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1、标记免疫学分析技术发展历程免疫荧光分析(Coons,1941)(Coons,1941)放射免疫分析(Berson(Berson和Yalow,1960)Yalow,1960)酶免ELISA(Engvall,1971)ELISA(Engvall,1971)金标免疫分析(Faulk(Faulk和Taylor,1971)Taylor,1971)化学发光免疫分析(Arakawa(Arakawa，1977)1977)时间分辨荧光免疫分析(Soini(Soini和HemmilaHemmila，1979)1979)电化学发光免疫分析(Leland,1990)(Leland,1990)液相芯片(美国Lumine
2、xLuminex公司,1997),1997)第1页/共26页免疫荧光放射免疫化 学 发光电化学发光 时间分辨荧光酶联免疫第2页/共26页标记免疫技术的理论检测灵敏度放射免疫放射免疫 1010-10-10-10-10-12-12 molmol酶联免疫酶联免疫 1010-9-9-10-10-10-10 mol mol化学发光化学发光 1010-15-15 molmol时间分辨荧光时间分辨荧光 1010-18-18 molmol电化学发光电化学发光 1010-18-18 molmol第3页/共26页一、时间分辨荧光免疫分析（TRFIATRFIA）（Time-resolved fluorescence
3、 Time-resolved fluorescence immunoassayimmunoassay）背景介绍基本原理技术特点反应模式第4页/共26页背景介绍l19791979年，芬兰WallacWallac公司研发部的SoiniSoini 和 Hemmila Hemmila首次提出了建立 稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫分析”理论l19831983年，Soini Soini 和 KojolaKojola首先开发出以镧系元素为示踪物的时间分辨 荧光测量仪，建立了新的非放射性微量分析检测技术。同一年，Pettersson Pettersson等人运用此仪器首次对人绒膜促性腺激素(hCG)(hC
4、G)进行了时间 分辨荧光免疫分析l19841984年，HemmilaHemmila确定了DELFIA(Dissociation Enhanced DELFIA(Dissociation Enhanced LanthanideLanthanide Fluoroimmunoassay)Fluoroimmunoassay)这种时间分辨免疫分析技术方案,从而使DELFIADELFIA成 为WallacWallac的专利技术l19881988年，加拿大CyberFluorCyberFluor公司的DiamandisDiamandis创立了一种不同于DELFIADELFIA 的时间分辨荧光免疫分析，即FI
5、AgenFIAgenl20032003年，时间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖第5页/共26页基本原理l三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽(Tb)，镝(Dy)等，它们的荧光光谱具有特异性强 Stokes位移大寿命长 的特点lDELFIA采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的-NH2 连接。在中性或接近中性pH 条件下，DTTA 与Eu3+具 有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu 又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放出来并与增强液中的 配体螯合进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千
6、万倍地 放大lFIAgen采用的是以Eu3+螯合物配基BCPDA为标记物，通过检测其与过量Eu3+形成的螯合物荧光进行定量。由于 BCPDA 的可检测性不够理想，FIAgen 需要利用生物素-亲合素信号放大来弥补BCPDA 检测灵敏度的不足第6页/共26页DELFIADELFIA标记技术标记技术碱性碱性第7页/共26页时间:(s）04008001000340nm激发光第二个循环荧光短短寿寿命命荧荧光光613nm613nm长寿命荧光长寿命荧光延迟时间延迟时间测值时间测值时间通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，使理论本底达到分辨开来，使理论本底
