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1、原生质体融合技术原生质体融合技术1、原生质体融合技术的发展2、原生质体的制备3、原生质体形成率的计算4、灭活原生质体融合5、原生质体融合的方法6、原生质体融合技术应用与展望1、原生质体融合技术发展简介 原生质体融合技术育种(protoplast fusion)是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。从1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象到1979年匈牙利的Pesti提出了运用融合育种技术提高青霉素的产量,原生质体融合技术的成熟使得开始了在微生物育种实际工作中的应用。原生质体融合技术的优点 1）
2、可实现常规杂交方法无法做到的种间、属间、门间甚至跨界的远缘杂交；2）并可以大幅度提高亲本之间的重组频率，集中双亲株优良性状的机会更大。3）与常规杂交技术相比，原生质体融合时亲本整套染色体参与交换,遗传物质转移和重组性状较多,集中双亲本优良性状机会更大，为异源DNA片段交叉互换创造一个优良的环境；4）大幅度提高亲本之间重组频率，扩大了重组的亲本范围。2、原生质体的制备2.1 原生质体融合技术的过程 原生质体融合技术一般包括标记菌株的筛选、原生质体制备、培养、融 合、再生,原生质体转化等。原生质体的制备首先要去除细胞壁,当前去壁的方法主要有机械法、非酶法和酶法,现在使用较多的为酶法。2.2 原生质
3、体制备条件的确定具体包括：1）酶解温度；2）酶浓度；3）酶解时间；4）甘氨酸；5）渗透压；6）菌龄；酶解温度对原生质体制备的影响不同的酶具有各自不同的最适温度，同时还要注意菌株生长的最适温度，以避免因温度不当而导致原生质体活性降低，甚至破坏，因此确定酶解温度通常要二者兼顾，这对水解细胞壁是至关重要的。一般酶解温度控制在2040度。酶浓度对原生质体制备的影响原生质体形成率在一定范围内与溶菌酶的浓度成正比。当浓度过高溶菌酶作用于原生质体时，形成率得到提高高，但溶菌酶中往往含有一些对原生质体有害的酶类（如过氧化物酶、核糖核酸酶等），因此，当达到一定浓度时，必然会严重地影响原生质体的活性；而且酶量过大
4、会使细菌脱壁太彻底，失去了原生质体再生时合成细胞壁的引物，易使菌体凝集，降低原生质体的再生率。酶解时间对原生质体制备的影响充足的酶解时间是细菌原生质体化的必要条件，原生质体形成率随酶解时间延长而增加，但再生率会由于随酶解时间过长导致细胞壁脱壁彻底无法再生而降低。原因可能是酶解超过某一临界值后，细胞壁消化过于充分使细胞破裂或失去再生能力，从而导致再生率的降低再生培养基的组分也是影响原生质体再生的一个重要因素。因此要控制好原生质体制备时的酶解时间。甘氨酸浓度对原生质体制备的影响在培养基中添加一定浓度的甘氨酸培养后，易于使细胞壁的网状结构松动，释放原生质体，可有效促进菌丝体细胞壁形成对溶菌酶敏感的结
5、构，提高制备的原生质体质量;添加甘氨酸后，发酵液的状态也有所改变，菌丝结块、挂壁现象减少，菌丝分散更加均匀。但过高的甘氨酸浓度会抑制菌体的正常生长而得不到足够的菌丝体。渗透压对原生质体制备的影响原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感，必须在高渗透压或等渗透压的溶液或培养基中才能维持其生存；在低渗溶液中，原生质体将会破裂而死亡，对于不同的菌种，采用的渗透压稳定剂不同。2.3原生质体形成率的计算计算方法：常用的是血球计数板记数法。原生质体形成率(%)=(酶解前的菌落数-酶解后的菌落数）/酶解前的菌落数100%。3、灭活原生质体融合3.1亲本及其遗传物质的标记选择 常用的有带隐性性状的营养缺陷性和抗性
