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1、分离科学第一章沉淀法1第1页，本讲稿共76页分离科学意分离科学意义 生产实践中成本构成，工艺过程可能就是分离过程。生产实践中成本构成，工艺过程可能就是分离过程。环保尤其是水资源利用环保尤其是水资源利用 基础医学和临床医学基础医学和临床医学 生物分离的重大前沿意义生物分离的重大前沿意义：多种新的分离技术和分离方法。：多种新的分离技术和分离方法。本课程授课倾向：与生产实践相关，次新的分离技术的方法原理和本课程授课倾向：与生产实践相关，次新的分离技术的方法原理和应用。主要分离对象是应用。主要分离对象是生物样品和天然产物。生物样品和天然产物。2第2页，本讲稿共76页沉淀法沉淀法溶剂萃取法溶剂萃取法树脂
2、法树脂法膜分离技术膜分离技术凝胶萃取法凝胶萃取法双水相萃取法双水相萃取法超临界流体萃取法超临界流体萃取法泡沫分离法泡沫分离法中草药有效成分分离示例中草药有效成分分离示例吕家根家根化学楼化学楼1465,14101465,3第3页，本讲稿共76页第一章第一章 沉沉淀淀法法为什么会溶解？什么会溶解？沉沉淀淀法法是是化化学学工工程程中中最最常常用用和和最最简单的的提提取取方方法法，它它是是利利用用加加入入试剂或或改改变条条件件使使产物物或或干干扰物物离离开开溶溶液液，生生成成不不溶溶性性颗粒粒而而沉沉降降析析出出。沉沉淀淀和和结晶晶在在本本质上上同同属属一一种种过程程，都都是是新新相相析析出出的的过程
3、程，主主要要是是物物理理变化化，当当然然也也存存在在有有化化学学反反应的的沉沉淀淀或或结晶晶。沉沉淀淀和和结晶晶的的区区别在在于于形形态的的不不同同，同同类分分子子或或离离子子以以有有规则排排列列形形式式而而析析出出称称结晶晶，同同类分分子子或或离离子子以以无无规则的的紊紊乱乱排排列列形形式式而而析出称析出称为沉淀。沉淀。4第4页，本讲稿共76页沉淀法的沉淀法的优点点为设备简单、成本低、原材料、成本低、原材料易得，便于小批量生易得，便于小批量生产，在，在产物物浓度愈高的溶液度愈高的溶液中沉淀越有利、收率越高；缺点中沉淀越有利、收率越高；缺点为过滤困困难、产品品质量量较低需重新精制。低需重新精制
4、。本章介本章介绍在化学工程中使用的沉淀法主要包在化学工程中使用的沉淀法主要包括括盐析法，有机溶析法，有机溶剂沉淀法，等沉淀法，等电点法以及其它点法以及其它沉淀法。沉淀法。5第5页，本讲稿共76页等电点法等电点法 由由于于试剂费用用低低廉廉，是是一一些些普普通通的的酸酸或或碱碱，以以改改变pHpH值使使分分部部沉沉淀淀成成为一一种种工工业方方法法，同同样是是富富有有吸吸引力的。引力的。等等电点点法法主主要要用用于于一一些些两两性性电解解质的的产物物中中，例例如如抗抗菌菌素素(四四环素素)、氨氨基基酸酸(谷谷氨氨酸酸)以以及及水水化化程程度度不不大大或或憎憎水水性性的的蛋蛋白白质例例如如酪酪蛋蛋白
5、白等等，下下面面我我们以以谷谷氨氨酸酸为例例来来讨论等等电点法的具体点法的具体应用。用。6第6页，本讲稿共76页 谷氨酸的等电点谷氨酸的等电点 谷氨酸分子中合有两个酸性的羧基和一个碱谷氨酸分子中合有两个酸性的羧基和一个碱性的氨基，是一种两性电解质，它在不同性的氨基，是一种两性电解质，它在不同pHpH的溶的溶液中可以至阳离子、两性离子和阴离子等四种不液中可以至阳离子、两性离子和阴离子等四种不同的离子状态而存在，分别以同的离子状态而存在，分别以GAGA、GAGA、GAGA-、GAGA2-2-表示。存在有如下平衡关系。表示。存在有如下平衡关系。由实验测得三个极性基团的表观电离常数及由实验测得三个极性
