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1、LOGO第三章 细胞工程实验室及实验基本操作 第一节 实验室及仪器设备 第二节 实验基本操作 第三节 培养基及其配制第一节 实验室及仪器设备细细胞胞工工程程实实验验室室要要能能满满足足清清洗洗、无无菌菌操操作作、培培养养基基制制备备、贮贮藏藏和和培培养养鉴定等多方面的要求。鉴定等多方面的要求。1、植植物物实实验验室室基本操作室基本操作室无菌操作室无菌操作室培养室培养室鉴定分析室鉴定分析室温温室室一、实验室2 2、动物细胞培养室、动物细胞培养室原则是防止微生物污染和有害因素影响,要求工作原则是防止微生物污染和有害因素影响,要求工作环境清洁、空气清新,干燥和无尘。环境清洁、空气清新,干燥和无尘。实
2、验室设置上至少有实验室设置上至少有4 4个房间:个房间:基本操作室基本操作室,洗涤,灭菌。,洗涤,灭菌。缓冲间缓冲间,位于准备室和培养室之间。,位于准备室和培养室之间。无菌培养室无菌培养室,内有超净工作台,一般应在内侧,室,内有超净工作台,一般应在内侧,室内可消毒,培养箱。内可消毒,培养箱。鉴定分析室鉴定分析室,用于细胞的观察和分析研究。,用于细胞的观察和分析研究。二、实验室仪器设备(一)必要器皿1 1、培培养养器器皿皿(动动物物细细胞胞培培养养一一般般为为塑塑料料器器皿皿,优优点点是是一一次次性性使使用用,已已消消毒毒灭灭菌菌密密封封包包装装,打打开开即即可可用;植物细胞培养一般用三角瓶)用
3、;植物细胞培养一般用三角瓶)2 2、盛装器皿(各种玻璃器皿)、盛装器皿(各种玻璃器皿)3 3、计量器皿(量筒、吸管、加样器等)、计量器皿(量筒、吸管、加样器等)4 4、金属器皿(用于解剖、取材、剪切组织等)、金属器皿(用于解剖、取材、剪切组织等)(二)常用仪器设备1 1无菌操作仪器设备无菌操作仪器设备 医医用用超超净净工工作作台台(气气流流水水平平型型和和垂垂直直型型),高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌锅锅(手手提提式式、立立式式),干干热热灭灭菌菌烘烘箱箱,过过滤滤除菌装置。除菌装置。2 2培养仪器设备培养仪器设备 植植物物:培培养养架架、摇摇床床、振振荡荡式式培培养养机机(100次次/min)、恒
4、温恒湿光照培养箱、暗培养箱等。恒温恒湿光照培养箱、暗培养箱等。动物:恒温培养箱及动物:恒温培养箱及CO2恒温培养箱。恒温培养箱。3 3药品存贮和配制仪器设备药品存贮和配制仪器设备4 4观察分析仪器设备观察分析仪器设备 显微镜(高倍、倒置、实体解剖和荧光显微镜显微镜(高倍、倒置、实体解剖和荧光显微镜等)及配套照相系统、解剖镜、离心机、液氮等)及配套照相系统、解剖镜、离心机、液氮容器、恒温箱、精密天平等。容器、恒温箱、精密天平等。5 5其它仪器设备,如流式细胞仪,酶标仪等。其它仪器设备,如流式细胞仪,酶标仪等。二氧化碳细胞培养箱二氧化碳细胞培养箱MB-IV型型酶酶标标检检测测仪仪 第二节第二节 实
5、验室的基本操作实验室的基本操作v实验室的基本操作是围绕实验室的基本操作是围绕无菌无菌要求进行的,主要要求进行的,主要包括清洗、消毒灭菌,无菌操作等。包括清洗、消毒灭菌,无菌操作等。一、清洗未未用用过过的的玻玻璃璃器器皿皿:常常有有游游离离碱碱性性物物质质,使使用用前前,先先用用1%1%稀稀盐盐酸酸浸浸泡泡一一夜夜,然然后后用用洗洗衣衣粉粉洗洗涤涤,清清水冲洗,蒸馏水冲洗一遍,晾干备用。水冲洗,蒸馏水冲洗一遍,晾干备用。已已用用过过的的玻玻璃璃器器皿皿:用用洗洗衣衣粉粉刷刷洗洗,清清水水冲冲洗洗,晾干备用。晾干备用。新的塑料器皿:新的塑料器皿:打开即用。打开即用。已用过的塑料器皿已用过的塑料器皿
6、金金属属器器皿皿:一一般般不不宜宜用用洗洗涤涤液液洗洗涤涤,新新的的用用热热洗洗衣粉水洗净、冲洗后,蒸馏水冲洗擦干即可。衣粉水洗净、冲洗后,蒸馏水冲洗擦干即可。细细胞胞培培养养的的玻玻璃璃器器皿皿常常需需用用洗洗液液浸浸泡泡,再再拿拿出出冲冲洗洗,洗液配方如下:洗液配方如下:配方成分配方成分弱液弱液次强液次强液强液强液常用配方常用配方重铬酸钾重铬酸钾(g)浓硫酸浓硫酸(ml)蒸馏水蒸馏水(ml)5010010001002001000608002001002008001、KCrO4液要冷却后才能加浓硫酸。以防暴沸。液要冷却后才能加浓硫酸。以防暴沸。2、浓硫酸要慢慢倒入、浓硫酸要慢慢倒入KCrO4
