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1、l附肢发育的研究是发育生物学的一个重要课题。脊椎动物，特别是鸟类和两栖类附肢（limb）的发育包含了大量的、各种各样的诱导作用。l幼虫期两栖类的附肢损伤后能够再生，研究再生也很重要。有尾类的蝾螈和美西螈附肢具有明显的再生能力，是研究再生的极好模型。 脊椎动物的附肢是一个极其复杂的器官，具有许多不对称的部分。脊椎动物的附肢都是由体壁中胚层体壁中胚层和外部的表皮外部的表皮共同形成的，但最后的形式各不相同。如前肢可形成前足，上肢，翅，鳍等。一、起源起源第一节第一节 脊椎动物附肢的发育脊椎动物附肢的发育鸡翅内骨的排列模式及其不对称性鸡翅内骨的排列模式及其不对称性 附肢的骨头主要包含附肢的骨头主要包含3
2、 3个部分：靠近体壁的个部分：靠近体壁的肱骨肱骨humerushumerus，在中，在中部的一个部的一个桡骨桡骨radiusradius和一个和一个尺骨尺骨ulnaulna以及以及掌骨掌骨metacarpalmetacarpal，和，和最远端的最远端的指骨指骨digit digit 组成。附肢在组成。附肢在3 3个基本轴上是不对称的，个基本轴上是不对称的，但左前肢总是和右前肢呈镜面对称但左前肢总是和右前肢呈镜面对称。l脊椎动物的附肢在起源上是由胚胎体壁向外生长形成的，主要是由来自侧板中胚层的体节部分和体节腹侧部产生的疏松间质形成的中央核中央核，以及位于外部的，来自外胚层的表皮表皮两大部分组成。
3、l附肢的基本成分（骨骼，肌肉和结缔组织）是由中胚层形成的，许多实验证明脊椎动物胚胎中的预定附肢区已被定位。能形成一个附肢的所有细胞，称为附肢域（附肢域（limb fieldlimb field），），包括位于中央的、产生附肢本身的中胚层细胞以及形成周围躯干组织和肩带的细胞,这两个区域称为附肢盘附肢盘(limb disc)(limb disc)。美西螈（美西螈（Ambystoma maculatum）的预定前肢域）的预定前肢域腮周侧翼组织腮周侧翼组织附肢附肢肩带肩带体节体节前肾前肾腮腮 二、附肢的早期发育二、附肢的早期发育（一）外胚层和中胚层间的相互作用（二）轴的建立（三）同源基因的作用两栖类胚
4、胎中附肢由中胚层起源的图解轴上生肌节芽轴上生肌节芽生肌节生肌节生骨节生骨节脊髓脊髓脊索脊索前肾前肾内胚层内胚层生皮节生皮节轴下生肌节芽轴下生肌节芽附肢芽肌肉前体附肢芽肌肉前体附肢芽骨骼前体附肢芽骨骼前体侧板中胚层侧板中胚层附肢芽附肢芽l覆盖在间质细胞团表面的表皮变得稍微增厚并向外突出。这个含有覆盖在外面的增厚上皮和被包在内部的间质细胞团突出物增大并变为附肢芽附肢芽（limb bud）。 附肢芽在顶端通过未分化间质细胞的持续增殖而伸长。这个增殖区域是一个大约250微米厚的和由未分化的细胞组成。在附肢伸展期间，更近体侧的那些顶端细胞显示出减弱的有丝分裂能力，它们开始聚集在附肢中心，形成软骨性成分，
5、最后产生附肢的骨骼。骨骼成分的分化是以近远的方向进行：鸡翅中第一个出现的软骨是肱骨，然后是桡骨和尺骨，最后是掌骨和指骨。同时，预定肌细胞前体聚集在软骨周围形成肌肉群体。l早期附肢芽的诱导作用诱导作用主要是由WntWnt蛋白质蛋白质和成纤维生长因子成纤维生长因子FGF10FGF10引起的。在附肢形成早期，附肢芽形成的信号来自侧板中胚层细胞附肢芽形成的信号来自侧板中胚层细胞，它们将来变为预定附肢的间质。这些细胞分泌FGF10，而FGF10能够促使外胚层和中胚层之间分肢形成的交互作用。lFGF10刚产生时遍布侧板中胚层，但在附肢芽形成前集中在侧板中胚层将形成附肢的区域。这些集中的地方是由于Wnt蛋白