6、基团的表观电离常数及pKpK值：值：7第7页，本讲稿共76页8第8页，本讲稿共76页不同不同pH时谷氨酸的电离平衡时谷氨酸的电离平衡9第9页，本讲稿共76页从从谷谷氨氨酸酸的的各各级电离离常常数数，用用电子子计算算机机可可以以方方便便求求得得在在不不同同pHpH值下各种离子的分配情况。下各种离子的分配情况。计算公式的算公式的导出，令出，令浓度度单位位为mmoL/mLmmoL/mL整理后得：整理后得：若溶液中谷氨酸的若溶液中谷氨酸的总量量为1mmo11mmo1，即：，即：10第10页，本讲稿共76页合并得：合并得：令：令：则：则：11第11页，本讲稿共76页设H H+浓度度为x x则A A、B
7、B、C C、D D都是都是x x的函数，就可用的函数，就可用电子子计算机算机进行演算，其行演算，其结果描果描绘成下成下图。12第12页，本讲稿共76页从从计计算算机机得得到到的的数数据据或或上上图图，就就能能得得到到任任一一pHpH值值下下离离子子的的分分配配情情况况，例例如如当当pHpH值值3.223.22时时，GAGA：GAGA：GAGA-：GAGA2-2-7.8617.861：84.2484.24，7.8617.861：0.2789100.278910-5-5。若若pHpH达达到到7 7左左右右时时，随随着着-羧羧基基的的电电离离，谷谷氨氨酸酸主主要要以以阴阴离离子子GAGA-存存在在，
8、占占溶溶液液离离子子总总数数的的99.61%99.61%，pHpH值值再再继继续续升升高高，随随着着-谷谷氨氨酸酸电电离离，并并与与溶溶液液中中的的OHOH-中中和和，使使谷谷氨氨酸酸以以另另一一种种阴阴离离子子GAGA2-2-存存在在，在在pHpH值值1313时时，阴阴离离子子GAGA2-2-占占溶溶液液中中离离子子总总数数的的99.9599.95。从从上上可可见见，谷谷氨氨酸酸根根据据溶溶液液pHpH值值的的不不同同，可可以以成成为为带带正正电电荷荷的的阳阳离离子子，也也可可以以成成为为带带负负电电荷荷的的阴阴离离子子。当当介介质质达达到到一一定定的的pHpH值值(3.22)(3.22)时
9、时，谷氨酸呈电中性，此时就称为谷氨酸的等电点。谷氨酸呈电中性，此时就称为谷氨酸的等电点。13第13页，本讲稿共76页在等在等电点点时，谷氨酸分子中氨基和，谷氨酸分子中氨基和羧基相互基相互中和的中和的结果，生成一种内果，生成一种内盐形式的分子，它可以形式的分子，它可以看成看成为羧基基电离离产生的生的H H+与氨基与氨基结合成两性离子合成两性离子(或或偶极离子偶极离子)，因此谷氨酸的等，因此谷氨酸的等电点也就是呈点也就是呈电中性中性时溶溶液的液的pHpH值习惯上以上以pIpI表示。可利用其表示。可利用其总电离平衡常数离平衡常数值求得。求得。14第14页，本讲稿共76页因因为在等在等电点点时，溶液中
