《细胞实验基本操作与实验室要求.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞实验基本操作与实验室要求.pptx（129页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、 第一节 实验室及仪器设备 第二节 实验基本操作 第三节 培养基及其配制第1页/共129页第一节 实验室及仪器设备细细胞胞工工程程实实验验室室要要能能满满足足清清洗洗、无无菌菌操操作作、培培养养基基制制备备、贮贮藏藏和和培养鉴定等多方面的要求。培养鉴定等多方面的要求。第2页/共129页1、植物实验室基本操作室无菌操作室培养室鉴定分析室温 室一、实验室第3页/共129页2 2、动物细胞培养室、动物细胞培养室原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无尘。尘。实验室设置上至少有实验室设置上至少有4
2、4个房间：个房间：基本操作室基本操作室，洗涤，灭菌。，洗涤，灭菌。缓冲间缓冲间，位于准备室和培养室之间。，位于准备室和培养室之间。无菌培养室无菌培养室，内有超净工作台，一般应在内侧，室内可消毒，培养箱。，内有超净工作台，一般应在内侧，室内可消毒，培养箱。鉴定分析室鉴定分析室，用于细胞的观察和分析研究。，用于细胞的观察和分析研究。第4页/共129页二、实验室仪器设备（一）必要器皿1 1、培培养养器器皿皿（动动物物细细胞胞培培养养一一般般为为塑塑料料器器皿皿，优优点点是是一一次次性性使使用用，已已消消毒毒灭灭菌菌密密封包装，打开即可用；植物细胞培养一般用三角瓶）封包装，打开即可用；植物细胞培养一般
3、用三角瓶）2 2、盛装器皿（各种玻璃器皿）、盛装器皿（各种玻璃器皿）3 3、计量器皿（量筒、吸管、加样器等）、计量器皿（量筒、吸管、加样器等）4 4、金属器皿（用于解剖、取材、剪切组织等）、金属器皿（用于解剖、取材、剪切组织等）第5页/共129页第6页/共129页第7页/共129页（二）常用仪器设备1 1无菌操作仪器设备无菌操作仪器设备 医医用用超超净净工工作作台台(气气流流水水平平型型和和垂垂直直型型)，高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌锅锅(手手提提式式、立立式式)，干干热灭菌烘箱，过滤除菌装置。热灭菌烘箱，过滤除菌装置。2 2培养仪器设备培养仪器设备 植植物物：培培养养架架、摇摇床床、振振荡荡式式
4、培培养养机机(100次次/min)、恒恒温温恒恒湿湿光光照照培培养养箱箱、暗暗培培养箱等。养箱等。动物：恒温培养箱及动物：恒温培养箱及CO2恒温培养箱。恒温培养箱。第8页/共129页3药品存贮和配制仪器设备4观察分析仪器设备 显微镜（高倍、倒置、实体解剖和荧光显微镜等）及配套照相系统、解剖镜、离心机、液氮容器、恒温箱、精密天平等。5其它仪器设备，如流式细胞仪，酶标仪等。第9页/共129页第10页/共129页第11页/共129页二氧化碳细胞培养箱第12页/共129页第13页/共129页第14页/共129页第15页/共129页MB-IV 型 酶 标 检 测 仪 第16页/共129页第17页/共12
5、9页第18页/共129页第19页/共129页第二节第二节 实验室的基本操作实验室的基本操作实验室的基本操作是围绕实验室的基本操作是围绕无菌无菌要求进行的，主要包括清洗、消毒灭菌，无菌要求进行的，主要包括清洗、消毒灭菌，无菌操作等。操作等。第20页/共129页一、清洗未用过的玻璃器皿：常有游离碱性物质，使用前，先用1%稀盐酸浸泡一夜，然后用洗衣粉洗涤，清水冲洗，蒸馏水冲洗一遍，晾干备用。已用过的玻璃器皿：用洗衣粉刷洗，清水冲洗，晾干备用。新的塑料器皿：打开即用。已用过的塑料器皿金属器皿：一般不宜用洗涤液洗涤，新的用热洗衣粉水洗净、冲洗后，蒸馏水冲洗擦干即可。第21页/共129页细细胞胞培培养养的
6、的玻玻璃璃器器皿皿常常需需用用洗洗液液浸浸泡泡，再再拿拿出出冲冲洗，洗液配方如下：洗，洗液配方如下：配方成分配方成分弱液弱液次强液次强液强液强液常用配方常用配方重铬酸钾重铬酸钾(g)浓硫酸浓硫酸(ml)蒸馏水蒸馏水(ml)501001000100200100060800200100200800第22页/共129页1、KCrO4液要冷却后才能加浓硫酸。以防暴沸。2、浓硫酸要慢慢倒入KCrO4液中。3、洗液要密封保存，以免失效。正常洗液黑棕色 蓝绿色（效用变弱）第23页/共129页二、消毒灭菌严格的消毒灭菌起着至关重要的作用，主要物理灭菌方法有：严格的消毒灭菌起着至关重要的作用，主要物理灭菌方法有
