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1、基因诊断基因诊断PCR与基因诊断技术基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶的作用，可在3个小时内把特定的DNA片段扩增1000万倍。九十年代中期PCR临床应用在国内全面开展，1998年，荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。基因诊断基因诊断基因基因蛋白质蛋白质性状性状生化生化诊断诊断基因基因诊断诊断临床临床诊断诊断方法方法优点优点缺点缺点显微镜镜检显微镜镜检简单易行，可直接观察到简单
2、易行，可直接观察到寄生虫的形态寄生虫的形态速度慢，灵敏度低，对经速度慢，灵敏度低，对经验水平要求高费时费工，验水平要求高费时费工，无法辨别形态相近的寄生无法辨别形态相近的寄生虫虫体外培养、接种体外培养、接种能检测到活的寄生虫，并能检测到活的寄生虫，并可检测感染性和感染程度可检测感染性和感染程度速度慢、花费高，寄生虫速度慢、花费高，寄生虫可能难以进行体外培养，可能难以进行体外培养，且必须使用动物材料且必须使用动物材料抗体检测抗体检测简单、快速、能够实现自简单、快速、能够实现自动化，可用于检测大量的动化，可用于检测大量的样品样品无法区分活的寄生虫与处无法区分活的寄生虫与处在潜伏状态的寄生虫。有在潜
3、伏状态的寄生虫。有时会有非特异反应发生时会有非特异反应发生DNADNA杂交及杂交及PCRPCR快速灵敏，能够实现自动快速灵敏，能够实现自动化，可以分辨不同种的寄化，可以分辨不同种的寄生虫，不需要以前有寄生生虫，不需要以前有寄生虫感染病史虫感染病史花费高，步骤多，无法区花费高，步骤多，无法区分活的和死的寄生虫，有分活的和死的寄生虫，有时会有假阳性或假阴性时会有假阳性或假阴性 检测寄生虫感染的诊断方法的比较基因诊断的特点基因诊断的特点特异性高特异性高检测目标是基因，为原始的致病因素检测目标是基因，为原始的致病因素灵敏度高灵敏度高待测标本往往微量，目的基因只需待测标本往往微量，目的基因只需pg水平水
4、平稳定性高稳定性高基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需处于活性状态处于活性状态诊断范围广，适应性强诊断范围广，适应性强确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态临床应用前景好临床应用前景好基因诊断优点基因诊断优点从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制显著提早产前诊断的时间显著提早产前诊断的时间无需对组织、器官或细胞进行选择无需对组织、器官或细胞进行选择快捷准确、安全快捷准确、安全基因诊断常用的技术基因诊断常用的技术核酸分子杂交核酸分子杂交PCRPCR（聚合酶链式反应）（聚合酶链式
5、反应）限制性酶切分析限制性酶切分析SSCPSSCP（单链构象多态性分析）（单链构象多态性分析）DNADNA 测序测序 DNADNA 芯片技术芯片技术DNADNA Southern blot,FISH,PCR,Sequencing,Southern blot,FISH,PCR,Sequencing,micoarray,restriction analysis,RFLPmicoarray,restriction analysis,RFLP，SSCPSSCPRNARNA Northern blot,RT-PCR,micoarraysNorthern blot,RT-PCR,micoarraysPro
6、teinProtein Western blot,Immuno-histochemistry,Western blot,Immuno-histochemistry,microarray microarray 基因诊断的原理基因诊断的原理利用分子生物学和分子遗传学的技术，从利用分子生物学和分子遗传学的技术，从DNADNA或或RNARNA水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态，从水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态，从而对疾病做出诊断的方法而对疾病做出诊断的方法策略策略检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因检测与某种遗传标志连锁的的致病基因检测与某种遗传
7、标志连锁的的致病基因检测表型克隆基因检测表型克隆基因感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断 遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断肿瘤的诊断 法医学鉴定法医学鉴定分子诊断的临床应用分子诊断的临床应用一、一、感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断l利利用用PCR技技术术或或PCR与与分分子子杂杂交交标标记记相相结结合合，可可以以快快速速准准确确地地检检测测出出病原性物质。病原性物质。疟疾的分子诊断：疟疾的分子诊断：检测是否存在疟原虫检测是否存在疟原虫1.抽取血样进行镜检抽取血样进行镜检 2.免疫诊断免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体检测疟原虫蛋白或抗体 无法区分是以前感染还是现在感染无法区分是以前感
