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1、江苏常康医疗科技有限公司文件名称无菌检验标准操作规程（SOP）页码：1/5文件编号版 次第一版制 定审 核批 准制定日期审核日期批准日期颁发部门颁发数量生效日期分发单位目的：制定无菌检验标准操作规程，确保检验操作正确。范围：本标准适用于本公司大容量注射剂无菌检验操作。责任者：质管部、化验室主任、QC检验员内容：1、标准依据：中国药典2010年版二部附录XI H。2、简述：无菌检查方法系用于检查药品是否无菌的一种方法。检查项目包括需气菌、厌气菌及真菌检查。若供试品符合该项检查方法的有关规定，仅表明了在该检验条件下未发现微生物污染。3、环境要求：该项检查应在环境洁净度万级（C级）背景下的局部百级（
2、A级）的单向流区域内或隔离系统中进行。其全过程必须严格遵守无菌操作。防止微生物污染，但所采取的措施不得影响供试品中微生物的检出。操作前环境洁净度应经验证。日常检验需对试验环境进行监控。5、方法验证：进行该项检查前应按照无菌检查方法验证规程确认该方法的适用性。4、人员要求：无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术培训。6、检验数量及检验量：6.1、接种每种培养基所需的最少检验数量:2%或10个（取较少者），供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接过滤法，应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作阳性对照用。6.2、每支供试品接入每种培养
3、基的最少量:半量（100mlV500ml），采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种的供试品总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。7、细菌培养温度为3035，真菌培养温度为2328。8、仪器用具：垂直层流超净工作台、生化培养箱、电热恒温水浴箱、显微镜、手提灭菌器、离心机、双碟、试管、三角瓶、刻度离心管、注射器（针头）、剪刀、镊子、注射器盒、75酒精棉球、紫外光灯365nm、真空泵、HTY智能全封闭集菌仪、一次性使用集菌培养器。9、消毒剂配制：9.1、75乙醇溶液（配制酒精棉球用）。9.2、0.2新洁尔灭溶液（配制消毒棉球用）。9.3、2来苏尔溶液（配制消毒棉球用）。10
4、、试剂及培养基的配制：10.1、0.1蛋白胨水溶液：取蛋白胨1.0g，加水1000ml,微温使溶解，滤清，调节PH值至7.10.2，分装，灭菌。10.2、pH7.0灭菌氯化钠蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml微温溶解，滤清，分装，灭菌。10.3、根据供试品特性，可选用其他经验证的适宜溶液作为稀释液、冲洗液。如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂。10.4、硫乙醇酸盐流体培养基：按商品说明称取培养基，配制，摇匀，分装，按培养基说明高压灭菌，保存备用。分装的容器应适当，其装量与容器高度比例应符
5、合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则须经100水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却只限加热一次，并应防止被污染。10.5、改良马丁培养基：取商品干燥培养基28.5g，加水1000ml，加热溶解，分装，121高压灭菌15分钟（若干燥培养基结块应勿使用）。10.6、选择性培养基：按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法验证试验(附表1常见干扰物的中和剂或灭活方法见微生物限度检查法中）。10.7、营养肉汤培养基：按商
6、品说明称取培养基，配制，加热，溶解，分装，按培养基说明高压灭菌，保存备用。10.8、营养琼脂培养基：取商品干燥培养基3.4g，加蒸馏水1000ml，加热溶解分装，121高压灭菌15分钟。10.9、改良马丁琼脂培养基：取商品干燥培养基制备或按改良马丁培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调节PH值使灭菌后PH值为6.40.2，分装，121高压灭菌15分钟。10.10、制备好的培养基应保存在225，避光的环境中。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用。若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。11、试验前的准备工作11.1、用具的洗刷11.1.1、玻璃器皿：如试管、量筒、移液管、刻度吸管、离