7、液中。液中。3、洗液要密封保存,以免失效。、洗液要密封保存,以免失效。正常洗液黑棕色正常洗液黑棕色蓝绿色(效用变弱)蓝绿色(效用变弱)二、消毒灭菌严严格格的的消消毒毒灭灭菌菌起起着着至至关关重重要要的的作作用用,主主要要物物理理灭灭菌方法有:菌方法有:v湿湿热热灭灭菌菌:高高温温高高压压法法、流流动动蒸蒸汽汽或或沸沸水水121,1.0-1.1Kg/cm2,20-30分钟分钟v干干热热灭灭菌菌:烤烤箱箱、焚焚烧烧、酒酒精精灯灯,于于150恒恒温温40min,或或120恒恒温温2h,或或160恒恒温温1.5-2h(芽芽孢孢杆杆菌菌)v射射线线照照射射灭灭菌菌:紫紫外外线线(细细胞胞培培养养室室,超
8、超净净工工作作台台)、电离辐射、电离辐射v过滤灭菌过滤灭菌:微孔滤膜、玻璃丝滤器:微孔滤膜、玻璃丝滤器m高温高压灭菌可能出现的问题:高温高压灭菌可能出现的问题:lpH值下降值下降l太高温度灭菌时可能使糖焦化,可能产生毒性,太高温度灭菌时可能使糖焦化,可能产生毒性,对有些培养基应选择合适条件灭菌。对有些培养基应选择合适条件灭菌。l灭菌时间过长使盐沉淀,同时使琼脂解聚灭菌时间过长使盐沉淀,同时使琼脂解聚l挥发性物质不能高温灭菌,否则会被破坏挥发性物质不能高温灭菌,否则会被破坏化学消毒灭菌主要有:化学消毒灭菌主要有:v熏蒸灭菌熏蒸灭菌药物蒸汽对室内空气进行杀菌。药物蒸汽对室内空气进行杀菌。甲醛和高锰
9、酸钾混合后产生大量蒸汽。甲醛和高锰酸钾混合后产生大量蒸汽。醋烧开。醋烧开。v化学药品灭菌化学药品灭菌7070%-75%-75%酒精,酒精,升汞升汞漂白粉漂白粉新洁尔敏新洁尔敏过氧化氢过氧化氢v抗生素抑菌法抗生素抑菌法 青霉素、链霉素、新霉素青霉素、链霉素、新霉素消毒剂消毒剂使用浓度使用浓度(%)去除难易去除难易消毒时间消毒时间(min)效果效果次氯酸钙次氯酸钙次氯酸钠次氯酸钠漂白粉漂白粉溴水溴水过氧化氢过氧化氢升汞升汞酒精酒精抗生素抗生素硝酸银硝酸银9102饱和溶液饱和溶液1210120.11707545(mg/L)1易易易易易易易易最易最易较难较难易易中中较难较难53053053021051
10、52100.223060530很好很好很好很好很好很好很好很好好好最好最好好好较好较好好好常用消毒剂消毒灭菌效果比较表常用消毒剂消毒灭菌效果比较表三、无 菌 操 作1、无菌操作前的准备工作:、无菌操作前的准备工作:l穿好工作服、戴上工作帽和口罩。穿好工作服、戴上工作帽和口罩。l将将各各种种操操作作所所用用的的金金属属器器械械浸浸泡泡在在95或或70的的酒酒精精,点燃酒精灯。点燃酒精灯。l将将耐耐热热器器皿皿(不不锈锈钢钢小小盘盘)中中加加入入少少量量酒酒精精,将将蘸蘸有有酒酒精精的的金金属属器器械械及及器器械械支支架架放放入入耐耐热热器器皿皿中中灼灼烧烧,待待凉后备用。凉后备用。l用用7075
11、的的酒酒精精擦擦拭拭新新培培养养容容器器和和继继代代培培养养容容器器表面,放置超净台上待用。表面,放置超净台上待用。l用上述浓度的酒精擦拭双手和前臂。用上述浓度的酒精擦拭双手和前臂。2 2、无菌操作步骤、无菌操作步骤l 将将培培养养材材料料灭灭菌菌后后放放入入已已消消毒毒的的培培养养皿皿中中,置置于于超超净净工工作作台台酒酒精精灯灯火火焰焰下下方方,进进行行适适当当切切割割或或其其他他处处理。理。l 在在酒酒精精灯灯火火焰焰处处将将培培养养瓶瓶盖盖轻轻轻轻打打开开,瓶瓶口口在在火火焰处旋转灼烧。焰处旋转灼烧。l 将镊子过火,用镊子将培养材料置于培养基上将镊子过火,用镊子将培养材料置于培养基上l
12、 将镊子、瓶口及塞子过火后盖回瓶口。将镊子、瓶口及塞子过火后盖回瓶口。继代培养用灭菌的器具(镊子或吸管)继代培养用灭菌的器具(镊子或吸管)直接将培养材料放置在新培养基上。直接将培养材料放置在新培养基上。第三节 培养基及其配制定义定义:培养基是离体培养组织或细胞:培养基是离体培养组织或细胞赖以生存的营养基质,是为离体培养赖以生存的营养基质,是为离体培养材料提供的近似生物体内生存的营养材料提供的近似生物体内生存的营养环境。环境。没有任何一种培养基能够适合一切类没有任何一种培养基能够适合一切类型的组织、细胞和器官的培养。型的组织、细胞和器官的培养。必要元素在细胞内的主要生理作用必要元素在细胞内的主要
