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1、第十四章第十四章 附肢的发育和再生附肢的发育和再生概述概述v附肢发育的研究是发育生物学的一个重要课题。附肢发育的研究是发育生物学的一个重要课题。脊椎动物，特别是脊椎动物，特别是鸟类鸟类和和两栖类两栖类附肢（附肢（limb）的发）的发育包含了大量的、各种各样的育包含了大量的、各种各样的诱导作用诱导作用。v有尾类的蝾螈有尾类的蝾螈和和美西螈美西螈附肢具有附肢具有明显的再生能力明显的再生能力，是研究再生的是研究再生的极好模型极好模型。第一节第一节 脊椎动物附肢的发育脊椎动物附肢的发育v脊椎动物的附肢是一个脊椎动物的附肢是一个极其复杂的器官极其复杂的器官，每一，每一块骨和肌肉的位置都被精密地组织在一起
2、。块骨和肌肉的位置都被精密地组织在一起。v附肢在附肢在三个基本轴上是不对称的三个基本轴上是不对称的，但，但左前肢总左前肢总是和右前肢呈镜面对称是和右前肢呈镜面对称。v脊椎动物的附肢都是由脊椎动物的附肢都是由体壁中胚层体壁中胚层和和外部表皮外部表皮共同组成。共同组成。鸡翅内骨的排列模式及其不对称性鸡翅内骨的排列模式及其不对称性孵化孵化10天的完整鸡翅标本天的完整鸡翅标本示三个发育轴：近侧示三个发育轴：近侧-远侧轴、前后轴及背腹轴。远侧轴、前后轴及背腹轴。前部的前部的 后部的后部的 近侧的近侧的 远侧的远侧的 背侧的背侧的 腹侧的腹侧的 v在在所有的四足动物中所有的四足动物中，附肢发育的，附肢发育
3、的基本形态发生基本形态发生原则原则是相同的。是相同的。v构建一个附肢所需要的位置信息要在一个三维构建一个附肢所需要的位置信息要在一个三维（或包括时间在内的四维）的、相互协调的系统（或包括时间在内的四维）的、相互协调的系统中发挥作用。现在已鉴定了中发挥作用。现在已鉴定了一系列蛋白一系列蛋白，在附肢，在附肢近远轴近远轴、前后轴前后轴和和背腹轴背腹轴的形成过程中发挥作用。的形成过程中发挥作用。一、附肢的起源一、附肢的起源v脊椎动物的附肢在脊椎动物的附肢在起源起源上是由上是由胚胎体壁向外生长胚胎体壁向外生长形成形成的，主要是由来自的，主要是由来自中胚层的疏松间质形成的中胚层的疏松间质形成的中央核中央核
4、，以及来，以及来自外胚层的表皮自外胚层的表皮两大部分组成。两大部分组成。v附肢的原基称为附肢的原基称为附肢芽附肢芽（limb bud）。）。v附肢芽形成的附肢芽形成的位置在每一物种是恒定位置在每一物种是恒定的，由的，由Hox基因基因沿身体前后轴表达的水平决定。沿身体前后轴表达的水平决定。鸡胚胎的肢芽鸡胚胎的肢芽孵化后第三天胚胎孵化后第三天胚胎的侧面出现肢芽。的侧面出现肢芽。翅肢芽翅肢芽腿肢芽腿肢芽顶外胚层嵴顶外胚层嵴体节体节 附肢域附肢域v能形成一个附肢的所有细胞，称为能形成一个附肢的所有细胞，称为附肢域附肢域（limb field）或）或附肢场附肢场。v附肢域附肢域包括位于中央的、产生附肢本
5、身的包括位于中央的、产生附肢本身的中胚层细胞中胚层细胞（附（附肢盘，肢盘，limb disc）以及形成周围的）以及形成周围的躯干组织和肩带躯干组织和肩带/腰带细腰带细胞胞。v附肢域附肢域起初起初具有具有调节失去或增加部分附肢调节失去或增加部分附肢的能力，附肢域的能力，附肢域中的中的每个细胞都能被指令形成附肢的任意一部分每个细胞都能被指令形成附肢的任意一部分-调和等调和等能系统能系统。美西螈（美西螈（Ambystoma maculatum）的预定前肢场）的预定前肢场 视黄酸视黄酸视黄酸视黄酸RARA对于肢芽的向外生长具有重要的意义。用药物阻对于肢芽的向外生长具有重要的意义。用药物阻对于肢芽的向外
