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1、文件名称文件编号制 y 定制定日期颁发部门无菌检验标准操作规程（SOPYZ-Q3(z)-ZL-10-2016审核页码：1/5版次第三版批准审核日期批准日期颁发数量生效日期分发单位目的：制定无菌检验标准操作规程，确保检验操作正确。范围：本标准适用于本公司大容量注射剂无菌检验操作。责任者：质管部、化验室主任、QC 检验员内容：1 标准依据：中国药典2015 年版二部附录 XI H。2、 简述：无菌检查方法系用于检查药品是否无菌的一种方法。检查项目包括需气菌、 厌气菌及真菌检查。若供试品符合该项检查方法的有关规定，仅表明了在该检验条件下未发 现微生物污染。3、 环境要求：该项检查应在环境洁净度万级（
2、C 级）背景下的局部百级（A 级）的单向 流区域内或隔离系统中进行。其全过程必须严格遵守无菌操作。防止微生物污染，但所采取 的措施不得影响供试品中微生物的检出。操作前环境洁净度应经验证。日常检验需对试验环 境进行监控。5、 方法验证：进行该项检查前应按照无菌检查方法验证规程确认该方法的适用性。4、 人员要求：无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术培训。6、 检验数量及检验量：6.1、接种每种培养基所需的最少检验数量：2%或 10 个（取较少者），供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加 1/2 的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接过滤法，应增加供 试品无菌检查时每个培养基容器接种的
3、样品量作阳性对照用。6.2、每支供试品接入每种培养基的最少量：半量（100mlwV 200ml），采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种的供试品总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的 全部内容物过滤。7、 细菌培养温度为 3035C,真菌培养温度为 2328C。&仪器用具：垂直层流超净工作台、生化培养箱、电热恒温水浴箱、显微镜、离心机、 双碟、试管、三角瓶、刻度离心管、注射器（针头）、剪刀、镊子、注射器盒、75%酒精棉球、 紫外光灯 365nm 真空泵、一次性使用集菌培养器。9、 消毒剂配制：9.1、75%乙醇溶液（配制酒精棉球用）。9.2、0.2 %新洁尔灭溶液（配制消毒棉球用）。
4、9.3、2%来苏尔溶液（配制消毒棉球用）。10、试剂及培10.1、0.1 %蛋白胨水溶液：取蛋白胨 1.0g，加水 1000ml,微温使溶解，滤清，调节 PH 值至7.1 0.2，分装，灭菌。10.2、pH7.0 灭菌氯化钠蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾 3.56g、磷酸氢二钠 7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨 1.0g，加水 1000ml 微温溶解，滤清，分装，灭菌。10.3、根据供试品特性，可选用其他经验证的适宜溶液作为稀释液、冲洗液。如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂。10.4、硫乙醇酸盐流体培养基：按商品说明称取培养基，配制，摇匀，分装，按培养基说明高
5、压灭菌，保存备用。分装的容器应适当，其装量与容器高度比例应符合培养结束后培 养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的加热一次，并应防止被污染。10.5、改良马丁培养基：取商品干燥培养基 28.5g，加水 1000ml,加热溶解，分装，121C高压灭菌 15 分钟（若干燥培养基结块应勿使用）。10.6、选择性培 ，养基：按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法验证试验10.7、营养肉汤培养基：按商品说明称取培养基，配制，加热，溶解，分装，按培养基 说明咼压火菌，保存备用。10.8、 营养琼脂培养基：取商品干燥培养
6、基3.4g，加蒸馏水 1000ml，加热溶解分装， 1211/2。供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的 1/5,否则须经 100C水浴加热至粉红色消失（不超过 20 分钟），迅速冷却 只限C高压灭菌 15 分钟。10.9、改良马丁琼脂培养基：取商品干燥培养基制备或按改良马丁培养基的处方及制法， 加入 14.0g 琼脂，调节 PH 值使灭菌后 PH 值为 6.4 0.2，分装，121C高压灭菌 15 分钟。10.10、制备好的培养基应保存在 225C,避光的环境中。培养基若保存于非密闭容器 中，一般在三周内使用。若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。11、试验前的准备工作11.