7、：湿热灭菌湿热灭菌:高温高压法、流动蒸汽或沸水高温高压法、流动蒸汽或沸水121，1.0-1.1Kg/cm2，20-30分钟分钟干干热热灭灭菌菌：烤烤箱箱、焚焚烧烧、酒酒精精灯灯,于于150恒恒温温40 min,或或120恒恒温温2h，或或160恒温恒温1.5-2h(芽孢杆菌芽孢杆菌)射线照射灭菌射线照射灭菌：紫外线：紫外线(细胞培养室，超净工作台细胞培养室，超净工作台)、电离辐射、电离辐射过滤灭菌过滤灭菌：微孔滤膜、玻璃丝滤器：微孔滤膜、玻璃丝滤器m第24页/共129页高温高压灭菌可能出现的问题：高温高压灭菌可能出现的问题：lpH值下降值下降l太高温度灭菌时可能使糖焦化，可能产生毒性，对有些培
8、养基应选择合适条件灭太高温度灭菌时可能使糖焦化，可能产生毒性，对有些培养基应选择合适条件灭菌。菌。l灭菌时间过长使盐沉淀，同时使琼脂解聚灭菌时间过长使盐沉淀，同时使琼脂解聚l挥发性物质不能高温灭菌，否则会被破坏挥发性物质不能高温灭菌，否则会被破坏第25页/共129页第26页/共129页化学消毒灭菌主要有：化学消毒灭菌主要有：熏蒸灭菌熏蒸灭菌药物蒸汽对室内空气进行杀菌。药物蒸汽对室内空气进行杀菌。甲醛和高锰酸钾混合后产生大量蒸汽。甲醛和高锰酸钾混合后产生大量蒸汽。醋烧开。醋烧开。化学药品灭菌化学药品灭菌7070%-75%-75%酒精，酒精，升汞升汞漂白粉漂白粉新洁尔敏新洁尔敏过氧化氢过氧化氢抗生
9、素抑菌法抗生素抑菌法 青霉素、链霉素、新霉素青霉素、链霉素、新霉素第27页/共129页消毒剂消毒剂使用浓度使用浓度(%)去除难易去除难易消毒时间消毒时间(min)效果效果次氯酸钙次氯酸钙次氯酸钠次氯酸钠漂白粉漂白粉溴水溴水过氧化氢过氧化氢升汞升汞酒精酒精抗生素抗生素硝酸银硝酸银9102饱和溶液饱和溶液1210120.11707545(mg/L)1易易易易易易易易最易最易较难较难易易中中较难较难5305305302105152100.223060530很好很好很好很好很好很好很好很好好好最好最好好好较好较好好好常用消毒剂消毒灭菌效果比较表常用消毒剂消毒灭菌效果比较表第28页/共129页三、无 菌
10、 操 作1、无菌操作前的准备工作：、无菌操作前的准备工作：l穿好工作服、戴上工作帽和口罩。穿好工作服、戴上工作帽和口罩。l将将各各种种操操作作所所用用的的金金属属器器械械浸浸泡泡在在95或或70的的酒酒精，点燃酒精灯。精，点燃酒精灯。l将将耐耐热热器器皿皿（不不锈锈钢钢小小盘盘）中中加加入入少少量量酒酒精精，将将蘸蘸有有酒酒精精的的金金属属器器械械及及器器械械支支架架放放入入耐耐热热器器皿皿中中灼灼烧烧，待凉后备用。待凉后备用。l用用7075的的酒酒精精擦擦拭拭新新培培养养容容器器和和继继代代培培养养容容器表面，放置超净台上待用。器表面，放置超净台上待用。l用上述浓度的酒精擦拭双手和前臂。用上
11、述浓度的酒精擦拭双手和前臂。第29页/共129页第30页/共129页第31页/共129页2、无菌操作步骤l 将培养材料灭菌后放入已消毒的培养皿中，置于超净工作台酒精灯火焰下方，进行适当切割或其他处理。l 在酒精灯火焰处将培养瓶盖轻轻打开，瓶口在火焰处旋转灼烧。l 将镊子过火，用镊子将培养材料置于培养基上l 将镊子、瓶口及塞子过火后盖回瓶口。继代培养用灭菌的器具（镊子或吸管）直接将培养材料放置在新培养基上。第32页/共129页第三节 培养基及其配制第33页/共129页定义：培养基是离体培养组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供的近似生物体内生存的营养环境。没有任何一种培养基能够适合一
12、切类型的组织、细胞和器官的培养。第34页/共129页必要元素在细胞内的主要生理作用必要元素在细胞内的主要生理作用组成各种化合物，参与有机体的构造，成为结构物质。组成各种化合物，参与有机体的构造，成为结构物质。构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的生理代谢。构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的生理代谢。元元素素间间互互相相协协调调，维维持持离离子子浓浓度度平平衡衡、胶胶体体稳稳定定、电电荷荷平平衡衡等等电电化化学学方方面的作用。面的作用。调节形态发生和组织器官的建成。调节形态发生和组织器官的建成。第35页/共129页一、植物细胞培养基及其配制 完善的植物培养基配方为：完善的植物培养基配方为：水
