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1、一、原生质体分离一、原生质体分离二、原生质体分离及纯化操作二、原生质体分离及纯化操作三、原生质体培养三、原生质体培养四、体细胞杂交（原生质体融合）四、体细胞杂交（原生质体融合）五、原生质体的遗传饰变五、原生质体的遗传饰变第三节、植物原生质体技术及应用第三节、植物原生质体技术及应用体体细胞胞杂交研究交研究历程及一般概念程及一般概念体体细胞胞杂交的一般流程交的一般流程杂交交细胞的胞的鉴定定 123 细胞胞杂交的交的应用用4（一）体细胞杂交的含义及研究历程（一）体细胞杂交的含义及研究历程概念：概念：不同亲本（种间或属间等）的原生质体，在人不同亲本（种间或属间等）的原生质体，在人工诱导下，相互接触，从
2、而发生膜融合、胞质融合、工诱导下，相互接触，从而发生膜融合、胞质融合、核融合并形成杂种细胞，经过培养进一步发育成杂种核融合并形成杂种细胞，经过培养进一步发育成杂种植株。这一过程称为原生质体融合或细胞杂交。植株。这一过程称为原生质体融合或细胞杂交。使植物无性杂交成为可能使植物无性杂交成为可能使有性杂交根本无法获得的种间、属间、科间远使有性杂交根本无法获得的种间、属间、科间远缘杂种成为现实缘杂种成为现实打破了物种间的界限打破了物种间的界限原生质体融合的意义原生质体融合的意义植物体细胞杂交的几个重要进展植物体细胞杂交的几个重要进展1960年年 Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成用酶法
3、制备高等植物原生质体首次获得成功；功；1971年年 Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株；整植株；1972年年 Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个植物体细胞杂种；这是第一个植物体细胞杂种；1974年年 Kao将聚乙二醇（将聚乙二醇（PEG）诱导融合法应用于植物细）诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术；胞融合并建立了相应的融合技术；1978年年 Melchers获得第一个属间体细胞杂种（番茄马铃获得第一个属间体细胞杂种（番茄马铃薯）；薯）；1981年年 Zim
4、merman发明了电融合仪，并首次提出了电融合发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念；概念；1987年年 Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。建立了单对原生质体电融合技术程序。（二）（二）植物细胞融合的程序：植物细胞融合的程序：原生质体分离的分离、纯化原生质体分离的分离、纯化 融合方法选择融合方法选择 杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选 愈伤组织形成、分化植株再生愈伤组织形成、分化植株再生 杂种植物的鉴定杂种植物的鉴定原生质体融合的方法原生质体融合的方法聚乙二醇聚乙二醇 PEG）化学方法化学方法电脉冲电脉冲物理方法物理方法生物方法生物方法仙台病毒仙台病毒(Sendai virus)N
5、aNO3处理处理高高pH-高浓度高浓度Ga2+飞秒激光诱导融合飞秒激光诱导融合电融合电融合空间细胞融合空间细胞融合（1）电电融合法：融合法：指利用改指利用改变电场诱导变电场诱导原生原生质质体彼此相体彼此相连连成串，再施以瞬成串，再施以瞬间间强强脉冲脉冲电压电压促使促使质质膜膜发发生可逆生可逆性性电击电击穿，达到原生穿，达到原生质质体融合的方法。体融合的方法。电融合特点：电融合特点：效率高效率高 对原生质体伤害性小对原生质体伤害性小 对融合细胞数易于控制对融合细胞数易于控制方法：方法：微电极法和双向电泳法微电极法和双向电泳法双向电泳法：双向电泳法：通过电泳，通过电泳，通过电泳，通过电泳，两细胞膜