10、，溶液中总静静电荷荷为零，所以零，所以GAGA-GAGA+，则上上式可式可简化化为 因因15第15页，本讲稿共76页谷谷氨氨酸酸在在等等电点点时，绝大大部部分分以以偶偶极极离离子子(GA(GA+)状状态存存在在，分分子子内内部部正正负电荷荷相相等等，并并且且有有等等量量的的带不不同同电荷荷的的阳阳离离子子(GA(GA+)和和阴阴离离子子(GA(GA-)，因因此此，溶溶液液的的总静静电荷荷等等于于零零。谷谷氨氨酸酸分分子子之之间由由于于相相互互碰碰撞撞并并通通过静静电引引力力的的作作用用结合合成成较大大的的聚聚合合体体而而沉沉淀淀。所所以以在在等等电点点时表表现有有最最低低溶溶解解度度性性质见表
11、表。工工业生生产中等中等电点法提取谷氨酸，就是利用点法提取谷氨酸，就是利用这一特性。一特性。16第16页，本讲稿共76页A：谷氨酸结晶：谷氨酸结晶L-L-谷谷氨氨酸酸结结晶晶属属于于斜斜方方晶晶系系离离子子晶晶体体，具具有有多多晶晶型型性性质质，在在不不同同的的条条件件下下，可可以以得得到到。型型谷谷氨氨酸酸结结晶晶和和型型谷谷氨氨酸酸结结晶晶。由由x x射射线衍射仪测得空间三方向晶轴如下：线衍射仪测得空间三方向晶轴如下：17第17页，本讲稿共76页由由表表可可知知-型型结结晶晶晶晶轴轴长长短短接接近近，因因此此，晶晶体体粗粗壮壮，呈呈颗颗粒粒状状；而而-型结晶，其晶轴长短悬殊，型结晶，其晶轴
12、长短悬殊，b b方向轴特别长，呈针状或鳞片状。方向轴特别长，呈针状或鳞片状。-型型结结晶晶是是大大型型结结晶晶，在在纯纯谷谷氨氨酸酸溶溶液液个个为为斜斜方方六六面面晶晶体体(观观察察等等电电析析出出的的晶晶体体为为四四面面晶晶体体)。纯纯度度高高、颗颗粒粒大大、质质量量重重、易易沉沉降降、与与母母液液分分离离容容易易，是是一一种种理理想想的的结结晶晶，而而-型型结结晶晶晶晶粒粒细细、纯纯度度低低、质质量量轻轻、难难沉沉降降、不不易易沉沉淀淀析析出出，因因此此在在生生产产中中要要控控制制结结晶晶条条件件，以以析析出出-型型结结晶晶，如如出出现现-型型结结晶晶则则沉沉淀淀物物细细、结结晶不易沉降、
13、分离困难、收率大减。晶不易沉降、分离困难、收率大减。18第18页，本讲稿共76页B B：影响晶型的条件：影响晶型的条件 1 1发发酵酵液液中中谷谷氨氨酸酸浓浓度度对对晶晶型型的的影影响响。由由下下表表所所列列数数字字表表明明，在在室室温温自自然然冷冷却却条条件件下下随随着着谷谷氨氨酸酸含含量量的的升升高高，-型型谷谷氨氨酸酸结结晶晶增增多多，水水分分增增多多，纯纯度度降降低低，分离因难分离因难。19第19页，本讲稿共76页 A A：谷氮酸的含量：谷氮酸的含量 发发酵酵液液中中谷谷氨氨酸酸含含量量在在4 4以以上上时时，等等电电结结晶晶操操作作容容易易，收收率率可可达达6060左左右右，谷谷氨氨
14、酸酸含含量量太太低低，如如1.5-3.5%1.5-3.5%常常温温下下溶溶液液的的过过饱饱和和率小，结晶的生成速度慢、收率低，因此，对产率小，结晶的生成速度慢、收率低，因此，对产酸酸较较低低的的发发酵酵液液为为了了提提高高收收率率，中中和和时时采采取取多多加加高高流流分分(离离子子交交换换柱柱洗洗脱脱下下的的高高流流液液，加加酸酸调调至至1.51.5用用于于等等电电中中和和)，以以增增加加谷谷氨氨酸酸含含量量；同同时时在在晶晶核核形形成成前前投投入入晶晶种种，以以促促进进结结晶晶的的形形成成。此此外外，也也可可在在去去菌菌体体后后7070下下进进行行真真空空浓浓缩缩，然然后后再再等等电电点点提