6、生长具有重要的意义。用药物阻对于肢芽的向外生长具有重要的意义。用药物阻断断断断RARA的合成，将抑制肢芽最初的形成。的合成，将抑制肢芽最初的形成。的合成，将抑制肢芽最初的形成。的合成，将抑制肢芽最初的形成。A，RA处理蝌蚪的尾巴引起肢的再生；C，RA处理促进肢芽的形成（箭头所指部位）。二、附肢的早期发育二、附肢的早期发育v附肢早期发育的附肢早期发育的第一个迹象：第一个迹象：v预定形成附肢的细胞从附肢域预定形成附肢的细胞从附肢域侧板中胚层侧板中胚层（附肢（附肢骨骼的前体骨骼的前体）和）和体节中胚层体节中胚层（附肢（附肢肌肉的前体肌肉的前体）分离出来，转变成一团间质细胞，这些间质细胞分离出来，转变
7、成一团间质细胞，这些间质细胞向侧面迁移到向侧面迁移到侧板中胚层和表皮之间侧板中胚层和表皮之间，牢固地贴，牢固地贴附于表皮内表面。附于表皮内表面。两栖类胚胎中附肢由中胚层起源的图解两栖类胚胎中附肢由中胚层起源的图解肢芽肢芽 肢芽肢芽v覆盖在间质细胞团表面的覆盖在间质细胞团表面的表皮变得稍微增厚表皮变得稍微增厚，同时被包裹，同时被包裹在内部的在内部的间质细胞团向外突出间质细胞团向外突出，形成，形成肢芽（肢芽（limb bud）。肢芽肢芽中胚层细胞中胚层细胞 成纤维细胞生长因子成纤维细胞生长因子 FGF10v形成预定附肢间质细胞中的形成预定附肢间质细胞中的侧板中胚层细侧板中胚层细胞胞提供提供肢芽形成
8、的信号肢芽形成的信号，这些细胞分泌的，这些细胞分泌的FGF10能够启动上皮和中胚层细胞之间的能够启动上皮和中胚层细胞之间的相互作用。相互作用。v含有含有FGF10的磁珠（的磁珠（bead）异位放置于上皮异位放置于上皮下方，会诱导出额外的肢芽。下方，会诱导出额外的肢芽。FGF10的表达及其在鸡肢发育过程中的作用的表达及其在鸡肢发育过程中的作用三、前肢和后肢的特化三、前肢和后肢的特化vGain-of-function实验结果表明，转录因子实验结果表明，转录因子TBX4和和TBX5分别与分别与后肢后肢和和前肢前肢的特化有的特化有关。关。vLoss-of-function资料也表明，人类资料也表明，人
9、类TBX5基基因缺失因缺失会导致会导致上肢和心脏的异常上肢和心脏的异常，但，但下肢下肢基本不受影响基本不受影响。TBX4 和和TBX5在肢型特化中的作用在肢型特化中的作用TBX4和和TBX5在在FGF10诱导形成的肢芽中的表达诱导形成的肢芽中的表达异位表达异位表达TBX4，可，可以使以使FGF10诱导形成的诱导形成的前肢转变为前肢转变为后肢后肢四、顶外胚层嵴的形成四、顶外胚层嵴的形成v随着鸟类和哺乳类的中胚层间质细胞进入随着鸟类和哺乳类的中胚层间质细胞进入肢区，它们分泌的因子诱导肢芽顶端前、肢区，它们分泌的因子诱导肢芽顶端前、后边缘的外胚层细胞伸长，形成一个增厚后边缘的外胚层细胞伸长，形成一个
10、增厚的特殊结构，称为的特殊结构，称为顶外胚层嵴顶外胚层嵴（apical ectoderm ridge，AER）。）。AER是一个临时是一个临时的结构，对于附肢的继续向外生长是至关的结构，对于附肢的继续向外生长是至关重要的。重要的。v间质细胞分泌的因子可能是间质细胞分泌的因子可能是FGF10，其他其他的的FGF因子如因子如FGF2、FGF4和和FGF8虽然也虽然也可以诱导可以诱导AER的形成，但的形成，但FGF10合成的时合成的时间和位置都是适当的。间和位置都是适当的。vFGF10能够诱导鸡胚背腹交界处的外胚层能够诱导鸡胚背腹交界处的外胚层形成形成AER。在背部化的肢芽突变体中，由在背部化的肢芽
11、突变体中，由于没有背腹交界，便不能形成于没有背腹交界，便不能形成AER。扫描电镜观察孵化扫描电镜观察孵化4.5 天的鸡胚肢芽天的鸡胚肢芽显示顶外显示顶外胚层嵴胚层嵴AER背侧背侧 腹侧腹侧 附肢发育中外胚层和中胚层间的相互作用附肢发育中外胚层和中胚层间的相互作用 附肢的向外生长涉及附肢的向外生长涉及AER和中胚层间持续的和中胚层间持续的相互作用。相互作用。v一旦中胚层诱导其上方的外胚层形成一旦中胚层诱导其上方的外胚层形成AER，AER与中胚层的相互作用对附肢的向外生长是与中胚层的相互作用对附肢的向外生长是最重要的。最重要的。v中胚层在附肢发育中也起着关键的作用。中胚层在附肢发育中也起着关键的作