6、紧密接触，且膜两细胞膜紧密接触，且膜两细胞膜紧密接触，且膜两细胞膜紧密接触，且膜表面的蛋白质分子分离，表面的蛋白质分子分离，表面的蛋白质分子分离，表面的蛋白质分子分离，产生了无蛋白的类脂区。产生了无蛋白的类脂区。产生了无蛋白的类脂区。产生了无蛋白的类脂区。电融合仪电融合仪Fusion phases of oat（燕麦）（燕麦）protoplasts(Avena sativa)微电极法：微电极法：指利用改变电场诱导原生质体彼此相连指利用改变电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，达到原生质体融合的方法。电击穿，达到原
7、生质体融合的方法。实际操作：先把待融合的细胞或原生质体混合，取样置实际操作：先把待融合的细胞或原生质体混合，取样置于于100V/cm100V/cm的高频交流电场中，在非均匀交流电场中形的高频交流电场中，在非均匀交流电场中形成项链状排列；成项链状排列；完整烟草原生质体完整烟草原生质体完整烟草原生质体完整烟草原生质体（4040）原生质体成串原生质体成串原生质体成串原生质体成串（4040）微电极法：微电极法：再用再用15V/cm15V/cm直流电脉冲直流电脉冲/微秒冲击细胞或原生质体的微秒冲击细胞或原生质体的粘接点，细胞膜降解造成若干微孔，于是在膜之间形粘接点，细胞膜降解造成若干微孔，于是在膜之间形
8、成通道，使细胞质得以交换；最后导致新的球状细胞成通道，使细胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的形成。的形成。1、原生质体在诱融剂或正弦电场作用下凝集，彼、原生质体在诱融剂或正弦电场作用下凝集，彼此靠近；此靠近；2、两个相邻原生质体之间的质膜相互融合，随后、两个相邻原生质体之间的质膜相互融合，随后两个亲本原生质体质膜上的受体、糖蛋白、糖两个亲本原生质体质膜上的受体、糖蛋白、糖脂等成分也在融合后的质膜上重新分布；脂等成分也在融合后的质膜上重新分布；3、细胞质发生融合；、细胞质发生融合；4、细胞核发生融合，形成单核融合细胞。、细胞核发生融合，形成单核融合细胞。融合过程：融合过程：（2）聚二乙醇）聚二
9、乙醇 诱导融合法诱导融合法 PEGPEG融合的机理：融合的机理：PEGPEG分子具有轻微的负极性，与具有正极性基团的水、分子具有轻微的负极性，与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键。蛋白质和碳水化合物等形成氢键。当当PEGPEG分子链足够长时，它在相邻原生质体表面之间有分子链足够长时，它在相邻原生质体表面之间有分子桥、改变膜表面物理化学性质和增加类脂膜流动性分子桥、改变膜表面物理化学性质和增加类脂膜流动性作用，引发原生质体的粘连。作用，引发原生质体的粘连。当当PEGPEG分子被洗脱后，膜上的电荷便重新分布，从而导分子被洗脱后，膜上的电荷便重新分布，从而导致原生质体融合。致原生质体融
10、合。PEGPEG的选用：的选用：一般选择相对分子质量为一般选择相对分子质量为40004000获获60006000PEG PEG 对细胞有毒害作用，用离子对细胞有毒害作用，用离子交换树脂纯化可消除其对细胞的交换树脂纯化可消除其对细胞的毒害作用。毒害作用。优点：优点：成本低、不需要特殊的设成本低、不需要特殊的设备；融合子产生的异核率高；融备；融合子产生的异核率高；融合过程不受物种限制合过程不受物种限制缺点：缺点：融合过程繁琐、融合过程繁琐、PEG可可能对细胞造成毒害能对细胞造成毒害PEG融合所需试剂融合所需试剂融合液：融合液：pH 5.6 CaCl2 2H2O 810mmol KH2PO4 0.7