15、提取，也可采用离子交换柱直接吸附分离，再等电结晶。取，也可采用离子交换柱直接吸附分离，再等电结晶。20第20页，本讲稿共76页由由表表可可知知，析析出出结结晶晶的的温温度度超超过过3030时时，-型型晶晶体体增增加加。因因此此，必必须须把把发发酵酵液液温温度度降降到到3030以以下下，以以避避免形成免形成-型晶体。型晶体。2 2结晶析出温度晶析出温度对晶型的影响。晶型的影响。21第21页，本讲稿共76页vB B：温度的影响：温度的影响v 谷氨酸的溶解度随温度的降低而变小，结晶析出温度对晶体型式谷氨酸的溶解度随温度的降低而变小，结晶析出温度对晶体型式有很大影响。粒状的有很大影响。粒状的型晶体，结
16、晶温度必须降低到型晶体，结晶温度必须降低到3030以下，以下，以避免形成以避免形成型晶体。型晶体。v在等电中和过程中，温度缓慢下降，结晶颗粒粗大。降温过快。在等电中和过程中，温度缓慢下降，结晶颗粒粗大。降温过快。结晶颗粒细小，最后温度越低越好，可以使谷氨酸充分析出。低结晶颗粒细小，最后温度越低越好，可以使谷氨酸充分析出。低温等电点法，终温控制在温等电点法，终温控制在3-53-5，收率可提高到，收率可提高到8080左右。左右。v由于结晶过程是放热反应，温度较难控制，原则上必须避免温度由于结晶过程是放热反应，温度较难控制，原则上必须避免温度回升，温度的逆转会引起回升，温度的逆转会引起 晶型向晶型向
17、晶型的转变，导致收率晶型的转变，导致收率下降，生产上以控制酸的流加速度来确保温度的缓慢下降。下降，生产上以控制酸的流加速度来确保温度的缓慢下降。22第22页，本讲稿共76页C C：加酸速度的影响：加酸速度的影响加加酸酸的的目目的的在在于于使使pHpH降降低低到到谷谷氨氨酸酸的的等等电点点。加加酸酸速速度度的的快快慢慢对晶晶体体的的大大小小影影响响较大大。缓慢慢加加酸酸使使谷谷氨氨酸酸的的溶溶解解度度逐逐渐下下降降，晶晶核核的的形形成成不不会会太太多多大大快快，育育晶晶后后颗粒粒大大易易沉沉降降分分离离，加加酸酸速速度度过快快，容容易易形形成成局局部部过饱和和，晶晶核核形形成成太太快快太太多多，
18、结晶晶颗粒粒小小，不不易易沉沉降降分分离离，影影响响收收率率。操操作作上上一一般般采采用用前前期期加加酸酸稍稍快快，中中期期(晶晶核核形形成成前前)加加酸酸要要缓，后后期期加加酸酸要要慢慢的的原原则，直至，直至pHpH降低至等降低至等电点点为止。止。谷谷氨氨酸酸的的溶溶解解度度在在等等电点点偏偏酸酸时增增加加较慢慢，偏偏碱碱时增增加加较快快，pHpH值以控制在以控制在3.0-3.23.0-3.2为最好，如低于最好，如低于3.03.0提取收率也会降低。提取收率也会降低。23第23页，本讲稿共76页工工厂厂生生产产一一般般用用盐盐酸酸中中和和，如如用用硫硫酸酸易易形形成成型型结结晶晶同同时时对对发
19、发酵酵液液中中的的CaCa2+2+要要进进行行预预处处理理，以以防防止止硫硫酸酸钙钙沉沉淀淀降降低低谷谷氨氨酸酸纯纯度度，等等电电点点-离离子子交交换换法法采采用用高高流流分分调调pHpH，流流加加速速度度一一定定要要慢慢，防防止局部过饱和。止局部过饱和。D D：晶种：晶种 适时投放品种，有利于产品收率的提高。投放晶种的条件要准确，适时投放品种，有利于产品收率的提高。投放晶种的条件要准确，应控制在溶液的介稳区，生产上是根据含量和应控制在溶液的介稳区，生产上是根据含量和PHPH值来决定投种时值来决定投种时间，一般谷氨酸含量为间，一般谷氨酸含量为5 5左右时，在左右时，在pH4.0-4.5pH4.