7、心管、三角瓶、双碟等用清洁液浸泡，用流水洗涤，再用蒸馏水洗涤45次，倒置，晾干。试管、移液管、三角瓶等使用过后，应先消毒倒出内容物后，再清洗晾干。11.1.2、注射器用水冲洗后，用洗涤剂冲洗，然后用水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗3次。11.1.3、剪刀、镊子用水及去污粉洗涤，用水冲洗干净，再用蒸馏水洗涤3次。11.1.4、多用薄膜过滤器，玻璃管等用饮用水及蒸馏水洗净、晾干。11.1.5、洁净服、裤、帽子、口罩等用水洗涤洁净后，晾干。11.2、用具的包扎及灭菌11.2.1、移液管、刻度吸管在管口上端内，松松塞入少许脱脂药物，然后每支管用白纸严密卷好，再用两层牛皮纸一起包扎。11.2.2、洗涤洁净的注
8、射器及适配针头各部件与剪刀、镊子一并入垫有纱布的铝盒内，一层层放好，盖上纱布，将铝盒盖好，用牛皮纸包扎。11.2.3、试管、三角瓶等在管（瓶）口塞上纱布棉纱用牛皮纸包装严密。11.2.6、将洁净服、等用布口袋配套装入，扎紧口袋，用牛皮纸包扎好。11.2.7、将以上包扎好的用具在121蒸汽灭菌20分钟。或采取适宜的灭菌方法。（适宜高温灭菌的器皿可采用160干热灭菌）11.2.8、物品灭菌完毕，勿立即置冷处，以免急速冷却导致染菌，应置恒温培养箱中干燥。11.3、洁净室的清洁与灭菌11.3.1、洁净室及超净台，每周用高锰酸钾加甲醛薰蒸灭菌。11.3.2、在每次操作前，应作好清洁工作，并用0.2%新洁
9、尔灭溶液或2%来苏尔或75乙醇擦洗超净台工作台面及可能污染的死角，然后开启紫外线灯杀菌半小时，超净台空气过滤器自净半小时。操作完毕后，用上述消毒液，再次处理工作台面，开紫外光灯杀菌30分钟以上。12、操作 12.1、开启传递窗外侧门，将物品表面消毒后置传递窗内，关闭窗门。12.2、操作人员按进入洁净室更衣程序洗手、更衣换工作鞋，换无菌衣、裤、口罩。进入洁净室内，开启内侧门，取出物品，关闭内侧门，经缓冲间带入洁净室内，物品放置于实验台上，关闭洁净室门，人员离开洁净室，继续用紫外灯照射半小时，关灯，再将用具放入超净台内。12.3、培养基适用性检查：无菌检查用硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应
10、符合的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品检查前或与供试品检查同时进行。12.3.1、无菌效果检查：每批培养基随机取不少于5支（瓶）培养14天，应无菌生长。12.3.2、灵敏度检查：12.3.2.1、菌种及菌液制备：12.3.2.1.1、检查用菌种包括：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC(B)26 003铜绿假单胞菌（Pstudomonas aeruginosa）CMCC(B)10 104枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC(B)63 501生孢梭菌（Clostridium sporgenes）CMCC(B)64 941白色念珠
11、菌（Candida albicaus）CMCC(F)98 001黑曲菌（Aspergillus niger）CMCC(F)98 00312.3.2.1.2、菌液制备方法：铜绿假单胞菌菌悬液的制备方法同金黄色葡萄球菌菌悬液制备方法，其他参见无菌检查方法验证规程进行。12.3.2.2、培养基接种：取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另一支不接种，作为空白对照，培养3天；每管装量为9ml的改良马丁培养基5支分别接种小于100CFU的白色念珠菌、黑曲菌各2支，另一支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结
12、果。12.3.2.3、结果判断：空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判断该培养基灵敏度符合规定。12.4、配制的培养基应在凉暗处保存，一般不得超过2周。临用前细菌和霉菌培养基分别经3035和2025培养不少于48小时和72小时，证明无菌生长时方可使用。12.5、阳性对照试验：12.5.1、应根据供试品特性选择阳性对照菌，无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品以生孢梭菌为对照品；抗真菌的供试品以白色念珠菌为对照品。12.5.2、阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验。12.5.3、取各阳性对照菌悬
13、液（含菌量小于100CFU）及供试品（用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量），以无菌操作加入相应培养基中，培养4872小时，检查应生长良好。（阳性对照试验操作应与微生物限度检查操作隔离进行，防止交叉污染）。12.6、阴性对照试验：取供试品的相应溶剂或稀释剂冲洗液同法操作，培养14日应无菌生长。12.7、供试品检查：12.7.1、供试品外部消毒：包装瓶外壁用75乙醇擦拭，待干。12.7.2、供试品的制备：用灭菌镊子取出注射器，在火焰旁将针芯插入针管并安上针头，注射器针头应迅速通过火焰数次，用注射器以无菌操作直接吸取供试液。或抽至已灭菌玻璃容器中，用稀释剂稀释为供试液，如为可溶于水的固体供试