6、的作用，WntWnt蛋白稳定蛋白稳定FGF10FGF10在这些位点的表达在这些位点的表达。 A.FGF表达首先发现于整个侧板中胚层，后来被Wnt8c稳定在后肢形成的区域。B.FGF10的合成是被Wnt2b稳定在将来前肢形成的区域。C.这两个侧板中胚层区的FGF10在顶外胚层嵴（AER）中诱导Wnt8。这个诱导作用是通过在反应组织外胚层中Wnt3a途径完成的。由AER分泌的FGF8诱导中胚层继续表达FGF10。孵化4854h鸡胚附肢芽开始形成的分子模型侧板中胚层侧板中胚层表皮表皮外胚外胚层层体节中体节中胚层胚层中间中胚中间中胚层层l研究表明：编码转录因子TBX4TBX4和TBX5TBX5分别与后
7、肢后肢和前肢前肢的特化有关。l实验表明：TBX4和TBX5基因分别在小鼠的后肢和前肢表达，说明TBX4和TBX5分别特化后肢和前肢。1.将分泌FGF的念珠菌植入鸡胚前，后肢芽之间可诱导异位的附肢，产生附肢的类型取决产生附肢的类型取决于于TBXTBX蛋白质的表达蛋白质的表达。2.将念珠菌植入靠近后肢TBX4表达的部位将诱导后肢。3.将念珠菌植入靠近前肢TBX5表达的部位将诱导前肢。TBX4 和TBX5在肢型特化中的作用Tbx5(蓝色)表现于前端的侧板中胚层，此部分的肢芽将形成翅膀；Tbx4(红色)表现于后端的侧板中胚层，此部分的肢芽则形成腿。若将含有FGF的念珠菌植入表现Tbx4和Tbx5之间的
8、区域，则在此区域前端诱发Tbx5表现，于后端诱发Tbx4表现，所以此区域的分肢将同时形成翅膀和腿的构造。l在鸟类和哺乳类中胚层诱导肢芽顶端前、后边缘的外胚层细胞伸长，形成一个增厚的特殊结构，称为顶外胚层嵴（顶外胚层嵴（AER)AER)。AER发现于大多数较高等的脊椎动物中，包括哺乳动物，但不存在于有尾两栖类。 lAER对附肢继续向外生长是至关重要的，但它只是一个临时结构临时结构，在鸡胚中，当第八天就消失了。 扫描电扫描电镜观察镜观察孵化孵化4.5 天的鸡天的鸡胚肢芽，胚肢芽，显示顶显示顶外胚层外胚层嵴嵴AER。 附肢附肢的向外生长涉及的向外生长涉及AERAER和中胚层间持续和中胚层间持续的的相
9、互作用相互作用。一旦中胚层诱导其上方的外胚层形成AER，AER与中胚层的相互作用对附肢的向外生长是最重要的。前肢中胚前肢中胚层层除去除去AER额外的额外的AER腿中胚层腿中胚层非附肢中胚层非附肢中胚层附肢发育停止附肢发育停止翅翅腿腿AER退化退化 附肢发育附肢发育停止停止顶外胚层嵴顶外胚层嵴AER通过位于通过位于下方的中胚层下方的中胚层诱导作用的总诱导作用的总括括说明说明AER是维是维持间质细胞分持间质细胞分裂，推动肢体裂，推动肢体向外生长所必向外生长所必须的须的说明说明AER影响影响A-P轴线轴线说明间质细胞决定说明间质细胞决定了肢体的类型了肢体的类型说明间质细胞是维说明间质细胞是维持持AE
10、R所必须的所必须的l渐进带渐进带(progress zone)(progress zone)位于肢芽的顶端，由快速分裂和增殖的未分化细胞组成。顶外胚层嵴AER位于渐进带的上表面。l不同时期的渐进带细胞的移植对附肢发育有着不同的影响(见下图)lAER 对下方的渐进带发出信号，如将AER移植到早期肢芽的背部将诱导异位生长。渐进带（渐进带（PZPZ）细胞控制近远端分化）细胞控制近远端分化A.将早期翅芽的PZ移植到已经形成尺骨和挠骨的晚期翅芽中，形成额外的尺骨和挠骨。B.将晚期翅芽的PZ移植到早期翅芽中，中间结构缺失。中胚层在附肢发育中起着关键作用中胚层在附肢发育中起着关键作用。AER起初的形成和继续
11、存在依赖位于其下方的中胚层。如果将预定附肢中胚层移植到躯干部外胚层下面，将形成一个AER和发育出一个额外的附肢。如果将早期鸡胚附肢芽中胚层切除，然后将剩余的外胚层包裹非附肢的中胚层，则AER退化，中胚层停止增殖。发育附肢的结构是受中胚层指令的诱导作用决定的。特例:有尾两栖类不同。附肢发育的潜能被证明存在于从前肢到后肢的整个躯干部。通过移植一个耳泡或鼻原基到前肢和后肢的区域，可在那里诱导出额外的附肢，如下图。这种移植物作为一种“异常的诱导者”激活了躯干部组织中潜在的能力。l脊椎动物完全形成的附肢包括三个轴的发育，分别是近远（近远（P-D)轴、背腹轴、背腹(D-V)轴和前轴和前后后(A-P)轴。轴
