-15 1 服 轮状病 毒 活疫 苗是 我所 自行 开发研 制 的 国家 一类 新 药,1 9 9 8年 6月 取 得试 生 产文 号,疫苗 生 产采用 2 L方瓶 静止培 养,批量 生 产需 要 大 量 方瓶,操作 较繁 琐,易造 成污 染,且 产量及病毒滴度相对较低,不适宜规模化生产。2 0 0 0年初我们对生产工艺尤其是规模化大 转瓶 培 养 工 艺
2、进 行 了摸 索、改进 和优 化,与静 止 方 瓶 相 比,不但降 低 了劳 动 强 度、简 化 了操 作,而且单产和病毒滴度稳定提高。现报告如下。材 料 和 方 法 1牛 肾 生 产用 牛 肾取 自当 臼出生 的健康 乳 牛,离体 时问 不超 过 2 4 h。2毒 种 生产用毒种为兰州生物制品研究 所分离的减毒羊轮状病毒 L L R毒株 3 培养液 细胞 培养液 主要 成份 为 A配方:除菌 过滤水 解乳 蛋 白 E a r l s 液(含 7种 Aa)+l O d x 牛 血清,B配方:高压灭菌 MEM+1 0 小牛血清;病毒维持培养液主要成份为 Iv l 1 9 9。4 细 胞 培养转
3、瓶机及 配套转 瓶 2 O瓶 位细胞 培养转 瓶机 为兰 州飞控 仪 器厂 出 品,细胞 培 养瓶 为 常规 生 产 l 5 L立 瓶,成 都玻璃仪器厂出品。5大 转 瓶工艺试 验 方法 5 1牛 肾的处 理 大量 灭菌蒸馏 水 冲洗后,用抗 生素 液 浸泡三 遍。5 2肾组 织的 消化 无菌取 肾皮质,剪成 2 mm 左右的小块。加入适宜浓度胰酶冷消化过夜。5 3 细胞制备 将已消化好 的组织 团块分散,制成细胞悬液,接种 1 5 L培养瓶,分别使用 A配方:除菌 过滤水解乳蛋 白 F a r l s(含 7种 Aa)+1 0 小牛血清,B配方:高压灭菌 ME M+1 0 小 牛血 清,置
4、3 7 转瓶 培养,逐 日镜 检 细胞生 长及成 片情 况。5 4 病毒接种和原液制造 将已生长成单层的细胞用 E a r l s 氏液淋洗后,接种经适宜的胰酶处理过的毒种。采用 接种病毒稀释液吸附感染单层细胞后,补加病毒培养维持液(单层吸附接种),或采用已处理 的毒种直接加到病毒培养维持液 中,一次性分装到单层细胞瓶中(混种);置 3 7 C旋转培养,逐 日观察 C P E,待 C P E达到一定程度后,收获第一 次病 毒原液、取样检定,如细胞生长情况 维普资讯 http:/ 生塑 墨 塑!=Q 5 5 良好,再加入适量病毒维持液培养,隔 日收获第二次病毒原液、取样检定。病毒原液置 2 8
5、E保存。5 5 半 成 品及 成 品制造 检定合格的病毒原液合并后,用简式滤器澄清除菌,按适宜 比例加入甜昧剂,分装,检定 合格即为成品。5 6检定 原液、半成品和成 品检定 均按 IS 1 服轮状病毒活疫苗制检规程 进行 病毒滴定采用 C CI D 法。试 验 结 果 1 比较 细胞 培 养液 A和 B培 养 细胞 生长 情况 牛肾组 织分化 程度较 高,细胞不 易贴瓶 分 裂,给组 织培 养 带来 了困难。方瓶 静止 培养,使用细胞 养 液 l j,但用 于转 瓶培养,细胞 生 长较 缓,需 要 23次换 液才 能形 成单 层,而 用 细胞培养液 A,细胞成片较快,只需换液 1次,即可形成
6、单层。在其他条件基本相同情况(细 胞悬液密度、p H牛血清等)下,多次对同一批细胞用两种培养液进行培养比较,见表 1。表 1两种 细胞 培 养 液制 备 胎 牛 肾细 胞 的 比 较 注:】多投重复试验结果一致 2“+”表 示细 胞致 密性 结果表明:除菌过滤水解乳蛋白 E a r l s 液(含 7种 A a)营养物质损失较少,适合肾细胞 生长,促进 了细胞 增殖 速度,细胞 容易成 片。2 病毒 感染方 式 的选 择 其 他条 件基本相 同(细 胞致 密度、接 种 比例、加液 量 等),进行 单 层 吸附 接种 与混 种 的 比 较,病毒原液滴度无明显差异。见图 1由于混种制备疫苗的滴度也