14、品，应取规定量，加入适宜的灭菌稀释液溶解做为供试液。12.7.3、直接接种法：取供试品，按上述操作进行外部消毒和制备后，用灭菌注射器以无菌操作自每管中吸取供试品，在近火焰旁以左手持培养基，右手半握拳，以小指和无名指拔开培养基管棉塞，管口通过火焰，移至火焰下侧，分别将各供试品1ml（或规定量，除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%）沿培养基管壁加入各培养基管内，每个供试品均分别接种硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基各5管，另取硫乙醇酸盐流体培养基管一支，同法操作，操作结束后，接种对照菌液1ml（小于100CFU）作为供试品阳性对照。硫乙醇酸盐流体培
15、养基，每管装量不少于15ml，改良马丁培养基不少于10ml。注入供试液时，切勿向液面直射，以免将空气中的氧带入培养基中，并在火焰旁将塞子塞严。接种后轻轻振动使均匀。12.7.4、薄膜过滤法采用HTY全封闭无菌检测系统集菌。12.7.4.1取出培养器先检查包装是否完好无损。检查用滤膜孔径应不大于0.45m，直径约为50mm。根据供试品特性选择滤膜材质。抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜。滤器及滤膜使用前应经适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。12.7.4.2按HTY全封闭无菌检测系统操作规程操作12.7.4.3将培养器逐个插放在不锈钢座上，将培养器的弹性软管装入集菌仪泵头，注
16、意定位准确，软管走势顺畅。12.7.4.4水溶性供试品供试品处理前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面以发挥滤膜的最大过滤效率。12.7.4.5供试品瓶瓶表面用75%乙醇或0.2%洗洁尔灭擦拭灭菌，然后将培养器导管上的针头插至供试品瓶胶塞内，开启集菌仪电源，使药液均匀通过集菌培养器，待药液排放尽，关闭电源，将针头取下。根据质量标准规定或验证情况，需要用冲洗液冲洗滤膜时，将针头插至装有适宜冲洗液的瓶塞内，冲洗集菌器滤膜，冲洗次数及冲洗量应经验证，每张滤膜冲洗量一般为100ml，冲洗次数一般不少于3次，且总冲洗量
17、不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。非水溶性制剂供试品取规定量，直接过滤；或混合溶于含聚山梨酯80或其他乳化剂的稀释液中，充分混合，立即过滤。用含0.1%1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至少三次。滤膜于含或不含聚山梨酯80的培养基中培养。12.7.4.6过滤完毕关闭电源。将集菌培养器排气孔上的胶帽取下，将集菌培养器底部的排液管口拧上，将冲洗液瓶取下换上相应的培养基瓶，启动电源，将培养基泵入指定培养器内，关闭电源。12.7.4.7用小夹夹闭与培养器连接部的软管，在软管切线位置剪断软管，将软管开口端套在空气过滤器开口上。12.7.4.8每次操作时，均应取相应的稀释剂及冲洗液同法操作，
18、作为阴性对照。12.7.4.9将已操作完毕的含培养基的集菌培养器移出无菌室，取其一管作阳性对照依阳性对照菌选择原则加入相应对照菌液。12.7.5、硫乙醇酸盐流体培养基在3035培养14天，改良马丁培养基在2328培养14天。培养期间应逐日检查是否有菌生长，并填写无菌检查记录。如供试品管出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观判断时，可取该培养液接种在另一支相同新鲜培养基中，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。12.8结果判断：阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定;若供试品管中任何显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明实验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效：（1） 无菌检查试验所用设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查要求；（2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；（3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或） 无菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。