13、分水分 无机营养成分无机营养成分 有机营养成分有机营养成分 生长调节物质生长调节物质 琼脂琼脂第36页/共129页第37页/共129页（一）培养基成分1 1、无机元素、无机元素氮氮-各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要组成成分。要组成成分。钙钙-细胞壁的成分之一细胞壁的成分之一铁、锌、钼铁、锌、钼-某些酶的组成成分某些酶的组成成分植植物物缺缺乏乏无无机机元元素素可可能能引引起起的的疾疾病病：植植物物失失绿绿、细胞分裂停止、细胞分化受阻等。细胞分裂停止、细胞分化受阻等。营营养养元元素素过过多多可可以以引引起起植植物物细细胞胞代代谢谢障障碍碍、生生长抑制。长抑
14、制。第38页/共129页2 2、有机营养成分、有机营养成分提供促进培养细胞生长和分化所必需的有机碳、氮等营养物质，包括：提供促进培养细胞生长和分化所必需的有机碳、氮等营养物质，包括：氨基酸类氨基酸类 维生素类维生素类 糖类糖类 天然有机添加物类天然有机添加物类第39页/共129页氨基酸类氨基酸类常用：甘氨酸常用：甘氨酸有时用：丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白和水解乳蛋白等。有时用：丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白和水解乳蛋白等。用量通常为用量通常为2 2-3mg/L-3mg/L。水水解解酪酪蛋蛋白白CH和和水水解解乳乳蛋蛋白白LH，对对培培养养材材料料的的细细胞胞分
15、分化化有有良良好好的的促促进进作作用用，用量为用量为100100-2 000mg/L-2 000mg/L第40页/共129页维生素类维生素类维生素类是以辅酶形式参与植物细胞代谢活动的重要物质，对生长、分化有很好的维生素类是以辅酶形式参与植物细胞代谢活动的重要物质，对生长、分化有很好的促进作用。促进作用。-10mg/L 常用：常用：盐酸硫胺素（维生素盐酸硫胺素（维生素B1）盐酸吡哆醇（维生素盐酸吡哆醇（维生素B6）烟酸（维生素烟酸（维生素B3）叶酸（维生素叶酸（维生素Bc）有时用：生物素（维生素有时用：生物素（维生素H）泛酸钙（维生素泛酸钙（维生素B5）抗坏血酸（维生素抗坏血酸（维生素C）第41
16、页/共129页糖类糖类糖类是培养基的主要碳源。糖类是培养基的主要碳源。常用碳源是蔗糖，还有葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖、山梨糖等。常用碳源是蔗糖，还有葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖、山梨糖等。适宜的浓度为适宜的浓度为2%2%-5%-5%。离体双子叶植物根：以蔗糖为碳源最好。离体双子叶植物根：以蔗糖为碳源最好。单子叶植物的根：以右旋糖（葡萄糖）为碳源最好。单子叶植物的根：以右旋糖（葡萄糖）为碳源最好。第42页/共129页肌肌 醇醇在糖类的互相转化中起作用，是培养基中不可缺少的有机营养。在糖类的互相转化中起作用，是培养基中不可缺少的有机营养。形成细胞壁的构建物质：果胶质形成细胞壁的构建物
17、质：果胶质 。形成植酸形成植酸 与与Ca2+、Mg2+结合成植酸钙镁。结合成植酸钙镁。形成磷脂，细胞膜组分。形成磷脂，细胞膜组分。可见肌醇参与了碳水化合物、磷脂代谢和离子平衡等生理活动。可见肌醇参与了碳水化合物、磷脂代谢和离子平衡等生理活动。用量为用量为50-100mg/L。第43页/共129页 天然有机添加物类天然有机添加物类椰乳、马铃薯汁、酵母提取液、番茄汁等。椰乳、马铃薯汁、酵母提取液、番茄汁等。化化学学成成分分不不明明的的复复杂杂营营养养混混合合物物，对对细细胞胞和和组组织织的的生生长长和和分分化化有有明明显显的的促促进进作用，但质和量受多种因素影响，实验的可重复性差。作用，但质和量受
18、多种因素影响，实验的可重复性差。第44页/共129页生长调节物质生长调节物质是促进培养植物生长良好的主要因素。是促进培养植物生长良好的主要因素。由无机和有机营养构成的培养基仅保证了培养物的生存，只有配以适当的植由无机和有机营养构成的培养基仅保证了培养物的生存，只有配以适当的植物生长调节物质时，才能诱导细胞分裂的启动，愈伤组织生长及根、芽分化物生长调节物质时，才能诱导细胞分裂的启动，愈伤组织生长及根、芽分化和胚状体的发育。和胚状体的发育。第45页/共129页植物生长调节物质包括：植物生长调节物质包括：生长素（生长素（auxin）类类细胞分裂素类（细胞分裂素类（cytokinin）赤霉素（赤霉素（
