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1、实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质 一、实验目的 1 掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。2 了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。二、实验原理 马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶普遍存在于植物、真菌、昆虫
2、的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO 催化酚与 O2 氧化形成醌，使组织形成褐变以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH 条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在 410nm 处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计 410nm 处使反应体系的 OD 值产生变化，通过 OD 值的变化确定 PPO 的酶活大小。多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）12O2邻醌H2O 三、试验材料、试剂及试验用品 1材料：马
3、铃薯块茎。2仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶 3试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L 邻苯二酚；L 磷酸氢二钠；L 磷酸二氢钠；10mmol/L 柠檬酸；10mmol/L 抗坏血酸；10mmol/L 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L 亚硫酸钠 四、实验方法：1.多酚氧化酶的提取 取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用 7mL 磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。2.多酚氧化酶活性测定 采用比色法测定。将l 邻苯二酚加入 2l 磷酸
4、缓冲液（）中，加入l 酶提取液，立即于波长 410nm 下测定吸光值，2min 后再计吸光值，以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为：ml 缓冲液和 mL 邻苯二酚溶液)。以每分钟吸光度变化为 1 个多酚氧化酶活性单位。表 1 多酚氧化酶活性测定 磷酸缓冲液（mL）邻苯二酚（mL）粗酶液（mL）OD410 2min 后OD410 OD410 酶活力（U）空白组 0 试验组 3.多酚氧化酶酶活的计算公式：以每克样每分钟内 A410 增加为 1 个酶活力单位 U。A410酶提取液总量（ml）酶活力（g min）反应时间(min)样品鲜重(g)测定时酶液用量(ml)4 酶学特性 PH 对多酚氧化酶
5、活性的影响 室温下在试管中加入已配好的不同 pH 值的缓冲溶液，邻苯二酚，多酚氧化酶粗酶液 mL，混匀后迅速测定吸光度，转换为多酚氧化酶的活性。以缓冲液 pH 值为横坐标，多酚氧化酶活性为纵坐标，作出酶活pH 曲线，以确定最适 pH 值。表 2 pH 对多酚氧化酶活性的影响 组号 不同 pH 的磷酸缓冲液（mL）邻苯二酚（mL）粗酶液（mL）OD410 2min 后OD410 OD410 酶活力（U）1 pH=4，2 pH=5，3 pH=6，4 pH=7，5 pH=8，温度对多酚氧化酶活性的影响 试管中加入 pH 的磷酸盐缓冲溶液,以邻苯二酚溶液为底物,在不同温度（常温、40、60的温度条件)
6、下保温 5min 后，加入多酚氧化酶粗酶液，混匀后在室温下测定多酚氧化酶的活性。以温度为横坐标，多酚氧化酶活性为纵坐标，作出酶活温度曲线，以确定最适温度。表 3 温度对多酚氧化酶活性的影响 温度 磷酸缓冲液（mL）邻 苯 二酚（mL）粗酶液（mL）OD410 2min 后OD410 OD410 酶活力（U）室温 40 60 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响 将抑制剂抗坏血酸（VC）、柠檬酸、亚硫酸钠、EDTA 分别用的磷酸盐缓冲溶液配制成10mmol/L 的溶液，在室温下分别取上述抑制剂，以邻苯二酚溶液为底物，加入多酚氧化酶粗酶液，混匀后在室温下测定多酚氧化酶的活性。以抑制类型为横坐标，多酚氧化酶
7、活性为纵坐标，绘制抑制剂对酶活影响的图形，分析抑制剂对酶活性影响。表 4 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响 抑制剂 磷酸缓冲液（mL）邻 苯 二酚（mL）粗酶液（mL）OD410 2min 后OD410 OD410 酶活力（U）抗坏血酸 柠檬酸 亚硫酸钠 EDTA 五、注意事项 1、反应混合液必须现配现用，否则会因邻苯二酚自动氧化而失效；2、在试验中加入一种酚结合剂-聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），它能与酚类化合物强烈地发生缔合作用，从而消去酶反应体系中的底物，使 PPO 活性的测定更接近其真值。3、使用分光光度计时要求动作快速、熟练。4、加样时，先加缓冲溶液，再加底物邻苯二酚，摇匀，在测量之前最后加酶提取液。六、思考题 1.本试验中使用到磷酸缓冲液，请问磷酸缓冲液在本试验中的作用 2.试分析不同温度、pH 对马铃薯多酚氧化酶的影响 3.谈谈你对多酚氧化酶活性性质的认识。参考文献：曹建康，姜微波，赵玉梅编着.果蔬采后生理生化实验指导.中国轻工业出版社,.毛丽梅，邓红，马安德，卢晓翠。食品安全综合实习指导.科学出版社,.104-105 李彩霞 张芬琴 张喜峰 赵金梅 白生文