12、。l附肢发育中三个轴的建立具有各自的时间性，其顺序可能是：A-P 轴D-V 轴P-D 轴。l附肢沿近远轴的分化是由AERAER和附肢中胚层和附肢中胚层诱导的相互作用诱导的相互作用产生的。附肢芽的逐渐向外生长是由于位于AER下面渐进带的间质细胞的增殖，而AER释放的分子维持间质细胞不断进行分裂。l由AER合成、释放到其下的间质中的成纤维细胞生长因子FGFFGF-2-2可能是鸡胚中维持间质细胞增殖的分子。AER对于肢芽近对于肢芽近-远轴的发育是必须的远轴的发育是必须的。从正在发育的肢芽中去除AER，将导致肢芽生长的停止；在发育后期将AER去除，可得到较为完整的肢。 生长因子可以替代顶外胚层嵴生长因
13、子可以替代顶外胚层嵴。将AER切除后，移植能释放生长因子FGF-8的玻璃珠，可使肢几乎正常发育。l附肢沿P/D轴的分化是由AER和附肢中胚层诱导的相互作用产生的。渐进带(PZ)的间质细胞在其中起到重要作用。l但是这些间质细胞如何特化近-远轴？有两个模式被提出来解释这个现象： 渐进带模式渐进带模式（progress zone model）重视“时间”的量度 早期定位与扩散模式早期定位与扩散模式（early allocation and progenitor expansion model ）重视“空间”的量度 l假设在附肢内中胚层细胞的命运是由它们在附肢顶端被称为渐进带(progress zon
14、e; PZ)的区域中保留多长时间决定的。 l一个细胞在增长区所花的时间越长，它获得越多有丝分裂的机会，而其构造越往远程发展。 l既然增长区要维持一定的大小，当肢干生长时，细胞必须不断离开增长区；一旦细胞离开，他们就形成软骨组织。所以，第一个离开的细胞会形成附肢最近端的成分 (如肱骨) ，而最后离开的细胞形成附肢较远端的成分(如指骨) ，见下图Al认为肢芽在很早就已经分化了，后来的细胞分裂只是扩张已经分化的区域，见下图(B)。l当早期将AER移除的时候，这些特化的区域还没扩张，所以大部分的间质细胞(在AER 200m之内)都死亡了，但当在较后期的胚胎阶段，肢芽生长且区域扩张了，200m的范围只会
15、删除掌骨和指骨的部分。 间质细胞特化近间质细胞特化近- -远轴的两种模式远轴的两种模式研究发现,H Hoxaoxa和和HoxdHoxd复合物的5部分好像在小鼠前肢芽中起作用。根据这些基因的表达模式和自然发生的及敲除基因形成突变体的情况，Davis等假设一种模型：hox基因特化确定附肢的一个特定区域,如下图。hoxhox基因产物在特化附肢发生地点中的作用基因产物在特化附肢发生地点中的作用hox基因将在特化特定间质细胞变为附肢的近端和远端部分起作用。假设假设5hox旁基因特化前肢的特定区域旁基因特化前肢的特定区域Hox-9特化肩胛骨，Hox-10特化肱骨，Hox-11特化尺骨跟桡骨，Hox-12特
16、化掌骨，Hox-13特化指骨。 5hox旁基旁基因因肩胛骨肩胛骨肱骨肱骨尺骨和桡尺骨和桡骨骨掌骨掌骨指指骨骨图(A)为正常老鼠的前肢，而图(B)为敲除所有hox-11基因和hox-11旁基因的四个位点，产生的小鼠前肢缺少尺骨和桡骨。 A.在肢柱形成在肢柱形成 (期期) 期间，期间，Hoxd-9与与Hoxd-10在新形成的在新形成的附肢芽中表达。附肢芽中表达。B.在肢杆形成在肢杆形成( 期期)期间，期间，hox基因呈鸟基因呈鸟巢状表达，巢状表达，Hoxd-9到到Hoxd-13在附肢芽在附肢芽后部表达，但只有后部表达，但只有Hox-9在附肢芽前后在附肢芽前后两部分表达。两部分表达。C.在肢身形成（
17、在肢身形成（III期）时，期）时，Hox基因的基因的表达逆转，表达逆转，Hoxd-13和和Hoxa-13在附肢芽在附肢芽前后两部分都表达，前后两部分都表达，而而Hoxd-10到到Hoxd-12以及以及Hoxa-12仅在仅在后部表达。后部表达。 在四肢动物附肢发育期间在四肢动物附肢发育期间HOX基因表达的变化基因表达的变化I期肢柱期肢柱 II期肢杆期肢杆 III期肢身期肢身肱骨肱骨 桡骨桡骨尺骨尺骨掌骨和指骨掌骨和指骨l背-腹轴与来自中胚层和外胚层两者的细胞特化相关l背-腹轴分化可能是由肢芽背部外胚层的特异特异性旁分泌因子性旁分泌因子(Wnt7a) 诱导产生的。l背部中胚层同时诱导背部肢芽的rF