12、用。AER起初的形成和继续存在依赖于位于其下方的中起初的形成和继续存在依赖于位于其下方的中胚层。胚层。AER与位于其下的中胚层的相互作用与位于其下的中胚层的相互作用v在附肢发育期间任何时间在附肢发育期间任何时间除去除去AER，远端附肢的进一步发育，远端附肢的进一步发育停止。停止。v当当额外的额外的AER移植移植到附肢芽到附肢芽上将形成超数附肢结构，通常朝上将形成超数附肢结构，通常朝向附肢远端。向附肢远端。v将将腿间质直接置于翅的腿间质直接置于翅的AER下方下方，远端的后肢结构（趾）在，远端的后肢结构（趾）在附肢末端发育（然而，如果腿间附肢末端发育（然而，如果腿间质离质离AER较远，后肢间质进入
13、较远，后肢间质进入翅的结构）。翅的结构）。v当当非附肢的中胚层移植到非附肢的中胚层移植到AER下方下方，则，则AER退化，附肢退化，附肢发育停止。发育停止。附肢发育中外胚层和中胚层间的相互作用附肢发育中外胚层和中胚层间的相互作用v附肢发育中至少要求三种类型的外胚层和中胚层间附肢发育中至少要求三种类型的外胚层和中胚层间的相互作用的相互作用：v第一第一，中胚层起始附肢芽向外生长和形成，中胚层起始附肢芽向外生长和形成AER；v第二第二，AER进一步刺激肢芽的向外生长以及肢芽中进一步刺激肢芽的向外生长以及肢芽中胚层的增殖和分化；胚层的增殖和分化；v第三第三，附肢芽中胚层提供保持，附肢芽中胚层提供保持A
14、ER所必须的刺激。所必须的刺激。五、附肢发育时期轴的建立五、附肢发育时期轴的建立v脊椎动物完全形成的附肢包含三个轴的发育：脊椎动物完全形成的附肢包含三个轴的发育：近远轴近远轴（proximal-distal,P-D）、）、背腹轴背腹轴（dorsal-ventral，D-V）和）和前后轴前后轴（anterior-posterior,A-P）。）。v附肢发育中附肢发育中三个轴的建立三个轴的建立具有各自的时间性，它们好具有各自的时间性，它们好像是像是按下列顺序决定按下列顺序决定的：的：前后轴前后轴、背腹轴背腹轴和和近远轴近远轴。1.近远轴的发育近远轴的发育v附肢沿近远轴的分化附肢沿近远轴的分化：由：
15、由AER和和附肢中胚层诱导附肢中胚层诱导的相互作的相互作用产生的。用产生的。v附肢芽的逐渐向外生长附肢芽的逐渐向外生长：v由于位于由于位于AER下面间质细胞的增殖；下面间质细胞的增殖；vAER释放的分子（成纤维细胞生长因子释放的分子（成纤维细胞生长因子FGF）维持间质维持间质细胞不断进行分裂。细胞不断进行分裂。由由AERAER合成、释放到其下的间质中的成纤维细胞生长因子合成、释放到其下的间质中的成纤维细胞生长因子FGFFGF可能是鸡胚中维持间质细胞增殖的分子。可能是鸡胚中维持间质细胞增殖的分子。AER和附肢芽中胚层的相互作用外胚层嵴顶端对于肢芽近远轴图式的发育是必须的外胚层嵴顶端对于肢芽近远轴
16、图式的发育是必须的。从正在发育的肢芽中去除AER，将导致肢芽生长的停止；在发育后期将AER去除，可得到较为完整的肢。生长因子可以替代顶外胚层嵴生长因子可以替代顶外胚层嵴将将AER切除后，移植能释放生长因子切除后，移植能释放生长因子FGF-8的玻的玻璃珠，可使肢几乎正常发育。璃珠，可使肢几乎正常发育。1.背腹轴的分化背腹轴的分化2.在鸡翅中，沿背腹轴有一很清晰的图式。背腹轴的组在鸡翅中，沿背腹轴有一很清晰的图式。背腹轴的组成部分是由早期鸡胚胎预定肢芽区域的外胚层决定，成部分是由早期鸡胚胎预定肢芽区域的外胚层决定，并在背腹轴之间发育形成顶外胚层嵴。并在背腹轴之间发育形成顶外胚层嵴。3.在突变小鼠中
17、控制着脊椎动物肢的背腹轴的基因已经在突变小鼠中控制着脊椎动物肢的背腹轴的基因已经被确定。被确定。Wnt-7a基因在肢背部中胚层图示形成中起基因在肢背部中胚层图示形成中起到关键作用。到关键作用。2.背腹轴的分化背腹轴的分化v从体节发出的信号参与背部外胚层的确定。在鸡从体节发出的信号参与背部外胚层的确定。在鸡翅芽中，背腹外胚层界线的建立明显有来看翅芽中，背腹外胚层界线的建立明显有来看Notch受体信号的参与。受体信号的参与。v含有含有homeobox的基因的基因Engrailed-1在在AER形成之前形成之前就已经在附肢腹部的外胚层特异地表达，有可能就已经在附肢腹部的外胚层特异地表达，有可能特化为