20、0-4.5投品种；含量为投品种；含量为3.53.5-4.0-4.0时，在时，在pH3.5-4.0pH3.5-4.0投放品种，投种量为发酵液的投放品种，投种量为发酵液的0.20.2-0.3-0.3。晶种要求纯度高、粒度均匀，投放晶种的目的是控制晶。晶种要求纯度高、粒度均匀，投放晶种的目的是控制晶核数量，使晶体颗粒大，容易分离，提高收率。核数量，使晶体颗粒大，容易分离，提高收率。24第24页，本讲稿共76页EE：育晶养晶：育晶养晶在在pH4.5-5.0pH4.5-5.0左左右右，一一般般就就出出现晶晶核核，应停停止止加加酸酸，搅拌拌育育晶晶2 2小小时晶晶不断溶解、在大不断溶解、在大结晶晶颗粒上聚
21、集沉粒上聚集沉积的的过程，可以使程，可以使产品品颗粒粗大。粒粗大。FF：搅拌的影响拌的影响 在不在不搅拌的情况下自然起晶，晶体的大小不均匀。采用拌的情况下自然起晶，晶体的大小不均匀。采用缓慢慢冷却，适当冷却，适当搅拌。可使温度和拌。可使温度和pHpH均匀，有利于晶体均匀，有利于晶体长大，减大，减少少颗垃的互相粘垃的互相粘连使晶体均匀一致，避免晶接的形成。但使晶体均匀一致，避免晶接的形成。但搅拌太快，翻拌太快，翻动激烈，会引起晶体的磨激烈，会引起晶体的磨损，结果晶体果晶体细小；小；太太馒，温度和，温度和pHpH值不均匀，局部晶核不均匀，局部晶核过多，晶体也会多，晶体也会细小，小，搅拌拌转速与速与
22、设备直径和直径和搅拌拌桨叶大小有关，一般以叶大小有关，一般以2020一一3030转分分为宜。生宜。生产上采用上采用桨式式搅拌器，二拌器，二挡交叉安装。交叉安装。25第25页，本讲稿共76页G G：残糖的影响：残糖的影响 发发酵酵液液残残糖糖高高，易易产产生生型型品品体体，因因此此残残糖糖含含量量越越低低越越好好，有有利利于于提提高高等等电电点点结结晶晶的的收收率率。如如残残糖糖太太高高可可适适当当增增加加高高流流分分提提高高溶溶液液中中谷谷氨氨酸酸含含量量，以以扩扩大大谷谷氨氨酸酸与与残残糖糖之之比比值值，有有利利于于晶晶体的形成。体的形成。H H：菌体的影响：菌体的影响粪粪产产碱碱杆杆菌菌发
23、发酵酵液液中中残残存存的的菌菌体体的的大大小小及及数数量量，因因菌菌种种不不同同而而异异。AS1.542AS1.542菌菌发发酵酵后后，菌菌体体大大，数数量量少少，质质量量轻轻，易易于于分分离离；而而AslAsl229229菌菌体体数数量量多多而而且且重重，难难分分离离，故故采采用用等等电电点点提提取取谷谷氨氨酸酸时时，宜宜用用AS1.542AS1.542菌。菌。26第26页，本讲稿共76页I I：染菌的影响：染菌的影响 对对于于染染菌菌和和噬噬菌菌体体感感染染都都会会降降低低纯纯度度和和收收率率，使使操操作作围围难难，所以要防重于治，严格操作、酵液及时处理，保证新鲜不腐败。所以要防重于治，严