13、生理作用组组成成各各种种化化合合物物,参参与与有有机机体体的的构构造造,成成为为结构物质。结构物质。构构成成一一些些特特殊殊的的生生理理活活性性物物质质,参参与与活活跃跃的的生理代谢。生理代谢。元元素素间间互互相相协协调调,维维持持离离子子浓浓度度平平衡衡、胶胶体体稳定、电荷平衡等电化学方面的作用。稳定、电荷平衡等电化学方面的作用。调节形态发生和组织器官的建成。调节形态发生和组织器官的建成。一、植物细胞培养基及其配制 完善的植物培养基配方为:完善的植物培养基配方为:水分水分 无机营养成分无机营养成分 有机营养成分有机营养成分 生长调节物质生长调节物质 琼脂琼脂(一)培养基成分1 1、无机元素、
14、无机元素氮氮-各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要组各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要组成成分。成成分。钙钙-细胞壁的成分之一细胞壁的成分之一铁、锌、钼铁、锌、钼-某些酶的组成成分某些酶的组成成分v植植物物缺缺乏乏无无机机元元素素可可能能引引起起的的疾疾病病:植植物物失失绿绿、细细胞分裂停止、细胞分化受阻等。胞分裂停止、细胞分化受阻等。v营营养养元元素素过过多多可可以以引引起起植植物物细细胞胞代代谢谢障障碍碍、生生长长抑抑制。制。2 2、有机营养成分、有机营养成分v提供促进培养细胞生长和分化所必需的有机碳、提供促进培养细胞生长和分化所必需的有机碳、氮等营养物质,包括:氮等营养物质,包括:
15、氨基酸类氨基酸类 维生素类维生素类 糖类糖类 天然有机添加物类天然有机添加物类氨基酸类氨基酸类v常用:甘氨酸常用:甘氨酸v有有时时用用:丝丝氨氨酸酸、酪酪氨氨酸酸、谷谷氨氨酰酰胺胺、天天冬冬酰酰胺胺、水解酪蛋白和水解乳蛋白等。水解酪蛋白和水解乳蛋白等。v用量通常为用量通常为2 2-3mg/L-3mg/L。v水水解解酪酪蛋蛋白白CH和和水水解解乳乳蛋蛋白白LH,对对培培养养材材料料的的细细胞胞分分化化有有良良好好的的促促进进作作用用,用用量量为为100100-2-2 000mg/L000mg/L维生素类维生素类v维生素类是以辅酶形式参与植物细胞代谢活动的重维生素类是以辅酶形式参与植物细胞代谢活动
16、的重要物质,对生长、分化有很好的促进作用。要物质,对生长、分化有很好的促进作用。用量:用量:0.1-10mg/L 常用:常用:盐酸硫胺素(维生素盐酸硫胺素(维生素B1)盐酸吡哆醇(维生素盐酸吡哆醇(维生素B6)烟酸(维生素烟酸(维生素B3)叶酸(维生素叶酸(维生素Bc)有时用:生物素(维生素有时用:生物素(维生素H)泛酸钙(维生素泛酸钙(维生素B5)抗坏血酸(维生素抗坏血酸(维生素C)糖类糖类v糖类是培养基的主要碳源。糖类是培养基的主要碳源。v常常用用碳碳源源是是蔗蔗糖糖,还还有有葡葡萄萄糖糖、果果糖糖、麦麦芽芽糖糖、木糖、甘露糖、山梨糖等。木糖、甘露糖、山梨糖等。v适宜的浓度为适宜的浓度为2
17、%2%-5%-5%。离体双子叶植物根:以蔗糖为碳源最好。离体双子叶植物根:以蔗糖为碳源最好。单子叶植物的根:以右旋糖(葡萄糖)为碳源最好。单子叶植物的根:以右旋糖(葡萄糖)为碳源最好。肌肌 醇醇在糖类的互相转化中起作用,是培养基中不可缺在糖类的互相转化中起作用,是培养基中不可缺少的有机营养。少的有机营养。形成细胞壁的构建物质:果胶质形成细胞壁的构建物质:果胶质 。形成植酸形成植酸 与与Ca2+、Mg2+结合成植酸钙镁。结合成植酸钙镁。形成磷脂,细胞膜组分。形成磷脂,细胞膜组分。可见肌醇参与了碳水化合物、磷脂代谢和离子平可见肌醇参与了碳水化合物、磷脂代谢和离子平衡等生理活动。衡等生理活动。用量为
18、用量为50-100mg/L。天然有机添加物类天然有机添加物类v椰乳、马铃薯汁、酵母提取液、番茄汁等。椰乳、马铃薯汁、酵母提取液、番茄汁等。v化化学学成成分分不不明明的的复复杂杂营营养养混混合合物物,对对细细胞胞和和组组织织的的生生长长和和分分化化有有明明显显的的促促进进作作用用,但但质质和和量量受多种因素影响,实验的可重复性差。受多种因素影响,实验的可重复性差。生长调节物质生长调节物质v是促进培养植物生长良好的主要因素。是促进培养植物生长良好的主要因素。v由无机和有机营养构成的培养基仅保证了培养由无机和有机营养构成的培养基仅保证了培养物的生存,只有配以适当的植物生长调节物质物的生存,只有配以适
19、当的植物生长调节物质时,才能诱导细胞分裂的启动,愈伤组织生长时,才能诱导细胞分裂的启动,愈伤组织生长及根、芽分化和胚状体的发育。及根、芽分化和胚状体的发育。v植物生长调节物质包括:植物生长调节物质包括:生长素(生长素(auxin)类类细胞分裂素类(细胞分裂素类(cytokinin)赤霉素(赤霉素(gibberellin)类类脱落酸(脱落酸(abscisicacid)乙烯(乙烯(ethylene)等等生长素类生长素类组织培养中生长素的作用:组织培养中生长素的作用:促进细胞伸长生长和细胞分裂促进细胞伸长生长和细胞分裂 诱导愈伤组织形成诱导愈伤组织形成 促进生根促进生根 诱导不定芽的分化(与细胞分裂
