《基因诊断》PPT课件.ppt

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1、第第1010章章 基因诊断基因诊断Contents基因诊断概念、策略基因诊断概念、策略1基因诊断技术基因诊断技术2直接基因诊断直接基因诊断3间接基因诊断间接基因诊断（连锁分析）（连锁分析）4第一节第一节 基因诊断概念、应用技术基因诊断概念、应用技术第二节第二节 基因诊断方法及实例基因诊断方法及实例基因诊断：基因诊断：利用分子生物学技术从利用分子生物学技术从DNADNA水平检测人类遗传性疾病的基水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷，又称因缺陷，又称DNADNA分析法。分析法。传统的疾病诊断：表现型传统的疾病诊断：表现型基因型基因型 基因诊断：基因型基因诊断：基因型表现型（逆向诊断）表现型（逆向诊断）

2、基因诊断的优势和意义：基因诊断的优势和意义：1不受材料来源影响不受材料来源影响-微量微量外周血、活体穿刺组织、孕妇羊水绒毛、男性精斑等外周血、活体穿刺组织、孕妇羊水绒毛、男性精斑等2症状前诊断症状前诊断尤其对于一些延迟显性疾病如尤其对于一些延迟显性疾病如Huntingtong舞蹈病舞蹈病3产前基因诊断产前基因诊断避免遗传病患儿出生，提高人口质量避免遗传病患儿出生，提高人口质量第一节第一节 基基 因因 诊诊 断断 技技 术术Southern-blotNorthern-blot基基 因因 诊诊 断断 技技 术术斑斑点点杂杂交交点样点样Probe-32P检测检测AB1 2 3 4斑斑点点杂杂交交or

3、等等位位基基因因特特异异性性寡寡核核苷苷酸酸_基基 因因 诊诊 断断 技技 术术荧荧光光原原位位杂杂交交基基 因因 诊诊 断断 技技 术术荧荧光光原原位位杂杂交交基基 因因 诊诊 断断 技技 术术聚聚合合酶酶链链反反应应基基 因因 诊诊 断断 技技 术术多重多重PCR在一个在一个PCR体系中加入数对体系中加入数对PCR引物，覆盖区域不重叠引物，覆盖区域不重叠用于检测同一基因多个外显子的缺失用于检测同一基因多个外显子的缺失E1E2E3PCR为基础的诊断技术为基础的诊断技术基基 因因 诊诊 断断 技技 术术RT-PCR以以mRNA为模板，经逆转录酶合成为模板，经逆转录酶合成cDNA用于研究基因表达

4、用于研究基因表达使微量使微量mRNA迅速扩增，提高迅速扩增，提高mRNA检出的灵敏度检出的灵敏度实时定量实时定量PCR（real-timePCR）PCR-DGGE基基 因因 诊诊 断断 技技 术术PCR-SSCP（SingleStrandConformationPolymorphism）单链单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率的不电泳迁移率的不同。据此，可用于同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。失或插入的检测。基基 因因

5、 诊诊 断断 技技 术术-primer-32P-dNTP掺入掺入PCR扩增扩增产物产物变性变性单链单链DNA中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中性聚丙烯酰胺凝胶电泳12345自显影自显影1为正常为正常结果分析结果分析2、4、5为纯合患者为纯合患者3为杂合子为杂合子.PCR-SSCP技术应用举例：技术应用举例：v测序：测序：vdHPLC基基 因因 诊诊 断断 技技 术术基基 因因 诊诊 断断 技技 术术生生 物物 芯芯 片片筛查基因突变的方法比较筛查基因突变的方法比较方法方法优点优点缺点缺点Southern-blot大的缺失和重排大的缺失和重排费力，费事，消耗费力，费事，消耗DNA多多PCR-SSCP简单、

6、廉价简单、廉价适用于适用于200bp以内以内DNA片段突变片段突变筛查，不显示突变位置筛查，不显示突变位置定量定量PCR检测杂合子缺失检测杂合子缺失昂贵昂贵dHPLC迅速，高通量，定量迅速，高通量，定量设备昂贵，不能显示突变位置设备昂贵，不能显示突变位置测序、芯片测序、芯片高通量，突变可定性高通量，突变可定性昂贵昂贵检测已知基因突变的方法检测已知基因突变的方法点突变：酶切，测序，点突变：酶切，测序，ASOASO，测序，测序缺失、插入：缺失、插入：Southern-blot，测序，测序,多重多重PCR重复：酶切，测序重复：酶切，测序 第二节第二节 基因诊断方法及实例基因诊断方法及实例直接诊断直接