19、gibberellin）类类脱落酸（脱落酸（abscisicacid）乙烯（乙烯（ethylene）等等第46页/共129页生长素类生长素类组织培养中生长素的作用：组织培养中生长素的作用：促进细胞伸长生长和细胞分裂促进细胞伸长生长和细胞分裂 诱导愈伤组织形成诱导愈伤组织形成 促进生根促进生根 诱导不定芽的分化（与细胞分裂素配合）诱导不定芽的分化（与细胞分裂素配合）诱导侧芽的萌发与生长诱导侧芽的萌发与生长 胚状体的产生等胚状体的产生等第47页/共129页第48页/共129页常用生长素有：常用生长素有：2,4-2,4-二氯苯氧乙酸：有抑制芽形成的副作用，一般用于启动细胞的脱分化。二氯苯氧乙酸：有抑
20、制芽形成的副作用，一般用于启动细胞的脱分化。诱导分化则用诱导分化则用NAANAA或或IBAIBA、IAAIAA。萘乙酸（萘乙酸（NAANAA）吲吲哚哚丁丁酸酸（IBAIBA）：人人工工合合成成，120120C C仍仍很很 稳定。组织培养中常用。生根效果好。稳定。组织培养中常用。生根效果好。吲哚乙酸（吲哚乙酸（IAAIAA）等：天然植物生长素，见光易分解，高温高压易破坏。等：天然植物生长素，见光易分解，高温高压易破坏。第49页/共129页细胞分裂素类细胞分裂素类细胞分裂素的作用：细胞分裂素的作用：促进细胞分裂促进细胞分裂 诱导愈伤组织或器官分化不定芽诱导愈伤组织或器官分化不定芽 抑制顶端优势而促
21、进茎的增殖抑制顶端优势而促进茎的增殖 抑制离体组织或器官衰老等抑制离体组织或器官衰老等第50页/共129页第51页/共129页常用的细胞分裂素有：常用的细胞分裂素有：激动素或糖基腺嘌呤（激动素或糖基腺嘌呤（kinetin，KT）（见光易分解，需暗处保存）（见光易分解，需暗处保存）6-苄基腺嘌呤（苄基腺嘌呤（6-BA）2-异戊烯腺嘌呤（异戊烯腺嘌呤（2-Zip）玉米素（玉米素（zeatin，ZT）等等第52页/共129页赤霉素类赤霉素类赤霉素（赤霉素（gibberellin，GA）有有20多种。多种。组织培养中仅使用组织培养中仅使用GA3一种：能促进诱导形成的不定胚正常发育成小植株。一种：能促进
22、诱导形成的不定胚正常发育成小植株。GA3不耐热，溶水后不稳定，需溶于酒精中，过滤除菌。不耐热，溶水后不稳定，需溶于酒精中，过滤除菌。第53页/共129页脱落酸脱落酸脱落酸（脱落酸（abscisicacid，ABA）的作用：的作用：抑制蛋白质合成抑制蛋白质合成 抵消和抑制生长素、细胞分裂素和抵消和抑制生长素、细胞分裂素和GA发挥作用发挥作用 诱导休眠诱导休眠 促进衰老和脱落促进衰老和脱落 抑制气孔开放，减少蒸腾作用抑制气孔开放，减少蒸腾作用 对一些培养物芽的形成有促进作用对一些培养物芽的形成有促进作用第54页/共129页短日照条件诱导脱落酸合成，延缓生长、促进落叶、形成休眠芽（秋季）。短日照条件
23、诱导脱落酸合成，延缓生长、促进落叶、形成休眠芽（秋季）。长日照条件诱导赤霉素合成，促进生长、诱导开花（春夏季）。长日照条件诱导赤霉素合成，促进生长、诱导开花（春夏季）。第55页/共129页乙烯乙烯乙烯的作用：乙烯的作用：具有促熟果实具有促熟果实 促进脱落和衰老促进脱落和衰老 促进橡胶、漆、松脂等次生物质的排泌促进橡胶、漆、松脂等次生物质的排泌 促进菠萝开花促进菠萝开花 增加黄瓜等雌花数量等增加黄瓜等雌花数量等第56页/共129页培养时植物组织自身会散发出乙烯。培养时植物组织自身会散发出乙烯。生长素用量过高时会诱导植物产生乙烯。生长素用量过高时会诱导植物产生乙烯。较高的乙烯引起植物发生形态变化：
24、豌豆上胚轴加粗、失去负向地性等。较高的乙烯引起植物发生形态变化：豌豆上胚轴加粗、失去负向地性等。用高锰酸钾进行吸附可减少乙烯含量。用高锰酸钾进行吸附可减少乙烯含量。常用乙烯利（常用乙烯利（2-氯乙基膦酸氯乙基膦酸）：）：在在pH值高于值高于4.1时，即分解释放出乙烯。时，即分解释放出乙烯。第57页/共129页琼琼 脂脂固体培养基最好的固化剂是琼脂。固体培养基最好的固化剂是琼脂。是是从从海海藻藻中中提提取取的的一一种种高高分分子子多多糖糖类类物物质质，不不提提供供任任何何营营养养成成分分，培培养养材材料料良好的支持物。良好的支持物。用量为用量为3 3-10g/L-10g/L。溶于热水，在溶于热水
25、，在4040C C以下凝固为凝胶状。以下凝固为凝胶状。琼脂能吸附细胞代谢中的一些废物。琼脂能吸附细胞代谢中的一些废物。第58页/共129页在在研研究究组组织织或或细细胞胞营营养养代代谢谢时时，应应避避免免使使用用琼琼脂脂培培养养基基，因因为为杂杂质质会会影影响响研研究结果。究结果。液液体体培培养养基基中中用用无无灰灰滤滤纸纸制制成成的的纸纸桥桥作作为为支支持持物物来来培培养养愈愈伤伤组组织织，避避免免了了琼琼脂杂质的影响。脂杂质的影响。第59页/共129页成分成分Bacto-琼脂（琼脂（%）Noble-琼脂（琼脂（%）纯化琼脂（纯化琼脂（%）灰分灰分4.52.61.75钙钙0.130.230.