20、素配合)诱导不定芽的分化(与细胞分裂素配合)诱导侧芽的萌发与生长诱导侧芽的萌发与生长 胚状体的产生等胚状体的产生等v常用生长素有:常用生长素有:2,4-2,4-二二氯氯苯苯氧氧乙乙酸酸:有有抑抑制制芽芽形形成成的的副副作作用用,一般用于启动细胞的脱分化。一般用于启动细胞的脱分化。诱导分化则用诱导分化则用NAANAA或或IBAIBA、IAAIAA。萘乙酸(萘乙酸(NAANAA)吲吲哚哚丁丁酸酸(IBAIBA):人人工工合合成成,120120C C仍仍很很 稳定。组织培养中常用。生根效果好。稳定。组织培养中常用。生根效果好。吲吲哚哚乙乙酸酸(IAAIAA)等等:天天然然植植物物生生长长素素,见见光
21、光易分解,高温高压易破坏。易分解,高温高压易破坏。细胞分裂素类细胞分裂素类v细胞分裂素的作用:细胞分裂素的作用:促进细胞分裂促进细胞分裂 诱导愈伤组织或器官分化不定芽诱导愈伤组织或器官分化不定芽 抑制顶端优势而促进茎的增殖抑制顶端优势而促进茎的增殖 抑制离体组织或器官衰老等抑制离体组织或器官衰老等常用的细胞分裂素有:常用的细胞分裂素有:激动素或糖基腺嘌呤(激动素或糖基腺嘌呤(kinetin,KT)(见光易见光易分解,需暗处保存)分解,需暗处保存)6-苄基腺嘌呤(苄基腺嘌呤(6-BA)2-异戊烯腺嘌呤(异戊烯腺嘌呤(2-Zip)玉米素(玉米素(zeatin,ZT)等等赤霉素类赤霉素类v赤霉素(赤
22、霉素(gibberellin,GA)有有20多种。多种。v组织培养中仅使用组织培养中仅使用GA3一种:能促进诱导形成一种:能促进诱导形成的不定胚正常发育成小植株。的不定胚正常发育成小植株。vGA3不耐热,溶水后不稳定,需溶于酒精中,不耐热,溶水后不稳定,需溶于酒精中,过滤除菌。过滤除菌。脱落酸脱落酸脱落酸(脱落酸(abscisicacid,ABA)的作用:的作用:抑制蛋白质合成抑制蛋白质合成 抵消和抑制生长素、细胞分裂素和抵消和抑制生长素、细胞分裂素和GA发挥作用发挥作用 诱导休眠诱导休眠 促进衰老和脱落促进衰老和脱落 抑制气孔开放,减少蒸腾作用抑制气孔开放,减少蒸腾作用 对一些培养物芽的形成
23、有促进作用对一些培养物芽的形成有促进作用短日照条件诱导脱落酸合成,延缓生长、促进短日照条件诱导脱落酸合成,延缓生长、促进落叶、形成休眠芽(秋季)。落叶、形成休眠芽(秋季)。长日照条件诱导赤霉素合成,促进生长、诱导长日照条件诱导赤霉素合成,促进生长、诱导开花(春夏季)。开花(春夏季)。乙烯乙烯v乙烯的作用:乙烯的作用:具有促熟果实具有促熟果实 促进脱落和衰老促进脱落和衰老 促进橡胶、漆、松脂等次生物质的排泌促进橡胶、漆、松脂等次生物质的排泌 促进菠萝开花促进菠萝开花 增加黄瓜等雌花数量等增加黄瓜等雌花数量等v培养时植物组织自身会散发出乙烯。培养时植物组织自身会散发出乙烯。v生长素用量过高时会诱导
24、植物产生乙烯。生长素用量过高时会诱导植物产生乙烯。v较高的乙烯引起植物发生形态变化:豌豆上胚轴加较高的乙烯引起植物发生形态变化:豌豆上胚轴加粗、失去负向地性等。粗、失去负向地性等。v用高锰酸钾进行吸附可减少乙烯含量。用高锰酸钾进行吸附可减少乙烯含量。v常用乙烯利(常用乙烯利(2-氯乙基膦酸氯乙基膦酸):):在在pH值高于值高于4.1时,时,即分解释放出乙烯。即分解释放出乙烯。琼琼 脂脂v固体培养基最好的固化剂是琼脂。固体培养基最好的固化剂是琼脂。v是是从从海海藻藻中中提提取取的的一一种种高高分分子子多多糖糖类类物物质质,不不提供任何营养成分,培养材料良好的支持物。提供任何营养成分,培养材料良好
25、的支持物。v用量为用量为3 3-10g/L-10g/L。v溶于热水,在溶于热水,在4040C C以下凝固为凝胶状。以下凝固为凝胶状。v琼脂能吸附细胞代谢中的一些废物。琼脂能吸附细胞代谢中的一些废物。v在在研研究究组组织织或或细细胞胞营营养养代代谢谢时时,应应避避免免使使用用琼琼脂培养基,因为杂质会影响研究结果。脂培养基,因为杂质会影响研究结果。v液液体体培培养养基基中中用用无无灰灰滤滤纸纸制制成成的的纸纸桥桥作作为为支支持持物来培养愈伤组织,避免了琼脂杂质的影响。物来培养愈伤组织,避免了琼脂杂质的影响。成分成分Bacto-琼脂(琼脂(%)Noble-琼脂(琼脂(%)纯化琼脂(纯化琼脂(%)灰分