7、诊断直接直接检测致病基因的突变检测致病基因的突变基因突变类型基因突变类型缺失、点突变、重复、插入等缺失、点突变、重复、插入等间间接接诊诊断断应应用用DNA多多态态为为遗遗传传标标记记进进行行连连锁锁分分析析，确确定定待待测测者者是是否否得得到到带带有有致致病病的的染染色色体体，从从而而间接间接地作出诊断地作出诊断利用遗传标记利用遗传标记DNA多态多态RFLP、VNTR、SNPDNADNA分析中常用的遗传性多态性标记：分析中常用的遗传性多态性标记：q限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)：较大片段的插入缺失

8、，或碱较大片段的插入缺失，或碱基变异导致限制酶切点消失出现基变异导致限制酶切点消失出现酶切后产生不同长酶切后产生不同长度的度的DNA片段。片段。q可变数目串联重复可变数目串联重复(Variablenumbertandemrepeats,VNTR)：重复序列首尾相连，重复单位重复序列首尾相连，重复单位6-25bp小卫小卫星星DNA；2-6bp微卫星微卫星DNA；酶切酶切PCR扩增后可扩增后可产生长度差异；等位基因多，杂合度高。产生长度差异；等位基因多，杂合度高。q单核苷酸多态性单核苷酸多态性(Singlenucleiotidepolymorphism,SNP)：单个核苷酸的替代、缺失或插入，基因

9、组中含单个核苷酸的替代、缺失或插入，基因组中含量丰富。量丰富。二、直接基因诊断及实例二、直接基因诊断及实例 直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或邻直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或邻近近DNADNA序列作为探针，进行序列作为探针，进行SouthernSouthern杂交，或通过杂交，或通过PCRPCR扩增产扩增产物（或酶切），以检测基因点突变、缺失、插入等异常性质。物（或酶切），以检测基因点突变、缺失、插入等异常性质。主要适用于主要适用于已知已知基因异常疾病的诊断。基因异常疾病的诊断。直接基因诊断直接基因诊断 突变型突变型遗传病的遗传病的直接直接基因诊断基因诊断e.g.e

10、.g.镰形细胞贫血的镰形细胞贫血的GeneGene诊断诊断-点突变点突变 blot blotMstIMstI识别识别CCTGAGG突变为突变为CCTGTGG后后不能识别，不能识别，限制酶切片段长度发生变化限制酶切片段长度发生变化 B.B.等位基因特异性寡核苷酸探针（等位基因特异性寡核苷酸探针（ASOASO）（Allele-specific-oligonucleotide Allele-specific-oligonucleotide）已知突变已知突变GeneGene部位和性质，合成寡核苷酸探针，部位和性质，合成寡核苷酸探针，3232P P标记，进行斑点杂交。标记，进行斑点杂交。Normal N

11、ormal Gene ProbeGene Probe与正常与正常 稳定杂交稳定杂交 Mutation Mutation S S Gene Probe Gene Probe与异常与异常S S 稳定杂交稳定杂交斑点杂交结果斑点杂交结果2代代2的基因型？的基因型？BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe1）地中海贫血的基因诊断地中海贫血的基因诊断 基因不同程度的缺失可引基因不同程度的缺失可引起不同类型的起不同类型的 地中海贫血地中海贫血。直接基因诊断直接基因诊断 缺失缺失型型遗传病的遗传病的直接直接基因诊断基因诊断Southernblot检测结果：检测结果：/-/-/-/-正常正常

12、缺缺1缺缺2缺缺3缺缺414kb10kb缺失缺失型遗传病的型遗传病的型遗传病的型遗传病的直接直接基因诊断基因诊断基因诊断基因诊断Southern-RFLPSouthern-RFLP 检测检测地贫地贫地中海贫血 珠蛋白基因部分缺失DMD的基因诊断的基因诊断DMD属属XRDMD基因是最大的致病基因，有基因是最大的致病基因，有79个外显子个外显子DMD基因突变主要以基因突变主要以缺失缺失为主，可涉及基因的不同部位为主，可涉及基因的不同部位E1E2E3缺失缺失型型型型遗传病的遗传病的遗传病的遗传病的直接直接基因诊断基因诊断基因诊断基因诊断病例外显子 1 2 3 4 5 6 7 8Pm343501364

