非洲猪瘟实验室诊断课件.pptx

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1、非洲猪瘟实验室诊断African Swine Fever,ASF1定义非洲猪瘟是家猪、疣猪、欧洲野猪和美洲野猪的一种非洲猪瘟是家猪、疣猪、欧洲野猪和美洲野猪的一种传传 染性极染性极强强的出血性疾病。所有年的出血性疾病。所有年龄龄的猪都易感。的猪都易感。世界世界动动物物卫卫生生组织组织2可表现为最急性、急性、亚急性和慢性四 种形式严重程度与毒株、猪种及流行时间的长短 有关急性型以高热、食欲废绝、皮肤发绀、网 状内皮系统出血为特征，发病后2-10天内 死亡，病死率可高达100%临床上，与古典猪瘟非常相似，难以区分目前没有疫苗！目前没有疫苗！2017/5/153只感染猪家猪和欧亚野猪非常易感 感染后

2、存活的猪可能变为无症状的携带者非洲的野生宿主能持续感染很长时间并且 没有临床症状软蜱是自然界中的贮主并且可以作为传播 媒介法典中将非洲猪瘟的潜伏期定为15天。2017/5/154重要性重要性OIE动物卫生法典要求必须报告的动物疫病我国动物疫病名录一类动物疫病我国中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）明确重点防范的外来动物疫病5病原病原 非洲猪瘟病毒科中唯一成员 Asfarviridae Asfivirus ASFV兼具虹彩病毒和痘病毒的某些特性 唯一核酸为D N A 的虫媒病毒 只有一个血清型6特点之一：基因组大170190kb蓝耳病病毒15kb 12 倍猪瘟病毒12kb 15 倍Ge

3、nome CSFV口蹄疫病毒8kb 24 倍Genome FMDV病原病原7病原病原特点之二：基因多变基因组两端各有一个高变区，基因型多达22个8特点之三：抵抗力强温度：6020分钟；5670分钟25-37 数周4 1年冻冻肉肉数年到数十数年到数十年年pH：411.5 无血清413.4 有血有血清清未熟未熟肉品、肉品、腌腌肉、肉、泔泔水中水中可可长时长时间间存活存活病原病原乙醚、氯仿等脂溶剂可破坏囊膜使其失活9临床症状最急性型急性型亚急性型慢性型2017/5/1510临床诊断最急性型无临床症状，突然死亡急性型（强毒株）发烧（41-42C）食欲减退不愿活动局部皮肤变红或变蓝色腹泻呕吐呼吸困难流产

4、死亡率高（10-100%）仔猪发生ASF，耳、鼻、唇、腿发红，神经症状，数小时内死亡。Mityana,Uganda,201011临床诊断亚急性型（中等毒力毒株）症状同急性型，但较轻死亡率低持续时间长（3周）慢性型（低毒力毒株）消瘦或发育迟缓，体弱偶见体温升高，波状热呼吸困难，湿咳怀孕母猪流产多处皮肤局部红斑、溃疡耳部、腹部、大腿内侧可能凸起或坏死易继发感染，如继发引起肺炎和关节炎感染后能康复，但终身带毒死亡率低，可见血清转阳12临床诊断各种毒力的毒株均可导致流产胎儿可能全身水肿胎盘、皮肤、心肌或肝脏可能有淤血点13诊断病理诊断脾脏肿大 易碎暗红色至黑色14胃、肝、肾各部位淋巴结肿 大、出血；1

5、5水肿肺、肝、膀胱胆囊充盈结肠系膜16肾皮质出血点、出血斑出血瘀点瘀斑17慢性型纤维素性心包炎，并可见出血点肺局部肉变，实变肺部局部肉芽肿，形成结节18图图1：ASF猪尸体底部的猪尸体底部的发绀发绀病病变变。图图2：耳尖的耳尖的发绀发绀病病变变。图图3：血性腹泻血性腹泻（血痢）。（血痢）。图图4：急性急性ASF死猪肺小叶死猪肺小叶间间的水的水肿肿。19图图5：胃的基底膜淤血（急性：胃的基底膜淤血（急性）图图6：典型：典型肿肿大脆化脾。大脆化脾。（黑（黑浆浆果脾，急性果脾，急性ASF）图图7：病猪脾（上）与正常脾大小的比病猪脾（上）与正常脾大小的比较较。（急性。（急性ASF）图图8：急性急性AS