26、灰分4.52.61.75钙钙0.130.230.27钡钡0.010.010.01硅质硅质0.190.260.09氯化物氯化物0.430.180.13硫酸盐硫酸盐2.541.901.32氮氮0.170.100.14铁铁11.00(mg/L)1.00(mg/L)1.00(mg/L)镁镁285.00(mg/L)260.00(mg/L)695.00(mg/L)铜铜5.00(mg/L)7.50(mg/L)20.00(mg/L)植物组织培养中常用的琼脂的化学成分植物组织培养中常用的琼脂的化学成分 植物培养基的植物培养基的pHpH值值v 植物培养材料大多要求弱酸性的环境。植物培养材料大多要求弱酸性的环境。v
27、 灭菌前需将灭菌前需将pHpH值调节到值调节到5.65.6-5.8-5.8。v 当当pHpH高高于于6 6时时,培培养养基基变变硬硬,不不利利于于培培养养物物的的生长。生长。v 而低于而低于5 5时,琼脂不能很好凝固。时,琼脂不能很好凝固。v 各种培养基在无机营养组成上的差异主要各种培养基在无机营养组成上的差异主要是盐和离子数量上的不同。是盐和离子数量上的不同。v 据无机盐的含量可分为:据无机盐的含量可分为:高无机盐含量培养基高无机盐含量培养基 硝酸钾含量较高培养基硝酸钾含量较高培养基 中等无机盐含量培养基中等无机盐含量培养基 低无机盐含量培养基低无机盐含量培养基应用最为广泛的培养基:应用最为
28、广泛的培养基:MSMS。1 1、高无机盐含量培养基、高无机盐含量培养基v主要有主要有MSMS和和ERER培养基。培养基。v特点:钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高。特点:钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高。微量元素种类齐全。微量元素种类齐全。养分数量及比例比较合适养分数量及比例比较合适v广广泛泛用用于于植植物物的的器器官官、花花药药、细细胞胞及及原原生生质体的培养。质体的培养。2 2、较高硝酸钾含量培养基、较高硝酸钾含量培养基主要有主要有B B5 5和和N N6 6培养基。培养基。适适合合于于木木本本植植物物、十十字字花花科科植植物物和和单单子子叶叶植植物物的的组织和花药培养。组织和花药培养。3 3、中等无机
29、盐含量培养基、中等无机盐含量培养基v主要有主要有NitschNitsch和和NTNT培养基。培养基。v特点:大量元素约为特点:大量元素约为MSMS培养基的一半。培养基的一半。微量元素种类减少,但含量较微量元素种类减少,但含量较MSMS高。高。v适合于花药培养。适合于花药培养。4、低无机盐含量培养基低无机盐含量培养基v主要有主要有White和和Heller。v特特点点:培培养养基基大大量量元元素素含含量量大大幅幅降降低低和和种类减少。种类减少。v多数用于生根培养基。多数用于生根培养基。(二)植物培养基配制母液的配制和培养基的配制母液的配制和培养基的配制1 1母液的配制母液的配制 母母液液的的配配
30、制制是是按按药药品品的的种种类类和和性性质质分分别别配配制制,单单独独保存或几种混合保存或几种混合45C保存。保存。配配制制好好的的母母液液种种类类一一般般有有:大大量量元元素素、微微量量元元素素、钙钙盐盐、铁铁盐盐、有有机机营营养养和和单单独独保保存存的的各各种种生生长长调调节节类物质。类物质。1 1、培养基母液的配制培养基母液的配制v大量元素母液:大量元素母液:10100倍浓度。倍浓度。v微量元素和有机营养母液:微量元素和有机营养母液:100倍浓度。倍浓度。v混合定容:注意药剂的添加次序及稀释度,以免发生混合定容:注意药剂的添加次序及稀释度,以免发生沉淀。沉淀。v钙盐和铁盐:分别单独配制。
31、钙盐和铁盐:分别单独配制。v生长调节类物质:生长调节类物质:0.21.0mg/ml原液。原液。IAA等醇溶性,先用少量等醇溶性,先用少量95%酒精溶解,再用酒精溶解,再用dH2O定定容。容。KT、6-BA、2-Zip、ZT:先溶于少量先溶于少量1mol/L盐酸,再用盐酸,再用dH2O定容。定容。叶酸:先用少量稀氨水溶解后再定容。叶酸:先用少量稀氨水溶解后再定容。培养基的配制方法培养基的配制方法在在干干净净容容器器中中加加入入终终体体积积约约3/43/4的的dHdH2 2O O及及所所需需要要的的琼琼脂脂和和糖糖,煮沸溶解琼脂。不时搅拌以防止琼脂在锅底烧焦或沸腾溢出。煮沸溶解琼脂。不时搅拌以防止