13、76052bp535113缺失缺失型遗传病的型遗传病的型遗传病的型遗传病的直接直接基因诊断基因诊断基因诊断基因诊断 三、间接基因诊断方法及实例三、间接基因诊断方法及实例 当当致病基因致病基因虽然已知，但其虽然已知，但其异常性质异常性质未知时，或疾病未知时，或疾病GeneGene本身尚未知时，主要通过本身尚未知时，主要通过DNADNA多态的连锁分析间接地多态的连锁分析间接地作出诊断。作出诊断。v应用条件：应用条件：遗传标记遗传标记与易感与易感Gene在染色体上连锁在染色体上连锁v遗传标记：基因组遗传标记：基因组DNA多态，如多态，如RFLP,VNTR,SNP等。等。v连锁分析过程：连锁分析过程：

14、1、首先确定家系中、首先确定家系中先症者致病基因与先症者致病基因与DNA多态等位片段间多态等位片段间的连锁关系的连锁关系；2、检测家系成员、检测家系成员DNA多态性结果多态性结果3、分析待检者、分析待检者是否遗传到带有致病基因的染色体是否遗传到带有致病基因的染色体,间接推断间接推断患病情况患病情况。连锁分析连锁分析间接基因诊断间接基因诊断1 Southern blot-RFLP1 Southern blot-RFLP诊断诊断(PKU)(PKU)PAHPAH基因两侧有基因两侧有Msp1Msp1酶切位点酶切位点;用该酶消化可产生用该酶消化可产生23kb23kb、19kb 19kb 两种等两种等位片

15、段位片段;以以PAH cDNAPAH cDNA为探针为探针与与PKUPKU家系成员外周家系成员外周血血DNADNA杂交杂交间接基因诊断间接基因诊断v患者为患者为19kb片段的纯合子片段的纯合子,说明患者缺陷的说明患者缺陷的PAH基因与基因与19kb片段连锁片段连锁v其父、母亲缺陷的其父、母亲缺陷的PAH基因与基因与19kb片段连锁，其片段连锁，其23kb片片段与正常段与正常PAH基因连锁。基因连锁。vII2为23kb和和19kb片段的杂合子片段的杂合子,为表型正常的致病基因携为表型正常的致病基因携带者。带者。间接间接基因诊断基因诊断2 2 成年型多囊肾病的诊断成年型多囊肾病的诊断v例：成年型多

16、囊肾病例：成年型多囊肾病APKDAPKD，ADAD ，临床表现为腰痛，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。肾功能衰竭和尿毒症。vAPKDGeneAPKDGene定位定位16p1316p13，但，但致病基因致病基因尚未克隆，尚未克隆，基因产基因产物物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKD APKD GeneGene与与珠蛋白基因珠蛋白基因33端附近的一段小卫星端附近的一段小卫星DNADNA序列序列（3HVR3HVR）紧密连锁紧密连锁，因此，

17、可以通过，因此，可以通过RFLPRFLP连锁分析进行连锁分析进行诊断。诊断。间接基因诊断间接基因诊断以以3HVR为为探探针针，与与PvuII酶酶切切后后的的家家系系有有关关成成员的基因组员的基因组DNA进行进行SouthernBlot基因组基因组DNAPvuII酶切酶切DNA片段片段变性变性转膜转膜探针探针变性变性杂交杂交结果分析结果分析间接基因诊断间接基因诊断 1 2 1 2 3 4 5 间接基因诊断间接基因诊断结果分析结果分析 患者（I1、II1和II2）有片段,说明致病基因与片段连锁，并按孟德尔方式遗传。II5不含片段，产前诊断正常。间接基因诊断间接基因诊断间接基因诊断间接基因诊断甲型血

18、友病甲型血友病FVIII FVIII Bcl IBcl I多态片段多态片段已知甲型血友病已知甲型血友病XRXR，获得家系成员基因组获得家系成员基因组DNA,DNA,PCRPCR产物产物142bp142bp经经BclIBclI酶切，酶切，产物：产物：142bp142bp、99 bp99 bp、43bp43bp，电泳结果分析。电泳结果分析。甲型血友病诊断（甲型血友病诊断（PCRRFLP）间接基因诊断间接基因诊断II199bp其母其母(I2)的的99bp片段与缺陷基因连锁，片段与缺陷基因连锁，142bp片段与正常基因连锁；其父片段与正常基因连锁；其父(I3)142bp片段片段与正常基因连锁与正常基因

19、连锁II2为携带者；为携带者；II3为正常为正常.142bp99bp1 2123III 1间接基因诊断间接基因诊断-甲型血友病系谱甲型血友病系谱2 21 1结果分析结果分析1）先症者）先症者II1具有具有99bp片段而发病，该片段来自母亲。片段而发病，该片段来自母亲。2）II2有有142bp/99bp，为杂合子。，为杂合子。142bp来自父亲，为正常片来自父亲，为正常片段，段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。片段是来自母亲而成为携带者。3）1为为99bp片段；片段；如果是男性为患者（如果是男性为患者（99bp片段来自母亲）；片段来自母亲）；如果是女性为携带者（来自父母双方）。如果是女性为携