8、染还是现在感染3.DNA杂交诊断杂交诊断例一：例一：PCR检测检测针对针对疟原虫特有的一段疟原虫特有的一段188bp的的DNA序列设序列设计引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到计引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到188bp的条带的条带原位原位PCR(in situ PCR,ISPCR)在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩增，并通过原位杂交进行检测增，并通过原位杂交进行检测不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细胞中定位胞中定位二、遗传性疾病的诊断二、遗传性疾病的诊断羊水和胎盘绒毛膜检测镰刀形细胞贫
9、血症镰刀形细胞贫血症(sickle-cell anemia)典型的单基因遗传性疾病典型的单基因遗传性疾病 血红蛋白的血红蛋白的链（链（珠蛋白）的第六个氨基酸珠蛋白）的第六个氨基酸Glu发发生突变成生突变成Val血红蛋白血红蛋白 -链上链上 谷氨酸谷氨酸变成变成缬氨酸缬氨酸 英国女王维多利亚。她带有英国女王维多利亚。她带有英国女王维多利亚。她带有英国女王维多利亚。她带有血友病基因血友病基因血友病基因血友病基因，并将其传给了她的儿女。血友病是一种，并将其传给了她的儿女。血友病是一种，并将其传给了她的儿女。血友病是一种，并将其传给了她的儿女。血友病是一种遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血
10、不止导致死亡。血友病在女性一遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性一遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性一遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性一般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会
11、者有症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有1717人是她的后裔，人是她的后裔，人是她的后裔，人是她的后裔，其中有她的孙女亚历山德拉（其中有她的孙女亚历山德拉（其中有她的孙女亚历山德拉（其中有她的孙女亚历山德拉（2121），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿子），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿子），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿子），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿子患有血友病。患有血友病。患有血友病。患有血友病。血友病血友病血
12、友病血友病基基基基 因因因因三、法医学应用三、法医学应用vDNA指纹指纹v每个人体细胞内都含有每个人体细胞内都含有23对对染色体，每条染色体中部含有染色体，每条染色体中部含有一个一个DNA分子，分子，DNA分子中分子中的核苷酸序列包含着遗传信息，的核苷酸序列包含着遗传信息，在在DNA分子中存在三种类型：分子中存在三种类型：单拷贝序列、中等程度重复序单拷贝序列、中等程度重复序列、高度重复序列、高度重复序每个重复序列在每个重复序列在300300个核苷酸长度之内，由于高度重复，序个核苷酸长度之内，由于高度重复，序列经过超离心后以卫星带出现在主要列经过超离心后以卫星带出现在主要DNADNA带的附近，所
13、以也带的附近，所以也称卫星称卫星DNADNA，其中的重复序列单元则称为，其中的重复序列单元则称为“小卫星小卫星DNA”DNA”“小卫星小卫星”具有高度的可变性，但在具有高度的可变性，但在“小卫星小卫星DNA“DNA“中有中有一小段序列则在所有个体中都一样，称为一小段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列核心序列”。如。如果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的DNADNA进行进行分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们与人的指纹分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们与人的指纹一样具有专一性和特异性，因此称作一样具有专一性和特异性，因此称作
14、“DNADNA指纹指纹”通过对人类基因组的解析，发现人与人之间通过对人类基因组的解析，发现人与人之间99999999的碱的碱基序列都相同，而剩下的基序列都相同，而剩下的0.01%0.01%的碱基特征序列则来自于双的碱基特征序列则来自于双亲，据此可用于亲，据此可用于“亲子鉴定亲子鉴定”滴骨验亲法：滴骨验亲法：以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨内，以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨内，浸入的则被认为两者有血缘关系，在各种古籍中有浸入的则被认为两者有血缘关系，在各种古籍中有多种记录。多种记录。三国时代（公园三国时代（公园220220280280年）谢承著年）谢承著会稽先会稽先贤传贤传中的中的