32、琼脂在锅底烧焦或沸腾溢出。加加入入所所需需量量的的各各种种母母液液及及生生长长调调节节物物质质(不不包包括括过过滤滤除除菌菌药药剂)。剂)。加加dHdH2 2O O至近终体积,再次煮沸并加至近终体积,再次煮沸并加dHdH2 2O O至终体积。至终体积。充分混合后用充分混合后用1 1N N盐酸或盐酸或1 1N N氢氧化钠调节氢氧化钠调节pHpH值。值。冷冷却却,加加入入过过滤滤除除菌菌药药剂剂,分分装装,5050mlml培培养养基基/150/150mlml三三角角瓶瓶,封口。封口。高压灭菌,室温凝固备用高压灭菌,室温凝固备用。水水药品药品糖糖 混合混合 pHpH调整调整 加热溶解加热溶解琼脂琼脂
33、玻璃器皿玻璃器皿 水洗水洗 干燥干燥 分装分装 加塞加塞 高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌 植物培养基配制程序植物培养基配制程序冷却冷却过滤灭菌药品过滤灭菌药品接种接种v需需加加入入过过滤滤灭灭菌菌的的药药品品,在在高高压压灭灭菌菌后后,培培养养基凝固前加入,并轻摇使混匀。基凝固前加入,并轻摇使混匀。v培培养养基基终终体体积积定定容容时时,可可以以利利用用台台秤秤通通过过重重量量进行培养基终体积的确定。进行培养基终体积的确定。v培养基的培养基的pHpH值直接影响培养物对离子的吸收,值直接影响培养物对离子的吸收,过酸或过碱不仅影响到培养材料的生长,而且过酸或过碱不仅影响到培养材料的生长,而且会影响到琼脂
34、的凝固。会影响到琼脂的凝固。v经经高高压压高高温温灭灭菌菌后后,由由于于某某些些成成分分的的降降解解或或氧氧化化,酸酸度度会会增增加加(pHpH值值一一般般可可降降低低0.20.2),调调pHpH值时应考虑。值时应考虑。二、动物培养基动物细胞的营养要求比植物细胞的要复杂得多。动物细胞的营养要求比植物细胞的要复杂得多。目前,绝大多数动物细胞必须在培养基中添加目前,绝大多数动物细胞必须在培养基中添加血清等成分不明确的天然培养基成分,还不能血清等成分不明确的天然培养基成分,还不能在成分完全明确的培养基中生长繁殖。在成分完全明确的培养基中生长繁殖。v动物细胞培养基通常是液态。动物细胞培养基通常是液态。
35、v根据其是否能促进细胞生长,可分为:根据其是否能促进细胞生长,可分为:生长培养基(生长培养基(growthmedium)维持培养基(维持培养基(maintenancemedium)按来源,又可分为:按来源,又可分为:合成培养基合成培养基 天然培养基。天然培养基。生长培养基生长培养基v生生长长培培养养基基是是指指用用来来培培养养细细胞胞使使其其快快速速生生长长增增殖殖的培养基。的培养基。v对对动动物物细细胞胞来来说说,一一般般只只要要将将生生长长培培养养基基中中的的血血清浓度降低或全部除去,就可获得维持培养基。清浓度降低或全部除去,就可获得维持培养基。维持培养基维持培养基维维持持培培养养基基是是
36、指指只只能能用用来来维维持持培培养养细细胞胞的的存存活活,但但不能促使细胞生长和增殖的培养基。不能促使细胞生长和增殖的培养基。v培养细胞处于不分裂状态下,更易分泌活性产物培养细胞处于不分裂状态下,更易分泌活性产物v此此时时,若若加加入入特特定定化化学学药药品品,可可诱诱导导细细胞胞产产生生活活性产物;性产物;v若若细细胞胞感感染染了了病病毒毒,则则在在此此状状态态下下病病毒毒会会大大量量扩扩增,从而生产病毒疫苗。增,从而生产病毒疫苗。v特点:能在数周内使培养细胞保持良好状态,而特点:能在数周内使培养细胞保持良好状态,而不会使细胞的特性受到损害。不会使细胞的特性受到损害。v目的:提高细胞的生产力
37、,细胞不生长,能更多目的:提高细胞的生产力,细胞不生长,能更多更快生产终产物。更快生产终产物。v维持培养基成分可能很复杂,也可能很简单。维持培养基成分可能很复杂,也可能很简单。条件培养基条件培养基在在培培养养过过程程中中,有有些些细细胞胞可可能能会会分分泌泌活活性性物物质质到到培培养养液液中中,这这种种培培养养过过某某种种细细胞胞以以后后,含含有有细细胞胞分分泌泌物物 的的 培培 养养 液液 又又 称称 为为 条条 件件 培培 养养 基基(conditionedmedium)。)。天然培养基和合成培养基天然培养基和合成培养基v天天然然培培养养基基主主要要包包括括:各各种种动动物物的的体体液液(