20、带者（来自父母双方）。间接基因诊断间接基因诊断PCR-VNTR单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（SNPSNP）SNP：发生在基因组中的单个核苷酸的替代：发生在基因组中的单个核苷酸的替代根据根据SNP在基因中的位置，分为：在基因中的位置，分为：基因编码区基因编码区SNP基因周边基因周边SNP基因间基因间SNP在人类基因组中每在人类基因组中每100300个核苷酸就有一个个核苷酸就有一个SNP单体型分析单体型分析v有时用一种酶和一个多态位点(RFLP,STR)不能提供可供分析的信息，需采用一种以上的酶结合几个多态信息分析。v采用同一条染色体上与疾病基因紧密连锁的多个位点的DNA多态片段的组合类型进行分

21、析，该分析方法称单体型分析（Haplotyping)间接基因诊断间接基因诊断-单体型连锁分析：PAH基因的HindIIISph I多态片段患儿患儿(II1)(II1)及其父母及其父母(I1,I2)(I1,I2)均为杂合子均为杂合子无法分析无法分析患儿的父亲患儿的父亲(I1)(I1)为纯为纯合子合子 无法分析无法分析无法分析无法分析 -单体型连锁分析单体型连锁分析(2)(2)：PAH基因的Hind III Sph I 多态片段与缺陷基因相连锁的单体型为与缺陷基因相连锁的单体型为：HS4.07.0II 34.07.04.07.0I 24.29.7II 14.07.04.27.0I 14.27.04

22、.07.0II 24.29.74.07.0HSHSII 2为正常，为正常，II 3为携带者为携带者分析分析：患儿1从母亲和父亲各获得一个突变型,从Hind 酶切结果看出：正常同胞3为纯合4.0kb,也是纯合体,故母亲H4.0kbS7.0kb 构成单体型，母亲为突变型，因此，母亲为突变单体型。v患儿1为杂合体，故父亲 为突变单体型；v母亲、和父亲、S7.0kb 为正常单体型。v2两个单体型分别为、（母）和、（父）正常个体；v3两个单体型分别为H（母）和、（父）携带者。间接基因诊断间接基因诊断基因诊断应用基因诊断应用1、临床诊断：、临床诊断：在遗传病的临床症状出现后所作的诊断。如，新生儿筛查1）一

23、般手段：病史采集、症状、体征、常规的实验室检查。）一般手段：病史采集、症状、体征、常规的实验室检查。2）特殊手段：系谱分析、核型分析、生化分析、）特殊手段：系谱分析、核型分析、生化分析、DNA分析分析2、症状前诊断：、症状前诊断：在遗传病的临床症状出现前所作的诊断。如，huntington舞蹈病舞蹈病3、产前基因诊断：、产前基因诊断：判断胎儿的染色体或基因等是否正常。4、植入前基因诊断：、植入前基因诊断：胚胎是否遗传正常产前基因诊断对象产前基因诊断对象1)夫妇之一有染色体畸变，特别是平衡易位携带者，或夫妇核型正常，但曾生育过染色体病患儿的孕妇；2)35岁以上的高龄孕妇；3)夫妇之一有先天性代谢

24、缺陷、开放性神经管畸形，或生育过这种患儿的孕妇；4)X连锁遗传病基因携带者孕妇；5)有原因不明的习惯性流产史的孕妇；羊水过多的孕妇；6)夫妇之一有致畸接触史的孕妇（病毒感染、药物、烟酒）；7)具有遗传病家族史，又系近亲婚配的孕妇。产前基因诊断方法产前基因诊断方法-获得胎儿获得胎儿DNADNAv非侵袭性方法：非侵袭性方法：B B超超;血清生化检测（血清生化检测（2121三体查三体查HCGHCG和和AFPAFP水平判断患儿风水平判断患儿风险）险）;胎儿有核红细胞分离胎儿有核红细胞分离;孕妇外周血血浆分离胎儿孕妇外周血血浆分离胎儿游离游离DNA.DNA.v侵袭性方法：侵袭性方法：检查胎儿核型或基因诊断：检查胎儿核型或基因诊断：7-87-8周取绒毛周取绒毛 16-1816-18周取羊水周取羊水 胎儿镜胎儿镜21三体产前诊断进展三体产前诊断进展v1 细胞遗传学水平细胞遗传学水平核型分析核型分析v2 分子细胞遗传学水平分子细胞遗传学水平FISHv3 分子遗传学水平分子遗传学水平荧光定量荧光定量PCR