26、27钡钡0.010.010.01硅质硅质0.190.260.09氯化物氯化物0.430.180.13硫酸盐硫酸盐2.541.901.32氮氮0.170.100.14铁铁11.00（mg/L）1.00（mg/L）1.00（mg/L）镁镁285.00（mg/L）260.00（mg/L）695.00（mg/L）铜铜5.00（mg/L）7.50（mg/L）20.00（mg/L）植物组织培养中常用的琼脂的化学成分 第60页/共129页植物培养基的植物培养基的pHpH值值 植物培养材料大多要求弱酸性的环境。植物培养材料大多要求弱酸性的环境。灭菌前需将灭菌前需将pHpH。当当pHpH高于高于6 6时，培养基
27、变硬，不利于培养物的生长。时，培养基变硬，不利于培养物的生长。而低于而低于5 5时，琼脂不能很好凝固。时，琼脂不能很好凝固。第61页/共129页 各种培养基在无机营养组成上的差异主要是盐和离子数量上的不同。各种培养基在无机营养组成上的差异主要是盐和离子数量上的不同。据无机盐的含量可分为：据无机盐的含量可分为：高无机盐含量培养基高无机盐含量培养基 硝酸钾含量较高培养基硝酸钾含量较高培养基 中等无机盐含量培养基中等无机盐含量培养基 低无机盐含量培养基低无机盐含量培养基应用最为广泛的培养基：应用最为广泛的培养基：MSMS。第62页/共129页1 1、高无机盐含量培养基、高无机盐含量培养基主要有主要有
28、MSMS和和ERER培养基。培养基。特点：钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高。特点：钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高。微量元素种类齐全。微量元素种类齐全。养分数量及比例比较合适养分数量及比例比较合适广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。第63页/共129页2 2、较高硝酸钾含量培养基、较高硝酸钾含量培养基主要有主要有B B5 5和和N N6 6培养基。培养基。适合于木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。适合于木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。第64页/共129页3 3、中等无机盐含量培养基、中等无机盐含量培养基主要有主
29、要有NitschNitsch和和NTNT培养基。培养基。特点：大量元素约为特点：大量元素约为MSMS培养基的一半。培养基的一半。微量元素种类减少，但含量较微量元素种类减少，但含量较MSMS高。高。适合于花药培养。适合于花药培养。第65页/共129页4、低无机盐含量培养基低无机盐含量培养基主要有主要有White和和Heller。特点：培养基大量元素含量大幅降低和种类减少。特点：培养基大量元素含量大幅降低和种类减少。多数用于生根培养基。多数用于生根培养基。第66页/共129页（二）植物培养基配制母液的配制和培养基的配制母液的配制和培养基的配制1 1母液的配制母液的配制 母液的配制是按药品的种类和性
30、质分别配制，单独保存或几种混合母液的配制是按药品的种类和性质分别配制，单独保存或几种混合45C保存。保存。配制好的母液种类一般有：大量元素、微量元素、钙盐、铁盐、有机营养和单独保存的各种生长调节类物质。配制好的母液种类一般有：大量元素、微量元素、钙盐、铁盐、有机营养和单独保存的各种生长调节类物质。第67页/共129页1 1、培养基母液的配制培养基母液的配制大量元素母液：大量元素母液：10100倍浓度。倍浓度。微量元素和有机营养母液：微量元素和有机营养母液：100倍浓度。倍浓度。混合定容：注意药剂的添加次序及稀释度，以免发生沉淀。混合定容：注意药剂的添加次序及稀释度，以免发生沉淀。钙盐和铁盐：分
31、别单独配制。钙盐和铁盐：分别单独配制。mg/ml原液。原液。IAA等醇溶性，先用少量等醇溶性，先用少量95%酒精溶解，再用酒精溶解，再用dH2O定容。定容。KT、6-BA、2-Zip、ZT：先溶于少量先溶于少量1mol/L盐酸，再用盐酸，再用dH2O定容。定容。叶酸：先用少量稀氨水溶解后再定容。叶酸：先用少量稀氨水溶解后再定容。第68页/共129页培养基的配制方法培养基的配制方法在在干干净净容容器器中中加加入入终终体体积积约约3/43/4的的dHdH2 2O O及及所所需需要要的的琼琼脂脂和和糖糖，煮煮沸沸溶溶解解琼琼脂脂。不不时时搅搅拌拌以以防防止止琼琼脂脂在在锅锅底底烧烧焦焦或或沸沸腾溢出