6、标记，还有热致死（灭活），孢子颜色和菌落形态。目前比较好的是灭活标记。3.2常用的灭活标记方法：1）热灭活：主要作用在细胞质中，使核糖体16S亚基或核糖体RNA受到损伤。2）紫外线灭活：致死损伤部位主要在DNA位点上。3）化学药剂灭活：使细胞代谢过程中的某些关键酶不可逆的失活，导致原生质体即使在适宜的条件下仍然不能再生。3.3灭活的机理3.4灭活原生质体特点与应用灭活机制目前对灭活原生质体的融合机制还不很清楚。1）Wright 的损伤互补原则 Wright使用不同的生化药剂分别灭活两株动物细胞，融合后得到了活的杂交细胞，他认为这是由于两株细胞的致死损伤得到了互补的结果。Fodor等热灭活带有标
7、记的 B.megaterium 的二个亲株原生质体，经PEG 诱导后未获得融合子。李焕娄等在研究弗氏链霉菌的株间灭活原生质体融合时发现，当两亲株的原生质体分别用热和紫外线，或都用紫外线灭活，然后进行融合，而两亲株都用热灭活时，未能获得重组体。这些实验都支持了Wright 的损伤互补原则。2）不能互补融合形成重组体的原因 因为紫外线的作用位点主要在原生质体的 DNA 上，而且不同的细胞中作用位置可能有很大差别，这样双亲株原生质体用紫外线灭活或分别用紫外线和温度灭活，融合后损伤可以互补，而双亲株都用热灭活，可能在不同的细胞中作用位点差别不大。所以不能互补融合形成重组体。3）在单亲灭活原生质体融合中
8、，有人认为可以实现遗传物质的单向传递，被灭活亲株起供体作用。但是在双亲灭活原生质体融合时，二亲株都以零或接近零的存活率被灭活，仍可以相当高的频率形成重组体，说明灭活的原生质体仍可以起到受体作用，否则不能形成重组体。因此认为只有损伤互补才能较为圆满地解释灭活融合。灭活原生质体融合技术的特点1）灭活原生质体融合，特别是双亲灭活原生质体融合，省去了使出发菌株获得稳定遗传标记的过程，灭活亲株原生质体的方法又易于掌握；2）可以在不利用选择培养基的情况下，排除了双方亲本类型的再生产物，有利于选择重组融合子，提高了筛选效率。3）遗传物质传递更完善，易获得性状优良，产量高的融合菌株等优点，受到国内外学者的重视
9、。灭活原生质体融合技术的应用1）啤酒酿造中应用的S.cerevisiae 要求具有良好的凝集性能，可以使啤酒发酵液澄清速度加快，降低酵母分离时的能量消耗，而且可以防止酵母在发酵液中长时间悬浮，自溶后影响啤酒风味。嗜杀酵母细胞质中存在着嗜杀质粒，在一定条件下合成的嗜杀毒素可以杀死同族及亲缘酵母，防止野生酵母在发酵过程中的污染。2）重要的是，通过原生质体融合可以用不产生抗生素的链霉菌（Streptomyces spp）筛选到新型抗生素的产生菌。3）陈五岭等利用双亲株灭活原生质体融合技术，结果发现热灭活和紫外灭活的双亲株原生质体在 40 PGE 诱导融合 10min，对融合最为有利，为进一步选育广谱
10、高效的新杀虫菌株奠定了基础。4）在关于微生物原生质体融合的基础理论和遗传育种研究中，灭活作为选择判断融合子的绝对标准，应用日益广泛.4、原生质体融合4.1原生质体融合的方法1）电容法2）激光诱导融合4.2融合子的筛选与鉴定 结合亲本抗药性标记、菌体形态、菌落形态、DNA含量稳定性、可溶性蛋白凝胶电泳图谱分析等方面对融合子进行了筛选。利用RFLP、电泳核型技术通过能够分离DNA、基于PCR技术的分子标记RAPD 可以对融合子进行鉴定，以确保获得的融合子为稳定遗传的目的重组子。5、原生质体融合技术应用与展望5.1目前的原生质体融合技术的的应用具体包括：）提高产量或质量，合成新物质，如提高抗生素的合成；）改良菌种的遗传特性，如酵母菌属间原生质体融合构建高温酵母菌株和L-异亮氨酸高产菌的原生质体融合育种；）优化菌种的发酵特性，如酒精的酿造中的应用；）质粒转移；）原生质体与细胞核融合；）进行遗传分析5.2原生质体融合技术展望 近年来,灭活原生质体融合、离子束细胞融合、非对称细胞融合以及基因重排分子育种等新方法相继提出并应用于微生物育种,这是原生质体融合技术的新发展。相信随着技术的不断完善,原生质体融合在微生物育种中占有的地位会越来越重要。