7、能达到相应的高度,而且 简化了操作、也降低了污染的机率,更适宜太转瓶培养,所以选择直接将毒种加到病毒维持 培养液 中混 种。3 病 毒原 液收 获次数 在病毒原液单收基础上,转瓶培养进行 了两次收获病毒原液试验。当病毒培养出现明 显病变:黑色颗粒增多,病变细胞 占细胞总数的 6 0 7 0 时,收获第一次病毒原液;再加 入 1 9 9液培育一定时间后,收获第二次病毒原液。见表 2,表明既增加了单产、降低 了成本,二收病毒原 液的滴度也台乎要求。与方瓶培养一收和二收的结果比较,再次证明转瓶培养 优于方 瓶静 止 培养,见表 3。维普资讯 http:/ 5 6 6 5 I 6 0 8。生塑 墨生型
8、!=垫 单层暇附接种 混种 5 7 S 5 5 6 5 6 5 6 0 批号 4 0 1 4 o 2 4 0 0 4 0 5 0 6 4 0 8 4 0 9 4 1 o ”图 1单层 吸 附 接 种 与 混种 的 比较 表 2大 转 瓶培 养 一 收和 二 收试 验 结 果 批 号 病 毒 原 液滴 度】c)g(l I ll ml 一收 二收 2 0 0 0 0 5 3 2 0 0 0 0 5 0 5 2 0 0 o O 5 0 7 2 0 o O 0 51 l 2 0 0 0 0 51 0 2 0 0 0 06 l 6 2 o o 0 0 61 9 2 0 0 0 0 7 0 3 2 7 0
9、 9 2 00 0 0 7 1 2 6 5 6 5 6 0 5 5 5 5 6 5 5 7 5 5 O 5 0 5 0 科 7 7 6矗 5 5 臂毒 原 液 滴度 =:巾 巾 6 6 6 6 6 6 维普资讯 http:/ 生 物制 品年 刊 1 9 9 9 2 0 0 0 表 3方瓶培养一收与二收的结果 5 7 批 号 病 毒 原液 滴 度 I c ,C CI D n l 收 二收 4 大转 瓶培 养疫 苗生产成 品 的结果 通过工 艺 调整 及试验 优化,建 立 了切 实可行 的基本 工艺。成 品结 果见表 4。表 4大 转瓶 疫 苗 生 产检 定 结 果 5 大转 瓶培养 工艺流 程简
10、 图 牛肾消 毒一 解 剖取 肾皮质一 玲消 化一 分 散细胞一 换液 一单层 细胞一洗 换一接 种病毒一 一收病 毒原 液及检 定一二 收病 毒原液 及检 定一 半成 品配制 一 分装一 成 品检 定 讨论 口服轮状病毒活疫苗的最初工艺为方瓶静止培养,牛 肾处理采用含抗生素的生理盐水 多次冲洗消毒,热消化牛肾组织制备细胞悬液,接种到大转瓶培养,经 2 3次换液形成单层 细胞,生理盐水浸洗细胞面,单层吸附接种病毒,合并、澄清超滤浓缩病毒原液后,加甜味剂 维普资讯 http:/ 堡堑型墨千 j!塑=垫 配制成半成品,分装至成品的工艺。经工艺改进后,牛肾处理采用抗生素液浸泡消毒,有效 地降低 了污
11、染,冷消化牛肾组织,有利于工作时间的调配和疫苗质量的控制,玻璃珠摇散细 胞团块制备细胞悬液 以及混 种感染细胞单层,简化 了操 作、易于掌握,降低了污染 的机率。细胞培养液的改变,减少了换液次数,形成单层细胞 的时间也缩短,病毒在 细胞 的增殖代谢 高峰期复制,获得 了高滴度的收获物。由每对牛肾方瓶单产 7 0 0 0 ml 左右提高到转瓶 1 8 0 0 0 m1 左右,且病毒原液不用超滤浓缩就能达到所要求的滴度,重复性好、病毒滴度稳定保持在 高水平线上。通过对乳牛肾细胞培养液的改进,病毒感染方式的选择,病毒收获次数等试验,制备出 了高滴 度 的病 毒原 液,并建 立 了疫苗 大批 量 生产的基本工 艺。此 生 产工艺 生产成 本低、投人 产 出率 高,便 于操 作,所 用 原材 料 规 范,质 量 易于控 制,具 有 较 明显 的技术 优 势 和切 实 可行 性。生产的口服轮状病毒活疫苗质量稳定可靠。参考文献(1 u服 鞋壮病 毒活 疫 曲 制造 搜箍 宅规 程 2 组 纽培 莽技 术 鄂征 主 编 卫q 版社1 9 9 8 (3 病 毒 学 (演 D O怀 持 F 芽纳 著科学 出版 社 1 9 9 0 维普资讯 http:/