6、F猪猪肿肿大的褐色脾。（巴西品大的褐色脾。（巴西品种）种）20图图9：肾肾淤斑及出血点（急性）淤斑及出血点（急性）图图10：肾肾盂及盂及肾肾乳乳头头部的出部的出血斑（急性）血斑（急性）图图11：肾肾盂盂处处散在的出血点（急性散在的出血点（急性ASF）图图12：肿肿大、出血的肝胃淋巴大、出血的肝胃淋巴结结，可出，可出见见有血凝有血凝块块。（急性）。（急性）21图13：肝胃淋巴结切面，肿大并呈暗红色。（急性ASF）图14：心包积液及心包肌层有散在的出血点。（急性ASF）图图15：胆囊水胆囊水肿肿（急性（急性ASF）图图16：肺部可肺部可见见肉芽肉芽肿肿病病变变，形成一形成一结节结节（慢性（慢性AS

7、F）22图图17：肺肺实变实变区（慢性区（慢性ASF）图图18：心包心包脏层脏层附有附有纤维纤维素，素，而且可而且可见见出血点（慢性出血点（慢性ASF）23鉴别诊鉴别诊断断高致病性蓝耳病猪皮炎肾炎综合征（PDNS）由PCV-2引起细菌性败血症香豆素中毒真菌毒素中毒。2017/5/1524VirusAb感染表现出临床症状携带者病毒血症病毒血症:感染后2-3天到8天，持续很长时间（数月）特异性抗体特异性抗体:从感染后的7-11天至数月，甚至数年排毒排毒:从 感染早期（第2天）以后持续很长时间。甚至康复后。ASF感染的主要特感染的主要特征征猪猪(野猪和家猪野猪和家猪)软软蜱蜱25实验室诊断实验室诊断

8、病原学血清学病毒分离 血细胞吸附试验直接免疫荧光法（FAT）普通PCR和荧光定量PCR双抗体夹心ELISA测 定ASFV抗原间接ELISA测定ASF 特异性抗体阻断ELISA检测ASF 特异性抗体唯一确唯一确诊单诊单位：国家外来位：国家外来动动物疫病研究中心物疫病研究中心免疫印迹间接免疫荧光测抗体26实验室诊断血清血清样样品品析出的血清不合格血液样品分离好的血清单独 包装，并一一编号合格血液样品27实验室诊断病原学病原学样样品品抗凝血淋巴结脾脏肾脏骨髓28实验实验室室诊诊断的安全原断的安全原则则保障人员的安全穿戴：眼罩、手套、实验服、口罩和鞋套等行为：洗手、禁止聊天，实验室内禁止食用食 物和饮

9、料等了解化学试剂的特性和潜在的危险保障样品的安全防止样品交叉污染一次性手套2017/5/1529良好的工作区域良好的工作区域第一步实验前清洁试验区域（台面、移液器等）注意消毒剂的期限第二步 划分不同的区域样品处理（BSL-3提取病毒DNA）PCR检测（Mix配制、加DNA、扩增等）ELISA检测区域（加血清、洗涤、终止等）2017/5/1530GLP(good laboratory practice)原原则则制定一整套标准以确保质量、可靠性和完整性，可核查结论和可追溯性数据的报告。要点要点资源：组织、人员、设施和设备特征：检测项目和测试系统规则：试验步骤、标准操作程序（SOP）结果：原始数据、

10、最后报告和档案质量保证：独立监测的研究过程2017/5/1531实验实验室室诊诊断技断技术储备术储备278bp257bp英国Pirbright 实验室比对实验建立了猪瘟、非洲猪瘟的荧光定量P C R 鉴别诊断方法双抗体夹心ELISA检测抗原阻断ELISA检测抗体间接ELISA检测抗体32间接ELISA检测病毒抗原商品化试剂盒 INGEZIM K3(Ingenasa,Spain)价格比PCR便宜不需要复杂的操作适用于基层实验室敏感性低（慢性或亚急性）2017/5/1533分子生物学检测方法O2 0u1 7r/a5,/1C5 .A.,L.Edwards,and C.A.Batten.2013.Vi