15、以弟血滴兄骨以弟血滴兄骨可能是记录此法的最可能是记录此法的最早的史料：陈业的哥哥因海难不幸殒命，当时一同早的史料：陈业的哥哥因海难不幸殒命，当时一同遇难的有五六十人，并且尸体都已严重腐败而无法遇难的有五六十人，并且尸体都已严重腐败而无法辨认死者的身份。陈业就用刀刺破自己的手臂将血辨认死者的身份。陈业就用刀刺破自己的手臂将血分别滴在尸骨上，发现其血液只能浸入一具尸骨，分别滴在尸骨上，发现其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陈业就这样确认其兄的尸骨。其余皆不能。陈业就这样确认其兄的尸骨。合血法：合血法：等到了明代，更是采用了等到了明代，更是采用了“合血法合血法”来识别亲来识别亲权。明末清初的检验书
16、籍中都有相同的记载：权。明末清初的检验书籍中都有相同的记载：“亲亲子兄弟或自幼分离，欲相认识。难辨真伪。命各刺子兄弟或自幼分离，欲相认识。难辨真伪。命各刺出血，滴一器内，真则共凝为一，否则不凝也。出血，滴一器内，真则共凝为一，否则不凝也。”方法：方法：DNADNA指纹是指对待测样品中的指纹是指对待测样品中的DNADNA进行分析所得到的具有特进行分析所得到的具有特征性的征性的DNADNA分子杂交图谱分子杂交图谱最常用的最常用的DNADNA探针是微卫星序探针是微卫星序列列受害者血样受害者血样犯罪嫌疑人犯罪嫌疑人衣物上血样衣物上血样犯罪嫌疑犯罪嫌疑人血样人血样 在细胞内核酸代谢的异常在细胞内核酸代谢
17、的异常:肿瘤细胞和正常细胞的核酸代谢有显著的不同；肿瘤细胞和正常细胞的核酸代谢有显著的不同；不同类型肿瘤细胞的核酸代谢也有较大的差异；不同类型肿瘤细胞的核酸代谢也有较大的差异；相同恶性程度肿瘤细胞的核酸代谢也有所不同。相同恶性程度肿瘤细胞的核酸代谢也有所不同。肿瘤是一种分子病肿瘤是一种分子病三、基因诊断与肿瘤三、基因诊断与肿瘤 癌基因的激活癌基因的激活 抑癌基因的失活（或缺失）抑癌基因的失活（或缺失）肿瘤发生机理肿瘤发生机理原癌基因原癌基因癌基因癌基因病毒癌基因病毒癌基因 肿瘤抑制基因肿瘤抑制基因 肿瘤转移相关基因肿瘤转移相关基因 肿瘤耐药基因等肿瘤耐药基因等肿瘤相关基因肿瘤相关基因细胞基因组
18、中具有能够使正常细胞发生细胞基因组中具有能够使正常细胞发生恶性转化的基因恶性转化的基因 癌基因在正常细胞的基因组中癌基因在正常细胞的基因组中 存在存在 不表达状态不表达状态 表达水平不足以引起细胞的恶性转化表达水平不足以引起细胞的恶性转化癌基因：癌基因：能能 够够 抑抑 制制 细细 胞胞 恶恶 性性 转转 化化 或或 抑抑 制制 细细 胞胞 异异 常常 增殖的基因增殖的基因 目前研究较多的有目前研究较多的有p53p53基因、基因、pRBpRB基因、基因、p16p16蛋白、蛋白、p15p15蛋白、蛋白、p21p21等。等。抑癌基因抑癌基因包括肿瘤转移促进基因或肿瘤转移抑制包括肿瘤转移促进基因或肿
19、瘤转移抑制 基因基因。肿瘤转移相关基因肿瘤转移相关基因其表达使肿瘤细胞对药物产生耐药的其表达使肿瘤细胞对药物产生耐药的基因。基因。肿瘤耐药基因肿瘤耐药基因 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断目前主要集中在以下几个方面：肿瘤转移标志物肿瘤抗药基因突变的癌基因肿瘤相关的病毒基因肿瘤基因的分子诊断意义肿瘤基因的分子诊断意义 1.1.肿瘤的早期诊断和筛选肿瘤的早期诊断和筛选2.2.肿瘤疗效监测肿瘤疗效监测 3.3.肿瘤的预后判断肿瘤的预后判断 4.4.肿瘤微转移检测肿瘤微转移检测 美国前副总统汉弗莱美国前副总统汉弗莱Humphrey)Humphrey)在在19671967年发现膀胱内有一肿物，
20、病理切片未发现癌细胞年发现膀胱内有一肿物，病理切片未发现癌细胞 良性良性“慢性增生性囊肿慢性增生性囊肿”，未进行手术治疗。，未进行手术治疗。九年后，他被诊断为患有九年后，他被诊断为患有“膀胧癌膀胧癌膀胧癌膀胧癌”，两年后死于该病。，两年后死于该病。19941994年，研究者用灵敏的年，研究者用灵敏的PCRPCR技术对上述汉弗莱技术对上述汉弗莱19671967年的病理切片进行了年的病理切片进行了P53P53抑癌基因检查，发现那时的组抑癌基因检查，发现那时的组织细胞虽然在形态上还没有表现出恶性变化，但其织细胞虽然在形态上还没有表现出恶性变化，但其P53P53P53P53基因的第基因的第基因的第基因的第227227227227个密码个密码个密码个密码子子子子已经发生了一个核苷酸的突变。已经发生了一个核苷酸的突变。就是这个基因的微小变化，使其抑癌功能受损，导致就是这个基因的微小变化，使其抑癌功能受损，导致九年后细胞癌变的发生。这说明，在典型症状出现之九年后细胞癌变的发生。这说明，在典型症状出现之前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表现出前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表现出来了来了P53P53抑癌基因抑癌基因