18、将来的腹部区域。特化为将来的腹部区域。外胚层控制发育中肢的背腹轴图式的形成。外胚层控制发育中肢的背腹轴图式的形成。Wnt-7a在背部外胚层中表达，而Engrailed基因在腹部外胚层中表达。lmx-1基因在背中胚层中被Wnt-7a诱导表达，并且参与背部结构的确定。3.前后轴的特化前后轴的特化v附肢芽前后轴的极性附肢芽前后轴的极性：在肢芽：在肢芽能识别之前就已特化能识别之前就已特化。v有有两种主要模型两种主要模型用来解释前后轴的特化。用来解释前后轴的特化。v一种是一种是极化活动区极化活动区（zone of polarizing activity，ZPA）可可扩散形态发生子模型扩散形态发生子模型（
19、ZPA diffusible morphogen model）。）。v另一种是另一种是极性坐标模型极性坐标模型（the polar coordinate model）。）。六、同源基因在附肢发育中的作用六、同源基因在附肢发育中的作用 现代研究认为附肢是通过特异基因在特定细胞中现代研究认为附肢是通过特异基因在特定细胞中的表达决定的，同源基因可用于解释附肢发育中的表达决定的，同源基因可用于解释附肢发育中的所有主要现象。的所有主要现象。v同源基因决定附肢场同源基因决定附肢场 附肢场的边界与诱导能力有关，而此边界是由同附肢场的边界与诱导能力有关，而此边界是由同源基因的表达模式决定的。源基因的表达模式决
20、定的。v渐进带的相互作用是由渐进带的相互作用是由msx-1和和msx-2基因调节的基因调节的 AER和位于其下的间质的相互作用是由和位于其下的间质的相互作用是由msx-1和和msx-2基因产物调节的。基因产物调节的。msx-1基因起初在整个早基因起初在整个早期的附肢芽中表达，但此后变得局限于直接位于期的附肢芽中表达，但此后变得局限于直接位于AER下方的渐进带间质中表达。下方的渐进带间质中表达。msx-2基因起初是基因起初是在在AER和前部的间质中的表达。和前部的间质中的表达。由同源基因决定前后轴和指的特性由同源基因决定前后轴和指的特性vHoxD基因家族（基因家族（Hoxd-9到到Hoxd13）
21、的表达模式在）的表达模式在小鼠附肢芽的后部边缘是重叠的。这意味着在后小鼠附肢芽的后部边缘是重叠的。这意味着在后部边缘产生小指的细胞表达所有这些基因，而在部边缘产生小指的细胞表达所有这些基因，而在前部边缘形成拇指的细胞只表达前部边缘形成拇指的细胞只表达Hoxd-9。显然，。显然，在不同在不同Hox-D基因的表达中存在一个编码特化前基因的表达中存在一个编码特化前后指的模式。后指的模式。七、细胞死亡与指和关节的形成七、细胞死亡与指和关节的形成v脊椎动物附肢中特定细胞的死亡是可遗传的程序脊椎动物附肢中特定细胞的死亡是可遗传的程序性细胞死亡，是进化过程中经自然选择形成的。性细胞死亡，是进化过程中经自然选
22、择形成的。v细胞死亡在指细胞死亡在指/趾的成形过程中，特别是关节形成趾的成形过程中，特别是关节形成和手指的分离中起着重要的作用。和手指的分离中起着重要的作用。鸭胚和鸡胚后肢原基中细胞死亡模式的比较。鸡胚趾间细胞的程序性死亡信号可能由BMP发出，封阻BMP的受体将会阻止这些细胞的程序性死亡。noggin expressiondominant negative BMP receptorBMP蛋白可能参与了软骨的稳定和关节的形成过程。鸡肢形成晚期，BMP7（A）和BMP2（B）的表达。Noggin蛋白的作用。C，16.5天正常小鼠前肢中GDF5在关节形成处表达；D，Noggin缺陷型突变体小鼠中不表达GDF5，也不形成关节。END