11、rological diagnosis of African swine fever-comparative study of available tests.Virus research 173:150-158.34荧荧光光PCR检测检测病毒病毒DNA35荧荧光光PCR工作工作单单样品的可追溯性！2017/5/1536荧荧光光PCR检测检测病毒病毒DNA-试试剂剂准准备备病毒DNA提取试剂盒非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒37荧荧光光PCR检测检测病毒病毒DNA-试试剂剂制制备备冻冻干蛋白干蛋白酶酶K:将蛋白酶K溶解在4.5 ml灭菌后的 蒸馏水中，将溶液以500 l分装，在-10C温度下

12、储存，直到使用。除抑制物除抑制物缓缓冲冲液液:将20 ml无水乙醇加入原始小瓶 中混匀并进行相应的标记和日期记录。室温储存。冲洗冲洗缓缓冲冲液液:将80 ml无水乙醇加入原瓶中混匀并 进行相应的标记和日期记录。室温储存。38荧荧光光PCR检测检测病毒病毒DNA-仪仪器器设备设备水浴锅或金属浴匀浆仪和匀浆管（陶珠）台式离心机荧光PCR仪移液器39荧荧光光PCR检测检测病毒病毒DNA-样样本本处处理理组织样本取100 mg组织剪碎，加入1ml PBS研磨或匀浆，然后1050g或2000 rpm离心10分钟取上清全血（抗凝血）或血清直接吸取200 l40提取病毒提取病毒DNA将200 l结合缓冲液（

13、绿盖）和40 l蛋白酶K（20mg/mL）加入到1.5 ml离心管中。加入200 l样本。每个提取程序都加入E+和 E-(200 l水)对照。立即混匀并在722C 温度下孵育10分钟。将1.5 ml微离心管简单离心操作，除去管盖内部的 水珠。将100 l异丙异丙醇醇加入加入样样本本试试管管，混混匀匀。将过滤管放入收集管中，并将样本移入过滤管。41提取病毒提取病毒DNA（2）将过滤管以8000 g离心1分钟。如果样本依然留在过滤管中，重复离心操作。扔掉收集管，将过滤管加入干净的收集管中。将500 l除抑制物缓冲液（黑盖）放入过滤管，以8000 g离心1分钟。扔掉收集管，将过滤管放入干净的收集管中

14、。将500 l冲洗缓冲液（蓝盖）加入过滤管，以8000 g进行1分 钟离心操作。扔掉收集管，重复冲洗步骤（500 l冲洗缓冲液加入过滤管，以8000 g进行1分钟离心操作）。扔掉收集管，将过滤管放入干净的收集管中。以13,000 g进 行10s离心操作以去除残余的冲洗缓冲液。扔掉收集管，将过滤管放入干净的1.5 ml微离心管中。42提取病毒提取病毒DNA（3）将50 l100 l预热的消毒蒸馏水加入过滤管（注意不要使用试剂盒中Elution buffer），以8000 g 进行1分钟离心操作。将DNA溶液在-10C温度下储存（有效期：12个 月），备用；如果DNA溶液在1-2小时内用于PCR

15、操作，在43C温度下短暂储存，然后冻存。43荧荧光光PCR检测检测病毒病毒DNAOIE方法方法配配制反制反应应体体系：系：反应液溶解后，每个反应管中加入18 l反应液，然后再加入2 l模板；每次试验需设立反应阳性对照（R+，绿管中的反 应阳性对照）和反应阴性对照（R-，灭菌水）4445荧荧光光PCR检测检测程序程序设设置置46荧荧光光PCR检测检测病毒病毒DNA-实实验结验结果果47荧荧光光PCR检测检测病毒病毒DNA-结结果判定果判定有效性有效性：提取阳性对照（E+）和反应阳性对照R+的Ct值应小于35，且提取阴性对照（E-）和反应阴性对 照（R-）无Ct值，则试验有效。阳性和阴性阳性和阴性