7、达到0 0第8页/共26页300300400400500500600600荧荧光光强强度度激发光激发光发射光发射光波长波长(nm)(nm)第9页/共26页TbDyEuSm500发射光强度2004000延迟时间(s)600发射光波长(nm)500发射光强度0延迟时间(s)第10页/共26页TRFIA技术特点l极长的荧光衰退时间 铕：730000ns730000ns lStokesStokes位移大 铕：激发光340340nmnm，发射光613nm613nml狭窄的发射峰l解离-增强技术可使其荧光性提高100100万倍第11页/共26页固相包被抗体铕标记抗体孵育Eu待测抗原+EuEu+增强液+Eu
8、双抗体夹心法示意图第12页/共26页双抗原夹心法示意图Eu+孵育+Eu孵育增强液+Eu固相包被抗原待测抗体铕标记抗原第13页/共26页中和法示意图(回滴定法)+孵育+Eu孵育EuEu增强液+Eu待测抗体铕标记抗体中和抗原第14页/共26页小分子抗原竞争抑制示意图固相包被二抗+孵育+Eu孵育Eu待测抗原铕标抗原Eu增强液+Eu一抗第15页/共26页时间分辨技术重点和难点固定相（9696孔板）标准品铕标记物第16页/共26页二、时间分辨荧光免疫分析二、时间分辨荧光免疫分析（TRFIATRFIA）测试仪测试仪第17页/共26页目前的目前的TRFIATRFIA测试仪：测试仪：国外仪器（Wallac公司
9、）国内其他公司生产的仪器(上海新波、广州丰华等)达瑞抗体公司自主研发的仪器及软件（DR-M6601）第18页/共26页Wallac AutoDELFIA 1235第19页/共26页半自动半自动 VICTOR2 1420第20页/共26页半自动半自动 ANYTEST2000第21页/共26页DR-M6601DR-M6601时间分辨荧光免疫分析仪时间分辨荧光免疫分析仪【粤食药管械（准）字2005第2400226】第22页/共26页达瑞公司开发的系列TRFTRF试剂内分泌科检查内分泌科检查内分泌科检查内分泌科检查甲状腺系列：甲状腺系列：甲状腺系列：甲状腺系列：T3T3、T4T4、FT3FT3、FT4
10、FT4、TSHTSH、TBGTBG、TGTG、TGAbTGAb、TPoAb TPoAb 糖尿病系列：糖尿病系列：糖尿病系列：糖尿病系列：insulininsulin、C-PeptideC-Peptide 生长激素：生长激素：生长激素：生长激素：hGHhGH 其他：其他：其他：其他：Cortisol Cortisol 肿瘤科检查肿瘤科检查肿瘤科检查肿瘤科检查 AFPAFP、CEACEA、tPSA tPSA、2-MG2-MG 、hTGhTG、CA-242CA-242、CA-724 CA-724、CA-50CA-50 、fPSA fPSA、NSE NSE、cyfra 211 cyfra 211、CA
11、-199CA-199、CA-125CA-125、CA153CA153传染病检查传染病检查传染病检查传染病检查 乙肝系列：乙肝系列：乙肝系列：乙肝系列：HBsAgHBsAg、HBsAbHBsAb、HBeAgHBeAg、HBeAbHBeAb、HBcAb HBcAb 其他：其他：其他：其他：HCVHCV、HIV HIV 妇产科检查妇产科检查妇产科检查妇产科检查 FSHFSH、LHLH、hCGhCG、ProlactinProlactin、ProgesteroneProgesterone、SHBG SHBG、-hCG hCG、PAPP-APAPP-A、TestosteroneTestosterone 、
12、uE3uE3、E2E2血液科检查血液科检查血液科检查血液科检查 贫血检查：（贫血检查：（贫血检查：（贫血检查：（FerritinFerritin、VitB12VitB12、叶酸）、叶酸）、叶酸）、叶酸）遗传科检查遗传科检查遗传科检查遗传科检查产前筛查：产前筛查：产前筛查：产前筛查：hAFP/Free-hCG hAFP/Free-hCG 新生儿筛查：新生儿筛查：新生儿筛查：新生儿筛查：Neo.hTSHNeo.hTSH、Neo.T4Neo.T4、Neo.17-OH-Prog Neo.17-OH-Prog 第23页/共26页标准品铕标记物第24页/共26页Thanks第25页/共26页感谢您的观看！第26页/共26页