11、mmol 甘露醇或山梨醇甘露醇或山梨醇 0.51.0mol诱导液：诱导液：融合液融合液PEG 2045稀释液：稀释液：A液（液（g/100ml）pH6.0 B液液(g/100ml)pH10.5 葡萄糖葡萄糖 7.21 甘氨酸甘氨酸 0.375 CaCl2 2H2O 0.79 NaOH 0.169P1P2P1 P2混合静止混合静止1 min.融融 合合融合液融合液加入加入PEG稀稀 释释洗洗 涤涤加入稀释液加入稀释液加入培养基加入培养基培培 养养选选 择择PEG法的流程法的流程P1P2P1 P2融融 合合融合液融合液稀稀 释释洗洗 涤涤培培 养养选选 择择盐类融合剂种类盐类融合剂种类硝酸盐类：硝
12、酸盐类：NaNONaNO3 3、KNOKNO3 3、Ca(NOCa(NO3 3)2 2氯化物类：氯化物类：NaClNaCl、CaClCaCl2 2 、MgClMgCl2 2 、BaCl BaCl2 2葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠盐类融合的优缺点盐类融合的优缺点优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发融合融合（3 3）盐类融合法）盐类融合法（4 4）高）高CaCa2+2+和高和高pHpH值融合值融合Ca2+
13、浓度 0.05 mol/L取分离、纯化好的两种亲本原生质体以取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:11:1的比例混合的比例混合;加入加入0.05mol/LCaCl0.05mol/LCaCl2 2.2H.2H2 2O O和和0.4mol/L0.4mol/L甘露醇甘露醇;再用甘氨酸钠缓冲调节再用甘氨酸钠缓冲调节pHpH值到值到10.510.5，成为融合液，同时，成为融合液，同时在在3737下保温下保温0.5h;0.5h;用用0.4mol/L0.4mol/L甘露醇洗净高甘露醇洗净高CaClCaCl2 2和高和高pHpH值；值；两种原生质体的融合率达到两种原生质体的融合率达到10%10%。（5 5）生
14、物诱导融合法）生物诱导融合法仙台病毒法仙台病毒法 仙台病毒是一类被膜病毒，属于附黏液病毒族，它是多形仙台病毒是一类被膜病毒，属于附黏液病毒族，它是多形性颗粒，直径为性颗粒，直径为5060 nm，由两层磷脂组成的外膜包裹着，由两层磷脂组成的外膜包裹着RNA和蛋白质复合体，外膜上有两种糖蛋白，一种是和蛋白质复合体，外膜上有两种糖蛋白，一种是HANA蛋白质，一种是蛋白质，一种是F蛋白质，前者具有神经氨酸酶和血凝活性蛋白质，前者具有神经氨酸酶和血凝活性（分子量较大），后者具有融合和溶血作用（分子量较小（分子量较大），后者具有融合和溶血作用（分子量较小）。诱导细胞融合的机理：诱导细胞融合的机理：病毒被膜
15、上的两种糖蛋白可和细胞膜病毒被膜上的两种糖蛋白可和细胞膜表面的糖蛋白发生相互作用，从而使两个细胞可以互相接触，表面的糖蛋白发生相互作用，从而使两个细胞可以互相接触，在电镜下观察到在相接触的相邻细胞表面之间将产生一些微在电镜下观察到在相接触的相邻细胞表面之间将产生一些微小的细胞质桥。随着时间的推移，细胞质桥数量和桥的体积小的细胞质桥。随着时间的推移，细胞质桥数量和桥的体积也在增加，最后相邻细胞的细胞质就结合在一起了，形成细也在增加，最后相邻细胞的细胞质就结合在一起了，形成细胞凝集块再通过膜上蛋白质分子的重新排列，使膜中脂类分胞凝集块再通过膜上蛋白质分子的重新排列，使膜中脂类分子重排而打开质膜，最