32、。腾溢出。加加入入所所需需量量的的各各种种母母液液及及生生长长调调节节物物质质（不不包包括括过过滤滤除除菌菌药剂）。药剂）。加加dHdH2 2O O至近终体积，再次煮沸并加至近终体积，再次煮沸并加dHdH2 2O O至终体积。至终体积。充分混合后用充分混合后用1 1N N盐酸或盐酸或1 1N N氢氧化钠调节氢氧化钠调节pHpH值。值。冷冷却却，加加入入过过滤滤除除菌菌药药剂剂，分分装装，5050mlml培培养养基基/150/150mlml三三角瓶，封口。角瓶，封口。高压灭菌，室温凝固备用高压灭菌，室温凝固备用。第69页/共129页水水药品药品糖糖 混合混合 pHpH调整调整 加热溶解加热溶解琼
33、脂琼脂玻璃器皿玻璃器皿 水洗水洗 干燥干燥 分装分装 加塞加塞 高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌 植物培养基配制程序植物培养基配制程序冷却过滤灭菌药品接种第70页/共129页需加入过滤灭菌的药品，在高压灭菌后，培养基凝固前加入，并轻摇使混匀。需加入过滤灭菌的药品，在高压灭菌后，培养基凝固前加入，并轻摇使混匀。培养基终体积定容时，可以利用台秤通过重量进行培养基终体积的确定。培养基终体积定容时，可以利用台秤通过重量进行培养基终体积的确定。第71页/共129页培养基的培养基的pHpH值直接影响培养物对离子的吸收，过酸或过碱不仅影响到培养材值直接影响培养物对离子的吸收，过酸或过碱不仅影响到培养材料的生长，而且
34、会影响到琼脂的凝固。料的生长，而且会影响到琼脂的凝固。经经高高压压高高温温灭灭菌菌后后，由由于于某某些些成成分分的的降降解解或或氧氧化化，酸酸度度会会增增加加（pHpH值值一一般般可可降低降低0.20.2），调），调pHpH值时应考虑。值时应考虑。第72页/共129页二、动物培养基动物细胞的营养要求比植物细胞的要复杂得多。动物细胞的营养要求比植物细胞的要复杂得多。目前，绝大多数动物细胞必须在培养基中添加血清等成分不明确的天然培目前，绝大多数动物细胞必须在培养基中添加血清等成分不明确的天然培养基成分，还不能在成分完全明确的培养基中生长繁殖。养基成分，还不能在成分完全明确的培养基中生长繁殖。第73
35、页/共129页动物细胞培养基通常是液态。动物细胞培养基通常是液态。根据其是否能促进细胞生长，可分为：根据其是否能促进细胞生长，可分为：生长培养基（生长培养基（growthmedium）维持培养基（维持培养基（maintenancemedium）按来源，又可分为：按来源，又可分为：合成培养基合成培养基 天然培养基。天然培养基。第74页/共129页生长培养基生长培养基生长培养基是指用来培养细胞使其快速生长增殖的培养基。生长培养基是指用来培养细胞使其快速生长增殖的培养基。对对动动物物细细胞胞来来说说，一一般般只只要要将将生生长长培培养养基基中中的的血血清清浓浓度度降降低低或或全全部部除除去去，就就可
36、可获获得维持培养基。得维持培养基。第75页/共129页维持培养基维持培养基维维持持培培养养基基是是指指只只能能用用来来维维持持培培养养细细胞胞的的存存活活，但但不不能能促促使使细细胞胞生生长长和和增增殖殖的的培培养养基。基。培养细胞处于不分裂状态下，更易分泌活性产物培养细胞处于不分裂状态下，更易分泌活性产物此时，若加入特定化学药品，可诱导细胞产生活性产物；此时，若加入特定化学药品，可诱导细胞产生活性产物；若细胞感染了病毒，则在此状态下病毒会大量扩增，从而生产病毒疫苗。若细胞感染了病毒，则在此状态下病毒会大量扩增，从而生产病毒疫苗。第76页/共129页特点：能在数周内使培养细胞保持良好状态，而不
37、会使细胞的特性受到损害。特点：能在数周内使培养细胞保持良好状态，而不会使细胞的特性受到损害。目的：提高细胞的生产力，细胞不生长，能更多更快生产终产物。目的：提高细胞的生产力，细胞不生长，能更多更快生产终产物。维持培养基成分可能很复杂，也可能很简单。维持培养基成分可能很复杂，也可能很简单。第77页/共129页条件培养基条件培养基在在培培养养过过程程中中，有有些些细细胞胞可可能能会会分分泌泌活活性性物物质质到到培培养养液液中中，这这种种培培养养过过某某种种细细胞胞以以后，含有细胞分泌物的培养液又称为条件培养基后，含有细胞分泌物的培养液又称为条件培养基(conditionedmedium）。）。第7