16、：当样品的扩增结果有典型的扩增曲线且Ct值小于37时可判定为阳性。当样品的扩增结果在背 景信号之下或Ct值37时，判定为阴性结果。可可疑疑样样品品：当样品的Ct值大于35小于37并且扩增曲线 呈指数时被判定为可疑，当扩增曲线呈线性时判为阴 性。可疑样品应当重新提取病毒核酸检测，如仍为可 疑，可判为阳性。48实时荧实时荧光光RPA重组酶聚合酶扩增技术等温扩增（3742C）用时短：20分钟灵敏度高操作简单，便携式仪器2017/5/1549实时荧实时荧光光RPA检测检测ASFV特异性强与其他病毒无交叉反应敏感性高能检测出不同基因型的毒株2017/5/1550实时荧实时荧光光RPA检测检测ASFV20

17、17/5/15与荧光PCR具有较高的相关性概率回归分析：最低可检测出17个拷贝51ASFV的基因型的基因型22个基因型非洲22个型：西非I型为主，东非基因型复 杂欧洲-I型意大利撒丁岛，II型东欧和俄罗斯2017/5/15522017/5/1553血清学血清学检测检测方法方法没有疫苗！抗体=感染没有中和抗体。感染早期既可以检测出抗体（7-12dpi）抗体持续很长时间2017/5/1554血清学血清学检测检测方法方法筛选（Screening by ELISA tests）1.OIE-ELISA 间接ELISA基于半纯化病毒抗原2.商业化ELISA试剂盒INGEZIM PPA COMPAC K3(

18、INGENASA)使用VP73特异性单抗的阻断ELISASVANOVIR 间接ELISA（重组抗原p30蛋白）ID Screen 间接ELISA（包被p32、p62和p72蛋白）2017/5/1555确诊免疫印迹(Immunoblotting)：半纯化病毒抗原间接免疫荧光（IFI）：E70毒株感染的传代细胞免疫过氧化物酶试验（IPT）：病毒感染的细胞对操作人员的要求较高血清学血清学检测检测方法方法56免疫印迹（免疫印迹（IB）方法）方法2017/5/1557间间接免疫接免疫荧荧光（光（IIF）病毒感染细胞后加入待检测血清，再加入标 记荧光素的蛋白A。2017/5/1558免疫免疫过过氧化物氧化

19、物酶酶（IPT）59非洲猪瘟非洲猪瘟间间接接ELISA抗体抗体检测试剂检测试剂盒盒国家外来动物疫病研究中心研发使用p30蛋白的优点适用于早期感染敏感性和特异性较高Cubillos C,Gomez-Sebastian S,Moreno N,et al.2013.African swine fever virus serodiagnosis:a general review with a focus on the analyses of African serum samples.Virus Res 173:159-167.60编编号号名称名称装量装量用法用法1预包被酶标板5块直接使用2酶标抗体（

20、100）300L/管1瓶用稀释液做100倍稀释3阳性血清25L/管1管用稀释液做40倍稀释4阴性血清25L/管1管用稀释液做40倍稀释5稀释液55mL/瓶1瓶直接使用6洗涤液（20）100mL/瓶1瓶用双蒸水做20倍稀释，按0.5比例加入吐温-207吐温-201.5mL/管1管直接使用8底物溶液30mL/瓶1瓶直接使用9终止液30mL/瓶1瓶直接使用组组分与用法分与用法非洲猪瘟非洲猪瘟间间接接ELISA抗体抗体检测试剂检测试剂盒盒61原理原理ASFV重组p30蛋白作为抗原包被奇数条作为检测孔，使用 抗原稀释液包被偶数条作为对照孔，样品同时加入到检测 孔与对照孔中，所测OD值之差用于结果判定。非