16、后导致细胞融合。子重排而打开质膜，最后导致细胞融合。利用仙台病毒诱导细胞融合的步骤：利用仙台病毒诱导细胞融合的步骤：（1）先将亲本细胞（待融合的细胞）分别制成悬浮液、）先将亲本细胞（待融合的细胞）分别制成悬浮液、混合离心；混合离心；（2）将沉积细胞悬于灭活的仙台病毒悬液里，在）将沉积细胞悬于灭活的仙台病毒悬液里，在4oC低温下摇动低温下摇动20分钟，使细胞形成凝集块；分钟，使细胞形成凝集块；（3）再将温度升至）再将温度升至37oC，间歇摇动，间歇摇动30分钟，使其融合；分钟，使其融合；（4）洗去病毒，将融合细胞浮于选择性培养基进行培）洗去病毒，将融合细胞浮于选择性培养基进行培养。养。由于由于4
17、oC低温利于细胞聚集，在融合时需要提高低温利于细胞聚集，在融合时需要提高温度，否则融合不会发生。温度，否则融合不会发生。2.2.细胞融合的类型细胞融合的类型根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合分为两大根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合分为两大类：对称融合和非对称融合类：对称融合和非对称融合对称融合：对称融合：两个完整的细胞原生质体的融合两个完整的细胞原生质体的融合非对称融合：非对称融合：利用物理或化学的方法使某一亲本的利用物理或化学的方法使某一亲本的核或细胞质失活后再进行融合。融合的结果是获得核或细胞质失活后再进行融合。融合的结果是获得非对称杂种，即两融合亲本对杂种细胞的遗传组成非对称杂
18、种，即两融合亲本对杂种细胞的遗传组成的贡献是不对等的。的贡献是不对等的。3 3 杂种细胞的选择杂种细胞的选择互补选择互补选择：双荧光标记选择法：双荧光标记选择法：机械选择法：机械选择法：互补选择：互补选择：利用两个亲本具有不同遗传和生理特性，利用两个亲本具有不同遗传和生理特性，在特定培养条件下，只有发生互补作用的杂种细胞在特定培养条件下，只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。才能生长的选择方法。互补选择方法：互补选择方法：A、白化互补选择法、白化互补选择法 B、营养缺陷型互补选择、营养缺陷型互补选择 C、抗性互补选择、抗性互补选择 D、代谢互补抑制选择、代谢互补抑制选择 A、白化互补选
19、择法、白化互补选择法以矮牵牛为例：以矮牵牛为例：白化苗原白化苗原生质体生质体1白化苗原白化苗原生质体生质体2杂种细胞杂种细胞限定培养基限定培养基绿色愈伤组织绿色愈伤组织或幼苗杂种或幼苗杂种融合融合B、营养缺陷型互补选择、营养缺陷型互补选择Gly-型细胞型细胞Pro-型细胞型细胞融合融合Gly-、Pro-培养基培养基杂种细胞杂种细胞培养培养C、抗性互补选择、抗性互补选择抗抗A不抗不抗B型细胞型细胞抗抗B不抗不抗A型细胞型细胞融合融合含含A、B培养基培养基杂种细胞杂种细胞D、温度敏感型选择、温度敏感型选择耐高温不耐高温不耐低温型耐低温型细胞细胞耐低温不耐低温不耐高温型耐高温型细胞细胞融合融合高温下
20、培养高温下培养低温下培养低温下培养杂种细胞杂种细胞机械选择法：机械选择法：利用天然存在或是人为造成的两个亲利用天然存在或是人为造成的两个亲本在物理特性上的差异即可见标记，进行筛选。本在物理特性上的差异即可见标记，进行筛选。利用或人为的造成细胞生长或分化能力上的差异进利用或人为的造成细胞生长或分化能力上的差异进行筛选。行筛选。做法：在倒置显微镜下，用微管将融合细胞吸取出做法：在倒置显微镜下，用微管将融合细胞吸取出来进行培养的方法。来进行培养的方法。双荧光标记选择法：双荧光标记选择法：使用两种不同的荧光染料给双亲使用两种不同的荧光染料给双亲原生质体染上不同的颜色，然后借助不同的荧光标记，原生质体染