7、1、用具的洗刷11.1.1、 玻璃器皿：如试管、量筒、移液管、刻度吸管、离心管、三角瓶、双碟等用清 洁液浸泡，用流水洗涤，再用蒸馏水洗涤 45 次，倒置，晾干。试管、移液管、三角瓶等使 用过后，应先消毒倒出内容物后，再清洗晾干。11.1.2、 注射器用水冲洗后，用洗涤剂冲洗，然后用水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗 3 次。11.1.3、 剪刀、镊子用水及去污粉洗涤，用水冲洗干净，再用蒸馏水洗涤11.1.4、 多用薄膜过滤器，玻璃管等用饮用水及蒸馏水洗净、晾干。11.1.5、 洁净服、裤、帽子、口罩等用水洗涤洁净后，晾干。11.2、用具的包扎及灭菌11.2.1、 移液管、刻度吸管在管口上端内，松松塞入
8、少许脱脂药物，然后每支管用白 纸严密卷好，再用两层牛皮纸一起包扎。11.2.2、 洗涤洁净的注射器及适配针头各部件与剪刀、镊子一并入垫有纱布的铝盒内， 一层层放好，盖上纱布，将铝盒盖好，用牛皮纸包扎。11.2.3、 试管、三角瓶等在管（瓶）口塞上纱布棉纱用牛皮纸包装严密。3 次。11.2.6、 将洁净服、等用布口袋配套装入，扎紧口袋，用牛皮纸包扎好。11.2.7、 将以上包扎好的用具在 121C蒸汽灭菌 20 分钟。或采取适宜的灭菌方法。（适宜高温灭菌的器皿可采用 160C干热灭菌)1128、物品灭菌完毕，勿立即置冷处，以免急速冷却导致染菌，应置恒温培养箱中干 燥。11.3、洁净室的清洁与灭菌
9、11.3.1、 洁净室及超净台，每周用高锰酸钾加甲醛薰蒸灭菌。11.3.2、 在每次操作前，应作好清洁工作，并用0.2%新洁尔灭溶液或 2%来苏尔或 75% 乙醇擦洗超净台工作台面及可能污染的死角，然后开启紫外线灯杀菌半小时，超净台空气过滤器自净半小时。操作完毕后，用上述消毒液，再次处理工作台面，开紫外光灯杀菌以上。12、操作12.1、开启传递窗外侧门，将物品表面消毒后置传递窗内，关闭窗门。12.2、操作人员按进入洁净室更衣程序洗手、更衣换工作鞋，换无菌衣、裤、口罩。 进入洁净室内，开启内侧门，取出物品，关闭内侧门，经缓冲间带入洁净室内，物品放置于 实验台上，关闭洁净室门，人员离开洁净室，继续
10、用紫外灯照射半小时，关灯，再将用具放 入超净台内。12.3、培养基适用性检查：无菌检查用硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符 合的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品检查前或与供试品检查同时进行。12.3.1、 无菌效果检查：每批培养基随机取不少于5 支(瓶)培养 14 天，应无菌生长。12.3.2、 灵敏度检查：12.3.2.1、 菌种及菌液制备：12.3.2.1.1 、检查用菌种包括：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ) CMCC(B)26 003铜绿假单胞菌(Pstudomonas aeruginosa ) CMCC(B)10 104枯草芽抱杆菌
11、(Bacillus subtilis ) CMCC(B)63 501生抱梭菌(Clostridium sporgenes ) CMCC(B)64 941白色念珠菌(Candida albicaus ) CMCC(F)98 001黑曲菌(Aspergillus niger ) CMCC(F)98 00312.3.2.1.2、 菌液制备方法：铜绿假单胞菌菌悬液的制备方法同金黄色葡萄球菌菌悬液 制备方法。12.3.2.2、 培养基接种：取每管装量为 12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基 9 支，分别接种 小于100CFU 勺金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌、生抱梭菌各2 支，另一支不接种，作为
12、空白对照，培养 3 天；每管装量为 9ml 的改良马丁培养基 5 支分别接种小于 100CFU 的白色念珠菌、黑曲菌各 2 支，另一支不接种作为空白对照，培养 5 天。逐日观察结果。12.3.2.3、 结果判断：空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判断该 培养基灵敏度符合规定。12.4、 配制的培养基应在凉暗处保存，一般不得超过2 周。临用前细菌和霉菌培养基分 别经 3035C和 2025C培养不少于 48 小时和 72 小时，证明无菌生长时方可使用。12.5、阳性对照试验：12.5.1、应根据供试品特性选择阳性对照菌，无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，30 分钟以金黄色葡萄