38、8页/共129页天然培养基和合成培养基天然培养基和合成培养基天天然然培培养养基基主主要要包包括括:各各种种动动物物的的体体液液（血血淋淋巴巴、血血浆浆和和血血清清）、组组织织提提取取液液（胎胎汁汁、酵母提取物）等酵母提取物）等合成培养基是指按照体内细胞所需营养的种类和数量配成的成分明确的培养基。合成培养基是指按照体内细胞所需营养的种类和数量配成的成分明确的培养基。一一般般来来说说，合合成成培培养养基基只只能能维维持持动动物物细细胞胞的的生生存存，要要想想使使细细胞胞生生长长和和增增殖殖，还还需需补补充充部分天然培养基。部分天然培养基。第79页/共129页(一)培养基的成分1 1、生长培养基、生
39、长培养基培养动物细胞用的生长培养基组分包括培养动物细胞用的生长培养基组分包括9 9种：种：水水、无无机机盐盐、微微量量元元素素、维维生生素素、缓缓冲冲系系统统、能能源源和和碳碳源源、氮氮源源、激激素素和和生生长长因因子、添加剂等子、添加剂等 第80页/共129页 水水对水的要求极其严格对水的要求极其严格水是细胞的主要组成成分之一，水在细胞内主要起溶剂作用。水是细胞的主要组成成分之一，水在细胞内主要起溶剂作用。细胞吸收的营养物质、分泌的产物、代谢的废物都要溶解在水中；细胞吸收的营养物质、分泌的产物、代谢的废物都要溶解在水中；细胞内的化学反应、细胞的运动及维持细胞内外的渗透压也离不开水。细胞内的化
40、学反应、细胞的运动及维持细胞内外的渗透压也离不开水。水是离体培养细胞的重要生存环境水是离体培养细胞的重要生存环境。第81页/共129页 无机盐（大量元素）无机盐（大量元素）解决培养细胞短期生存问题，重要的因素是渗透压。解决培养细胞短期生存问题，重要的因素是渗透压。用用于于培培养养细细胞胞的的培培养养基基的的渗渗透透压压必必须须接接近近或或等等于于细细胞胞本本身身的的渗渗透透压压，即即等等渗渗溶液。否则细胞就会失水皱缩或吸水膨胀而死亡。溶液。否则细胞就会失水皱缩或吸水膨胀而死亡。等渗溶液主要是通过培养基内无机盐中的各种离子来实现的。等渗溶液主要是通过培养基内无机盐中的各种离子来实现的。第82页/
41、共129页配制动物细胞培养基的无机盐与植物细胞的很不相同配制动物细胞培养基的无机盐与植物细胞的很不相同NHNH4 4+对动物细胞是有毒的，但它却是植物细胞必需的氮源；对动物细胞是有毒的，但它却是植物细胞必需的氮源；KClKCl和和NaClNaCl在动物细胞培养基中含量都较高，但它们对植物细胞的生长却似乎并不重要。在动物细胞培养基中含量都较高，但它们对植物细胞的生长却似乎并不重要。动物细胞以高氧化态的动物细胞以高氧化态的FeFe3+3+（硝酸铁）为铁源，而植物细胞以硝酸铁）为铁源，而植物细胞以FeFe2+2+（硫酸亚铁）为铁源。硫酸亚铁）为铁源。第83页/共129页 微量元素微量元素缺乏稀有微量
42、元素的培养基对任何真核细胞的培养都是不合适的。缺乏稀有微量元素的培养基对任何真核细胞的培养都是不合适的。培培养养基基中中微微量量元元素素的的含含量量通通常常都都很很低低，一一般般小小于于1 1 g/Lg/L，水水和和无无机机盐盐中已有足够量，不需要另加。中已有足够量，不需要另加。第84页/共129页维生素维生素动物细胞培养也需要维生素，而且动物细胞对维生素种类的要求动物细胞培养也需要维生素，而且动物细胞对维生素种类的要求通常比植物细胞要多一些。通常比植物细胞要多一些。第85页/共129页维生素维生素动物（动物（mg/L mg/L）植物（植物（mg/L mg/L）尼克酰胺尼克酰胺1 1-4-4-
43、尼克酸尼克酸-0.50.5-1-1吡哆醇吡哆醇-0.50.5-1-1吡哆醛吡哆醛1 1-4-4-硫胺硫胺1 1-4-40.10.1-10-10核黄素核黄素0.10.40.10.4-维生素维生素B B12121.361.36-叶酸叶酸1.61.6-泛酸泛酸1.61.6-氯化胆碱氯化胆碱1.61.6-动植物细胞培养基中常用的维生素 维生素维生素第86页/共129页缓冲系统缓冲系统缓冲系统对维持培养基的缓冲系统对维持培养基的pHpH值是至关重要的。值是至关重要的。动物细胞培养基的动物细胞培养基的pHpH值是通过模拟血浆内天然存在的值是通过模拟血浆内天然存在的COCO2 2/NaHCO/NaHCO3
44、3系统来控制的。系统来控制的。第87页/共129页缓冲系统缓冲系统肺中肺中:空气中空气中O2扩散到血液中，并与血红细胞结合。血浆中扩散到血液中，并与血红细胞结合。血浆中CO2扩散到空气中，被排出体扩散到空气中，被排出体外。外。组织中：组织中：血红细胞释放携带的血红细胞释放携带的O2并扩散到组织细胞中，组织细胞呼吸产生的并扩散到组织细胞中，组织细胞呼吸产生的CO2被排放到血被排放到血浆中。浆中。血浆中血浆中CO2的溶解与释放与形成的溶解与释放与形成H2CO3有关。有关。第88页/共129页NaHCO3作为等渗溶液的一部分加到培养基内。临配制前加入，约作为等渗溶液的一部分加到培养基内。临配制前加入