38、血血淋淋巴巴、血血浆和血清)、组织提取液(胎汁、酵母提取物)等浆和血清)、组织提取液(胎汁、酵母提取物)等v合合成成培培养养基基是是指指按按照照体体内内细细胞胞所所需需营营养养的的种种类类和和数数量量配成的成分明确的培养基。配成的成分明确的培养基。v一一般般来来说说,合合成成培培养养基基只只能能维维持持动动物物细细胞胞的的生生存存,要要想使细胞生长和增殖,还需补充部分天然培养基。想使细胞生长和增殖,还需补充部分天然培养基。(一)培养基的成分1 1、生长培养基、生长培养基培养动物细胞用的生长培养基组分包括培养动物细胞用的生长培养基组分包括9 9种:种:水水、无无机机盐盐、微微量量元元素素、维维生
39、生素素、缓缓冲冲系系统统、能能源源和碳源、氮源、激素和生长因子、添加剂等和碳源、氮源、激素和生长因子、添加剂等 水水v对水的要求极其严格对水的要求极其严格v水水是是细细胞胞的的主主要要组组成成成成分分之之一一,水水在在细细胞胞内内主主要要起溶剂作用。起溶剂作用。v细细胞胞吸吸收收的的营营养养物物质质、分分泌泌的的产产物物、代代谢谢的的废废物物都要溶解在水中;都要溶解在水中;v细细胞胞内内的的化化学学反反应应、细细胞胞的的运运动动及及维维持持细细胞胞内内外外的渗透压也离不开水。的渗透压也离不开水。v水是离体培养细胞的重要生存环境水是离体培养细胞的重要生存环境。无机盐(大量元素)无机盐(大量元素)
40、v解解决决培培养养细细胞胞短短期期生生存存问问题题,重重要要的的因因素素是是渗渗透压。透压。v用用于于培培养养细细胞胞的的培培养养基基的的渗渗透透压压必必须须接接近近或或等等于于细细胞胞本本身身的的渗渗透透压压,即即等等渗渗溶溶液液。否否则则细细胞胞就会失水皱缩或吸水膨胀而死亡。就会失水皱缩或吸水膨胀而死亡。v等等渗渗溶溶液液主主要要是是通通过过培培养养基基内内无无机机盐盐中中的的各各种种离子来实现的。离子来实现的。配制动物细胞培养基的无机盐与植物细胞的很不相同配制动物细胞培养基的无机盐与植物细胞的很不相同vNHNH4 4+对对动动物物细细胞胞是是有有毒毒的的,但但它它却却是是植植物物细细胞胞
41、必必需需的的氮源;氮源;vKClKCl和和NaClNaCl在在动动物物细细胞胞培培养养基基中中含含量量都都较较高高,但但它它们们对植物细胞的生长却似乎并不重要。对植物细胞的生长却似乎并不重要。v动动物物细细胞胞以以高高氧氧化化态态的的FeFe3+3+(硝硝酸酸铁铁)为为铁铁源源,而而植植物细胞以物细胞以FeFe2+2+(硫酸亚铁)为铁源。硫酸亚铁)为铁源。微量元素微量元素v缺缺乏乏稀稀有有微微量量元元素素的的培培养养基基对对任任何何真真核核细细胞的培养都是不合适的。胞的培养都是不合适的。v培培养养基基中中微微量量元元素素的的含含量量通通常常都都很很低低,一一般般小小于于1 1 g/Lg/L,水
42、水和和无无机机盐盐中中已已有有足足够够量量,不需要另加。不需要另加。维生素维生素v动物细胞培养也需要维生素,而且动物动物细胞培养也需要维生素,而且动物细胞对维生素种类的要求通常比植物细细胞对维生素种类的要求通常比植物细胞要多一些。胞要多一些。维生素维生素动物(动物(mg/L mg/L)植物(植物(mg/L mg/L)尼克酰胺尼克酰胺1 1-4-4-尼克酸尼克酸-0.50.5-1-1吡哆醇吡哆醇-0.50.5-1-1吡哆醛吡哆醛1 1-4-4-硫胺硫胺1 1-4-40.10.1-10-10核黄素核黄素0.10.40.10.4-维生素维生素B B12121.361.36-叶酸叶酸1.61.6-泛酸
43、泛酸1.61.6-氯化胆碱氯化胆碱1.61.6-动植物细胞培养基中常用的维生素动植物细胞培养基中常用的维生素 维生素维生素缓冲系统缓冲系统v缓冲系统对维持培养基的缓冲系统对维持培养基的pHpH值是至关重要的。值是至关重要的。v动物细胞培养基的动物细胞培养基的pHpH值是通过模拟血浆内天然存值是通过模拟血浆内天然存在的在的COCO2 2/NaHCO/NaHCO3 3系统来控制的。系统来控制的。缓冲系统缓冲系统v肺中肺中:空气中空气中O2扩散到血液中,并与血红细胞结合。血浆扩散到血液中,并与血红细胞结合。血浆中中CO2扩散到空气中,被排出体外。扩散到空气中,被排出体外。v组织中:组织中:血红细胞释
44、放携带的血红细胞释放携带的O2并扩散到组织细胞中,组织并扩散到组织细胞中,组织细胞呼吸产生的细胞呼吸产生的CO2被排放到血浆中。被排放到血浆中。v血浆中血浆中CO2的溶解与释放与形成的溶解与释放与形成H2CO3有关。有关。vNaHCO3作作为为等等渗渗溶溶液液的的一一部部分分加加到到培培养养基基内内。临配制前加入,约临配制前加入,约2g/Lv在在密密闭闭式式培培养养瓶瓶内内,一一方方面面,由由于于NaHCO3不不稳稳定定,易易分分解解产产生生CO2,CO2从从培培养养液液中中游游离离出出来来,使使培培养养液液pH值值升升高高;另另一一方方面面,细细胞胞呼呼吸吸产产生生的的CO2,以以及及细细胞