13、球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品以生抱梭菌为对照品；抗真菌的供试品以白色念珠菌为对照品。12.5.2、 阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验。12.5.3、 取各阳性对照菌悬液（含菌量小于 100CFU 及供试品（用量同供试品无菌检查 每份培养基接种的样品量），以无菌操作加入相应培养基中，培养 4872 小时，检查应生长 良好。邙日性对照试验操作应与微生物限度检查操作隔离进行，防止交叉污染） 。12.6、 阴性对照试验：取供试品的相应溶剂或稀释剂冲洗液同法操作，培养菌生长。12.7、 供试品检查：12.7.1、 供试品外部消毒：包装瓶外壁用 75%乙
14、醇擦拭，待干。12.7.2、 供试品的制备：用灭菌镊子取出注射器，在火焰旁将针芯插入针管并安上针头， 注射器针头应迅速通过火焰数次，用注射器以无菌操作直接吸取供试液。或抽至已灭菌玻璃 容器中，用稀释剂稀释为供试液，如为可溶于水的固体供试品，应取规定量，加入适宜的灭 菌稀释液溶解做为供试液。12.7.3、 直接接种法：取供试品，按上述操作进行外部消毒和制备后，用灭菌注射器以无菌操作自每管中吸取 供试品，在近火焰旁以左手持培养基，右手半握拳，以小指和无名指拔开培养基管棉塞，管 口通过火焰，移至火焰下侧，分别将各供试品1ml （或规定量，除另有规定外，每个容器中10%沿培养基管壁加入各培5 管，另取
15、硫1ml （小于 100CFU 作培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的14 日应无养基管内，每个供试品均分别接种硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基各乙醇酸盐流体培养基管一支，同法操作，操作结束后，接种对照菌液为供试品阳性对照。硫乙醇酸盐流体培养基，每管装量不少于严。接种后轻轻振动使均匀。12.7.4、 薄膜过滤法12.4.1 水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。15ml，改良马丁培养基不少于10ml。注入供试液时，切勿向液面直射，以免将空气中的氧带入培养基中，并在火焰旁将塞 子塞油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保
16、持供试品溶液及冲洗 液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗 量一般为100ml，且总冲洗量不得超过 1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。12.7.4、 2 硫乙醇酸盐流体培养基在 3035T培养 14 天，改良马丁培养基在 2328C培养14 天。培养期间应逐日检查是否有菌生长，并填写无菌检查记录。如供试品管出现浑浊 或沉淀，经培养后不能从外观判断时，可取该培养液接种在另一支相同新鲜培养基中，细菌培养 2 天，真菌培养 3 天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片， 染色，镜检，判断是否有菌。12.8 结果判断：阳性对照管应生长
17、良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效：；若供试品管中任何显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明实验结果无效，即生长 的微生（1 ）无菌检查试验所用设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查要求；（2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；（3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或） 无 菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。