45、，约2g/L在在密密闭闭式式培培养养瓶瓶内内，一一方方面面，由由于于NaHCO3不不稳稳定定，易易分分解解产产生生CO2，CO2从从培培养养液液中中游游离离出出来来，使使培培养养液液pH值值升升高高；另另一一方方面面，细细胞胞呼呼吸吸产产生生的的CO2，以及细胞代谢产生的酸性代谢产物，又使培养液以及细胞代谢产生的酸性代谢产物，又使培养液pH值降低。值降低。第89页/共129页培养基颜色的变化培养基颜色的变化在培养开始的时候，培养基的在培养开始的时候，培养基的pHpH值可能会明显上升，但随着细胞的生长和细胞数值可能会明显上升，但随着细胞的生长和细胞数目的增多，培养基的目的增多，培养基的pHpH值
46、就会逐渐降低。值就会逐渐降低。酚红作为酚红作为pHpH指示剂：指示剂：培养基的颜色变化是：樱桃红色培养基的颜色变化是：樱桃红色 粉红色粉红色 黄色。黄色。第90页/共129页在使用培养基之前，先通入在使用培养基之前，先通入COCO2 2；或在或在COCO2 2培养箱内，开放式培养的话培养箱内，开放式培养的话培养基的颜色变化则是：培养基的颜色变化则是：樱桃红色樱桃红色 黄色黄色第91页/共129页pH动物细胞对动物细胞对pHpH的稳定性要求较高，。植的稳定性要求较高，。植物细胞则要求不高。物细胞则要求不高。一般通过改变培养基中的磷酸盐或碳酸一般通过改变培养基中的磷酸盐或碳酸盐的比例来达到一定的盐
47、的比例来达到一定的pHpH值。值。第92页/共129页能源和碳源能源和碳源葡萄糖葡萄糖(1(1-4g/L)-4g/L)是动物细胞的主要碳源。是动物细胞的主要碳源。丙酮酸、琥珀酸和肌酸等碳源也常常成为动物细胞的补充能源。丙酮酸、琥珀酸和肌酸等碳源也常常成为动物细胞的补充能源。当不要求培养细胞以最大速度生长时，可以用半乳糖代替葡萄糖。当不要求培养细胞以最大速度生长时，可以用半乳糖代替葡萄糖。第93页/共129页 能源和碳源能源和碳源植物细胞的能源包括蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖和淀粉。植物细胞的能源包括蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖和淀粉。蔗蔗糖糖不不能能直直接接穿穿过过细细胞胞壁壁进进入入
48、细细胞胞内内被被利利用用，但但植植物物的的细细胞胞壁壁内内含含有有蔗蔗糖糖酶酶（invertaseinvertase），它它能能把把蔗蔗糖糖水水解解为为葡葡萄萄糖糖和和果果糖糖，葡葡萄萄糖糖和和果果糖糖再再穿穿膜膜进进入入细胞内被利用。细胞内被利用。第94页/共129页氮氮 源源动物细胞合成蛋白质和核酸的氮源有两种：动物细胞合成蛋白质和核酸的氮源有两种：成成分分明明确确的的氮氮源源 指指动动物物细细胞胞合合成成蛋蛋白白质质和和生生长长所所必必不不可可少少的的一一些些必必需需氨氨基基酸酸和和非非必需氨基酸。必需氨基酸。成成分分不不明明确确的的氮氮源源 指指动动物物细细胞胞培培养养基基中中加加入入
49、的的各各种种动动物物血血清清、组组织织提提取取液液以以及及蛋蛋白白水解产物（如水解乳蛋白）等。水解产物（如水解乳蛋白）等。第95页/共129页血清（血清（serumserum）血清是大多数生长培养基的一个成分。血清是大多数生长培养基的一个成分。最常用的是牛血清，但马最常用的是牛血清，但马、人、兔及其他来源的血清有时也用。人、兔及其他来源的血清有时也用。一般来讲，动物愈年轻，其血清愈有利于细胞生长。所以成年牛血清不如小牛血一般来讲，动物愈年轻，其血清愈有利于细胞生长。所以成年牛血清不如小牛血清清，小牛血清不如胎牛血清（小牛血清不如胎牛血清（fetal bovine serumfetal bovi
50、ne serum）。）。第96页/共129页血清（血清（serum）血清中已知的贴壁和铺展因子有：血清中已知的贴壁和铺展因子有：纤粘蛋白（纤粘蛋白（fibronectin）冷不溶球蛋白（冷不溶球蛋白（cold-insolubleglobulin，CIG）血清铺展因子（血清铺展因子（serumspreadingfactor，SSF）胎球蛋白胎球蛋白第97页/共129页目前尚不充分了解。目前尚不充分了解。血清中含有多种细胞生长和增殖所必不可少的激素、生长因子以及贴壁和铺展因子，血清中含有多种细胞生长和增殖所必不可少的激素、生长因子以及贴壁和铺展因子，其作用：其作用：血清和蛋白水解产物为培养细胞提供