18、ng和和Wnt7a分子表达。腹部中胚层诱导 engrailed-1（en-1） 在肢芽腹部表达。lWnt-7a 在背部外胚层中表达，它诱导背部中胚层的 Lmx-1 表达并特化背部轴向形成。lrFng同样也在背部外胚层中表达。len-1 表达细胞和rFng表达细胞之间的相互抑制作用，将决定顶外胚层嵴AER的中部边缘位置。En-1 表达细胞与Wnt-7a相互抑制，由此对肢芽腹部区域进行定位. 外胚层控制发育中肢的背腹轴图式的形成。外胚层控制发育中肢的背腹轴图式的形成。Wnt-7a在背部外胚层中表达，而Engrailed基因在腹部外胚层中表达。lmx-1基因在背中胚层中被Wnt-7a诱导表达，并且参
19、与背部结构的确定l在鸡胚发育附肢芽的前-后轴极性是在肢芽能识别之前就已特化。l前后轴是由年幼肢芽和体壁后部连接处的一小团中胚层细胞特化的，中胚层的这个区域被称为极化活动区（极化活动区（zone of polarizing activity，ZPA）。）。l当ZPA被移植到另一肢芽前侧位置时，形成的翅指数目加倍，额外一组指的结构与正常发育指的结构呈镜面对称，如下图。（3）前）前-后轴（后轴（A-P）轴的特化）轴的特化当极化活性区( the zone of polarizing activity; ZPA)被移植到前端肢芽的中胚层时，一模一样的手指如镜像一般，从正常的手指的前端冒出。 （A）极化活
20、动区（极化活动区（ZPA）可扩散形）可扩散形态发生子模型态发生子模型（ZPA diffusible morphogen model）（B）极性坐标模型极性坐标模型（the polar coordinate model）解释前解释前-后轴特化的两种主要模型后轴特化的两种主要模型（A A）ZPAZPA可扩散形态发生子模型可扩散形态发生子模型寻找与ZPA极性活动相关分子已成为发育生物学最广泛的追求。原位杂交实验显示，果蝇hedgehog基因基因在脊椎动物的同源基因sonic hedgehog(shh)特异地在附肢芽形成ZPA的区域中表达，如下图。视黄酸（视黄酸（retinoic acid,RA）被认
21、为是一种由ZPA分泌的内源形态发生子。在视黄酸中浸泡过的念珠能代替ZPA，诱导出镜面对称的，颠倒的前-后轴极性。图示shh蛋白在ZPA中表达原位杂交显示shh蛋白表达的位点（箭头示）在鸡胚附肢芽的后部右图为Sonic hedgehog(shh) 极化活性的分析试验。先将shh gene插入鸡病毒基因序列中邻近促进子的地方，然后将此重组过的病毒放入培养的鸡纤维组织原细胞中。将此经过病毒转殖的细胞移植到鸡胚胎肢芽的前端。结果也产生镜像般的手指，显示分泌的蛋白质有极化的活性。 因此，shh好像是好像是ZPA的活性因的活性因子。子。有研究证明，有研究证明，shh基因好像是被基因好像是被来自新形成的顶外
22、胚层嵴来自新形成的顶外胚层嵴（AER）的）的FGF 蛋白激活的。蛋白激活的。16期期17期期18期期体节体节中间中胚层中间中胚层侧板中胚层侧板中胚层表面中胚层表面中胚层FGF10诱导诱导FGF8FGF8维持增生维持增生FGF8和和FGF4维持增生维持增生前端前端后端后端FGF8诱导诱导shhFGF8和和FGF4维持维持shh图示前附肢芽中图示前附肢芽中AER和和ZPA之间的反馈之间的反馈( (B B) )极性坐标模型极性坐标模型此模型认为模式不是由可扩散分子形成的，而是在细胞膜上固定的在细胞膜上固定的，是由可改变细胞特性的分子产生的。(1)由AER (FGF8)和dHAND建立极化活性区(So