45、胞代代谢谢产产生生的的酸酸性性代代谢产物,又使培养液谢产物,又使培养液pH值降低。值降低。培养基颜色的变化培养基颜色的变化v在培养开始的时候,培养基的在培养开始的时候,培养基的pHpH值可能会明显上升,值可能会明显上升,但随着细胞的生长和细胞数目的增多,培养基的但随着细胞的生长和细胞数目的增多,培养基的pHpH值就会逐渐降低。值就会逐渐降低。v酚红作为酚红作为pHpH指示剂:指示剂:培养基的颜色变化是:樱桃红色培养基的颜色变化是:樱桃红色 粉红色粉红色 黄黄色。色。v在使用培养基之前,先通入在使用培养基之前,先通入COCO2 2;或在或在COCO2 2培培养箱内,开放式培养的话养箱内,开放式培
46、养的话v培养基的颜色变化则是:培养基的颜色变化则是:樱桃红色樱桃红色 黄色黄色pHv动物细胞对动物细胞对pHpH的稳定性要求较高,。植物的稳定性要求较高,。植物细胞则要求不高。细胞则要求不高。v一般通过改变培养基中的磷酸盐或碳酸盐一般通过改变培养基中的磷酸盐或碳酸盐的比例来达到一定的的比例来达到一定的pHpH值。值。能源和碳源能源和碳源v葡萄糖葡萄糖(1(1-4g/L)-4g/L)是动物细胞的主要碳源。是动物细胞的主要碳源。v丙丙酮酮酸酸、琥琥珀珀酸酸和和肌肌酸酸等等碳碳源源也也常常常常成成为为动动物物细胞的补充能源。细胞的补充能源。v当当不不要要求求培培养养细细胞胞以以最最大大速速度度生生长
47、长时时,可可以以用用半乳糖代替葡萄糖。半乳糖代替葡萄糖。能源和碳源能源和碳源v植植物物细细胞胞的的能能源源包包括括蔗蔗糖糖、果果糖糖、乳乳糖糖、麦麦芽芽糖糖、海藻糖和淀粉。海藻糖和淀粉。v蔗蔗糖糖不不能能直直接接穿穿过过细细胞胞壁壁进进入入细细胞胞内内被被利利用用,但但植植物物的的细细胞胞壁壁内内含含有有蔗蔗糖糖酶酶(invertaseinvertase),它它能能把把蔗蔗糖糖水水解解为为葡葡萄萄糖糖和和果果糖糖,葡葡萄萄糖糖和和果果糖糖再再穿膜进入细胞内被利用。穿膜进入细胞内被利用。氮氮 源源动物细胞合成蛋白质和核酸的氮源有两种:动物细胞合成蛋白质和核酸的氮源有两种:成成分分明明确确的的氮氮
48、源源 指指动动物物细细胞胞合合成成蛋蛋白白质质和和生生长长所所必不可少的一些必需氨基酸和非必需氨基酸。必不可少的一些必需氨基酸和非必需氨基酸。成成分分不不明明确确的的氮氮源源 指指动动物物细细胞胞培培养养基基中中加加入入的的各各种种动动物物血血清清、组组织织提提取取液液以以及及蛋蛋白白水水解解产产物物(如如水水解解乳蛋白)等。乳蛋白)等。血清(血清(serumserum)v血清是大多数生长培养基的一个成分。血清是大多数生长培养基的一个成分。v最常用的是牛血清,但马最常用的是牛血清,但马、人、兔及其他来源的血人、兔及其他来源的血清有时也用。清有时也用。v一般来讲,动物愈年轻,其血清愈有利于细胞生
49、长。一般来讲,动物愈年轻,其血清愈有利于细胞生长。所以成年牛血清不如小牛血清所以成年牛血清不如小牛血清,小牛血清不如胎牛小牛血清不如胎牛血清(血清(fetal bovine serumfetal bovine serum)。)。血清(血清(serum)v血清中已知的贴壁和铺展因子有:血清中已知的贴壁和铺展因子有:纤粘蛋白(纤粘蛋白(fibronectin)冷不溶球蛋白(冷不溶球蛋白(cold-insolubleglobulin,CIG)血清铺展因子(血清铺展因子(serumspreadingfactor,SSF)胎球蛋白胎球蛋白v目前尚不充分了解。目前尚不充分了解。v血清中含有多种细胞生长和增
50、殖所必不可少的激素、血清中含有多种细胞生长和增殖所必不可少的激素、生长因子以及贴壁和铺展因子,其作用:生长因子以及贴壁和铺展因子,其作用:血清和蛋白水解产物为培养细胞提供氮源。血清和蛋白水解产物为培养细胞提供氮源。具有促进细胞生长的能力。具有促进细胞生长的能力。具有促进细胞在培养基质上附着和铺开的能力。具有促进细胞在培养基质上附着和铺开的能力。抑制蛋白质水解酶活性的能力。抑制蛋白质水解酶活性的能力。血血清清对对蛋蛋白白质质水水解解酶酶活活性性的的抑抑制制作作用用:可可以以保保护护体体外外培培养养细细胞胞不不受受死死细细胞胞所所释放的蛋白酶的伤害,释放的蛋白酶的伤害,抑抑制制传传代代时时所所用用