21、洲猪瘟非洲猪瘟间间接接ELISA抗体抗体检测试剂检测试剂盒盒123456789101112AS5S5BS6S6CS7S7DS8S8ES1S1S9S9FS2S2S10S10GS3S3S11S11HS4S4S12S12注：注：P表示阳性血清对照孔；N表示阴性血清对照孔；S1、S2、S3、S4等表 示待检血清孔。62检测检测步步骤骤1.待检血清与阴阳对照血清使用样品稀释液做40倍稀释。2.在A1、A2和B1、B2孔中加入稀释后的阳性阳性血血清清，50L/孔。在C1、C2和D1、D2孔中加入稀释后的 阴性阴性血血清清，50L/孔。在E1、E2加入稀释后的待待检检血血清清，50L/孔。3.37孵育60m

22、in。4.弃去反应孔中的液体。每孔用洗涤液清洗4次，洗涤液（1）300L/孔。每次除去洗涤液后，在吸水 纸上拍打，除去残留的液体。5.每孔加入酶酶标标抗抗体体（1），50L/孔。6.37孵育30min。7.重复步骤4。8.每孔加入底底物溶物溶液液，50L/孔。9.室温避光作用10min。10.每孔中加入50L终终止止液液，终止所有的反应。11.用酶标仪在450nm的波长下测定各孔OD450nm值，计算OD差。OD差差=OD奇数孔奇数孔-OD偶数孔偶数孔结结果判定果判定阳性对照OD差0.5，阴性对照OD差0.2，试验结果有效；否则，应重新进行试验。待检样品OD差0.5，判为阳性。待检样品OD差0

23、.5，判为阴性。非洲猪瘟非洲猪瘟间间接接ELISA抗体抗体检测试剂检测试剂盒盒63血清学血清学诊诊断小断小结结商品化和OIE-ELISA对较高质量的血清样品 检测均有较为满意的效果。检测溶血样品时特异性和敏感性降低阳性ELISA结果应该使用其他方法IPT、IIF 和IB验证。确定感染时间时，IPT和IIF是非常有用的工 具，是推荐的方法。2017/5/1564实验实验室室诊诊断断正确的非洲猪瘟诊断必须平行使用多种方法！血清学诊断方法（ELISA+IB+IIF或IPT）病毒学诊断方法确定是否含病毒核酸（PCR+病毒分离）2017/5/1565外来病中心先后派出十余人次赴英国、美国、西班牙和非外来

24、病中心先后派出十余人次赴英国、美国、西班牙和非 洲学洲学习习交流非洲猪瘟交流非洲猪瘟诊诊断与防控技断与防控技术术成功研制猪瘟与非洲猪瘟的快速成功研制猪瘟与非洲猪瘟的快速鉴别诊鉴别诊断方法断方法开展了大量病原学和血清学开展了大量病原学和血清学监测监测66实验实验室室检测检测278bp257bp英国Pirbright 实验室比对实验建建立了立了猪猪瘟瘟、非非洲洲猪瘟猪瘟的的荧荧光光定定量量PCR鉴鉴别别诊诊断方断方法法骨髓培养物中淋巴结病毒分离血细胞吸附试验直接免疫荧光法测定抗原PCR和荧光定量PCR双抗体夹心ELISA测定抗原病病 原原 学学 检检 测测67间间接接ELISA测测定定ASF特异抗

25、特异抗体体血清学血清学检测检测阻断阻断ELISA检测检测ASF特异抗特异抗体体 间间接免疫接免疫荧荧光光测测定特异定特异抗体抗体储储备备了国了国际际标标准阻准阻断断ELISA抗抗体体检测检测试试剂剂盒和盒和竞竞争争ELISA抗抗原原检测试检测试剂剂盒。盒。ELISA抗体抗体检检测测试剂试剂盒盒研究研究与与储储备备68建立的方法在英国OIE参考实验室得到确认。69参考参考资资料料国际动物卫生法典-非洲猪瘟陆生动物诊断试验和疫苗手册-非洲猪瘟FAO 非洲猪瘟应急计划AUSVETPLAN Disease strategy ASF V4.0非洲猪瘟70谢谢大家！Thank you very much！71