21、上不同的颜色，然后借助不同的荧光标记，在显微镜下进行筛选。在显微镜下进行筛选。无叶绿体的无叶绿体的原生质体原生质体含叶绿体的含叶绿体的原生质体原生质体FITC标记标记苹果绿苹果绿荧光荧光红色红色荧光荧光荧光显荧光显微镜微镜杂种杂种细胞细胞异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITC）异硫氰酸罗丹明（异硫氰酸罗丹明（RITC）（三）（三）杂种植株的再生和鉴定杂种植株的再生和鉴定植植物物原原生生质质体体融融合合及及再再生生植植株株过过程程杂种植株的鉴定方法：杂种植株的鉴定方法：（1 1）杂种植物形态特征、特性鉴定）杂种植物形态特征、特性鉴定（2 2）杂种植物的核型分析）杂种植物的核型分析（3 3）同工
22、酶分析）同工酶分析（4)4)分子标记鉴定：分子标记鉴定：RFLP、AFLP、SSR、ISSR、RAPD标记鉴定标记鉴定形态学鉴定形态学鉴定 形态标记即植物的外部特征，如花的形状及颜形态标记即植物的外部特征，如花的形状及颜色、果实色、果实(种子种子)的形状及颜色、叶型、表皮毛、株的形状及颜色、叶型、表皮毛、株型、穗型、千粒重、耐逆性以及对疾病的抗性等。型、穗型、千粒重、耐逆性以及对疾病的抗性等。形态标记简单直观，但是标记少、多态性差、易受形态标记简单直观，但是标记少、多态性差、易受环境条件和其它修饰基因的影响，并且许多性状为环境条件和其它修饰基因的影响，并且许多性状为数量性状，由几个位点控制，表
23、现为一个范围，而数量性状，由几个位点控制，表现为一个范围，而不是简单的性状差异。不是简单的性状差异。杂种植物的核型分析杂种植物的核型分析 细胞标记主要包括染色体核型细胞标记主要包括染色体核型(染色体数目、染色体数目、大小、随体、着丝点位置等大小、随体、着丝点位置等)和带型和带型(C带、带、N带、带、G带等带等)。细胞学标记位点较少，而且对于亲缘关。细胞学标记位点较少，而且对于亲缘关系较近的物种，由于细胞学标记差别不明显，所系较近的物种，由于细胞学标记差别不明显，所以很难根据细胞学特征来区分。以很难根据细胞学特征来区分。18条染色体条染色体36条染色体条染色体同工酶标记同工酶标记 同工酶为共显性
24、，父本和母本的基因可以同时在同工酶为共显性，父本和母本的基因可以同时在后代中表达，不受环境因素影响，中仅有相对稳定后代中表达，不受环境因素影响，中仅有相对稳定;分析操作简便，所需材料较少分析操作简便，所需材料较少;不足之处是位点数较不足之处是位点数较少，植物少，植物10201020种同工酶表现出位点的多态性，覆盖种同工酶表现出位点的多态性，覆盖的基因组范围有限。的基因组范围有限。染色体原位杂交染色体原位杂交 染色体原位杂交（染色体原位杂交（Genomic in situ hybridization，GISH）是一项利用标记的）是一项利用标记的DNA探针与染色体上的探针与染色体上的DNA杂交，在
25、染色体上直接进行检测的分子标记技杂交，在染色体上直接进行检测的分子标记技术。通常用同位素或生物素、地高辛标记的术。通常用同位素或生物素、地高辛标记的DNA探探针与染色体针与染色体DNA杂交，通过放射自显影或通过抗原杂交，通过放射自显影或通过抗原抗体反应，在荧光显微镜下观察抗体反应，在荧光显微镜下观察DNA探针与其互补探针与其互补的的DNA序列结合的位置。最大优点是可以显示在体序列结合的位置。最大优点是可以显示在体细胞杂种中哪条染色体来源于这个亲本，哪条染色细胞杂种中哪条染色体来源于这个亲本，哪条染色体来源于另一个亲本，因而更准确、直观。体来源于另一个亲本，因而更准确、直观。分子生物学标记分子生