23、nic hedgehog)；(2)由Sonic hedgehog(在极化活性区)诱导FGFs产生(在AER)，其方式是藉由Shh诱导Gremlin产生，而Gremlin会阻碍抑制FGFs的BMP；(3)由Wnt7a维持Sonic hedgehog的表现(在腹侧外胚层部分)；(4)由Sonic hedgehog阻碍Gli3分裂成抑制子(repressor)的形式，使得形成Gli3活化子(activator)与Gli3抑制子的浓度梯度(gradient)（4）三个轴的）三个轴的协调示意图协调示意图（三）同源基因的作用（三）同源基因的作用现代研究认为附肢是通过特异基因在特定细胞中的表达决定的，同源基
24、因可用于解释附肢发育中的所有主要现象。（a a）决定附肢域）决定附肢域（b b）渐进带的相互作用是由）渐进带的相互作用是由msx-1msx-1和和msx-2msx-2基基因调节的因调节的（c c）决定前后轴和指的特性）决定前后轴和指的特性（d d）同源基因和细胞死亡）同源基因和细胞死亡（a a）决定附肢域）决定附肢域附肢域的边界与诱导能力有关，而此边界是由同源基因的表达模式决定的。（b b）渐进带的相互作用是由渐进带的相互作用是由msx-1msx-1和和msx-2msx-2基基因调节的因调节的 AER和位于其下的间质的相互作用是由msx-1和msx-2基因产物调节的。 msx-1基因起初在整个
25、早期的附肢芽中表达，但此后变得局限于直接位于AER下方的渐进带间质中表达。msx-2基因起初是在AER和前部的间质中的表达。（c c）决定前）决定前- -后轴和指的特性后轴和指的特性 Hox-D基因族（Hoxd-9到Hox-d13）5末端的表达模式在小鼠附肢芽的后部边缘是重叠的。这意味着在后部边缘产生小指的细胞表达所有这些基因，而在前部边缘形成拇指的细胞只表达Hoxd-9。在不同Hox-D基因的表达中存在一个编码特化前后指的模式。（d d）同源基因和细胞死亡）同源基因和细胞死亡细胞死亡在塑造附肢中起重要作用，它对于关节的形成和分离指都是必需的。在脊椎动物附肢中特定细胞的死亡是可遗传的程序性细胞
26、死亡，是进化过程中经自然选择形成的。例子是足上有蹼或无蹼。鸭足和鸡足的不同是在指间有无细胞死亡,如下图。在鸭（A）和鸡（B）胚胎的腿原基中细胞死亡的模式鸭腿原基鸭腿原基内部坏死区内部坏死区鸡腿原基鸡腿原基前坏死区前坏死区后坏死区后坏死区内部坏死区内部坏死区指间坏死区指间坏死区(a)附肢再生的过程(b)芽基细胞的来源和作用(c)再生作用的调节(d)细胞分化模式的恢复Developmental Biology蝾螈肢体的再生蝾螈肢体的再生两栖类动物肢体被截除后，两栖类动物肢体被截除后，可以重新长出被截区的部分。可以重新长出被截区的部分。肢体切除后的肢体切除后的612小时小时内，剩余部分的表皮细胞移向
27、内，剩余部分的表皮细胞移向窗口表面形成单细胞层表皮，窗口表面形成单细胞层表皮，再通过细胞增殖形成顶端外胚再通过细胞增殖形成顶端外胚层帽层帽(apical ectodermal cap). 在随后的在随后的4天中，天中，顶端外胚层顶端外胚层帽下的骨细胞、软骨细胞、成帽下的骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞、神经细胞纤维细胞、肌细胞、神经细胞发生去分化作用，构成再生胚发生去分化作用，构成再生胚基基(regeneration blastema),继继续增殖、分化形成肢体结构。续增殖、分化形成肢体结构。（d）细胞分化模式的恢复）细胞分化模式的恢复附肢再生产生的细胞分化模式是在胚胎附肢发育期间建立的。当附肢被截断后，剩余残桩仅含肱骨，但再生的结构将包括正常的桡骨，尺骨，腕骨和指骨。再生的组织既不多，也不少，而且各种附肢的成分按正确顺序排列 。附肢总是在远端方向再生，不管截肢残桩极性。这一现象称为远端转变规律远端转变规律。将截断前肢形成的芽基移植到只含一个肱骨的残桩上，产生附肢含有所有失去的中间部分，这是一个明显调节再生的例子，称为插入再生插入再生。