26、物学标记植物的分子标记主要有植物的分子标记主要有RAPD、RELP、AFLP、SSR、ISSR等。等。（四）原生质体融合的应用（四）原生质体融合的应用白菜白菜白菜白菜甘蓝甘蓝甘蓝甘蓝白菜甘蓝白菜甘蓝白菜甘蓝白菜甘蓝植物体植物体细细胞胞杂杂交交克服了植物克服了植物远远源源杂杂交不交不亲亲和的障碍和的障碍，在培育新品种方面具有广在培育新品种方面具有广阔阔的的应应用前景。用前景。目前，已得到栽培目前，已得到栽培烟草与野生烟草烟草与野生烟草、栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、籼、栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、籼稻与粳稻、小麦与稻与粳稻、小麦与鹅鹅冠草等冠草等细细胞胞杂杂种及其后代，种及其后代，获获
27、得了有价得了有价值值的新品系或育种的新品系或育种上有用的新材料。上有用的新材料。番茄番茄+马铃马铃薯薯19781978年德国科学家梅歇年德国科学家梅歇尔尔斯等人斯等人把把马铃马铃薯薯(potato)(potato)和番茄和番茄(tomato)(tomato)的原生的原生质质体融合体融合获获得了体得了体细细胞胞杂杂种种“泡泡马马豆豆”（pomato)pomato)杂杂交株同交株同时时具有具有马铃马铃薯和番茄的一些形薯和番茄的一些形态态特特征，但没有征，但没有产产生可生可结实结实的花、果的花、果实实和真正意和真正意义义上的上的块块茎，不能茎，不能产产生生经济经济效益。效益。主要原因：生物的基因表达
28、不是主要原因：生物的基因表达不是孤立的，它孤立的，它们们之之间间是相互是相互调调控、控、相互影响的，相互影响的，杂杂交株具有两个物交株具有两个物种的种的遗传遗传物物质质，但表达互相干，但表达互相干扰扰。泡马豆（泡马豆（pomato）动物细胞和植物细胞之间能不能杂交动物细胞和植物细胞之间能不能杂交？五、原生质体的遗传饰变五、原生质体的遗传饰变1.1.原生质体的遗传转化原生质体的遗传转化指以原生质体为受体，通过一定途径或技术奖外源基指以原生质体为受体，通过一定途径或技术奖外源基因导入植物原生质体，获得能使外源基因稳定表达的因导入植物原生质体，获得能使外源基因稳定表达的转基因植株的技术。转基因植株的
29、技术。常用方法：常用方法：PEGPEG介导转化法介导转化法 电击穿孔转化法电击穿孔转化法 农杆菌共培养转化法农杆菌共培养转化法细胞核移植细胞核移植原生质体摄取分离的细胞核是转移和基因组的一条可原生质体摄取分离的细胞核是转移和基因组的一条可行的途径。行的途径。细胞核的分离细胞核的分离：匀浆法：匀浆法核移植的方法核移植的方法：夹层离心法、：夹层离心法、PEGPEG法、脂质体包裹融法、脂质体包裹融合移植法、显微注射法合移植法、显微注射法3.3.叶绿体移植叶绿体移植意义：意义：有助于更精确地研究细胞器遗传学和种间细胞器互作。有助于更精确地研究细胞器遗传学和种间细胞器互作。有助于进一步弄清叶绿体的发育生物学及核和叶绿体有助于进一步弄清叶绿体的发育生物学及核和叶绿体DNADNA如何控制叶绿体的发生。如何控制叶绿体的发生。在应用研究方面，有可能用于植物光合效率的改良在应用研究方面，有可能用于植物光合效率的改良方法：方法：用机械法或原生质体分离法获得叶绿体；以白用机械法或原生质体分离法获得叶绿体；以白化突变体或无叶绿素的细胞作为受体，进行移植，经化突变体或无叶绿素的细胞作为受体，进行移植，经培养获得叶绿体移植的再生植株。培养获得叶绿体移植的再生植株。