24、格操作、酵液及时处理，保证新鲜不腐败。此此外外，发发酵酵液液中中有有L-L-天天冬冬氨氨酸酸、苯苯丙丙氨氨酸酸等等氨氨基基酸酸存存在在时时，能能促促进进型型晶晶体体的的生生成成，钙钙盐盐、镁镁盐盐等等杂杂质质对对谷谷氨氨酸酸结结晶晶也也有有影影响响，CaCa2 2含含量量达达到到0.340.34克克100100毫毫升升时时就就会会影影响响谷谷氨氨酸的结晶析出。酸的结晶析出。27第27页，本讲稿共76页v为什么会有溶解度？什么会有溶解度？v盐析法又称中性析法又称中性盐沉淀法，在溶液中加入中性沉淀法，在溶液中加入中性盐能能破坏蛋白破坏蛋白质或或酶的胶体性的胶体性质，消除微粒上的，消除微粒上的电荷，
25、荷，促使蛋白促使蛋白质或或酶沉淀，此法一般沉淀，此法一般应用于蛋白用于蛋白质分分离和离和酶制制剂工工业的的发酵液提取。酵液提取。v盐析原理析原理v 蛋白蛋白质或或酶溶液是复溶液是复杂的胶体系的胶体系统，由两相，由两相组成：成：液体分散介液体分散介质和固体分散内相和固体分散内相(即分散物即分散物质)，分散，分散内相的内相的颗粒大小粒大小为1-1001-100毫微米（毫微米（纳米）。米）。盐析法盐析法28第28页，本讲稿共76页胶体溶液不是胶体溶液不是稳定的，在一定的条件下，它定的，在一定的条件下，它们的的颗粒能相聚粒能相聚结而沉而沉降。所以首先降。所以首先应对胶体溶液的形成有所了解：胶体溶液的形
26、成有所了解：在蛋白在蛋白质或或酶的的颗粒表面分布着各种粒表面分布着各种亲水基水基团，如，如-NH-NH2 2，-OHOH，这些些亲水基水基团吸聚着吸聚着许多水分子，多水分子，这种作用称种作用称为水合，水分子在水合，水分子在颗粒表面形成一粒表面形成一层水膜水膜(溶溶剂化膜化膜)，由于水膜的存在，由于水膜的存在，颗粒粒间被分隔被分隔开，水膜愈大，胶体溶液愈开，水膜愈大，胶体溶液愈稳定。同定。同时像蛋白像蛋白酶等等酶分子中，含有不分子中，含有不同数目的酸性和碱性氨基酸，其同数目的酸性和碱性氨基酸，其肽链的两端有不同数目的自由的两端有不同数目的自由羧基和基和氨基，氨基，这些基些基团使蛋白使蛋白酶颗粒表
27、面粒表面带有一定的有一定的电荷，因相同荷，因相同电荷的排荷的排斥作用，也使斥作用，也使颗粒彼此分离，所以蛋白粒彼此分离，所以蛋白酶水溶液是一种水溶液是一种稳定的定的亲水胶水胶体溶液，如果在溶液中加入一定量的促淀体溶液，如果在溶液中加入一定量的促淀剂，由于沉淀，由于沉淀剂(NH(NH4 4)2 2S0S04 4的的亲水性比蛋白水性比蛋白质或或酶的的亲水性大，它能与大量的水分子水性大，它能与大量的水分子结合，使水膜合，使水膜退化、消失而脱水，退化、消失而脱水，29第29页，本讲稿共76页同同时由由于于(NH(NH4 4)2 2S0S04 4的的解解离离，中中和和了了蛋蛋白白质或或酶颗粒粒所所带的的
28、电荷荷，颗粒粒间失失去去相相互互的的排排斥斥力力，在在布布朗朗运运动的的互互相相碰碰撞撞下下，蛋蛋白白质或或酶分子分子结合成聚集物而沉淀析出，其机理可用合成聚集物而沉淀析出，其机理可用图：30第30页，本讲稿共76页从从上上述述机机理理可可见见，蛋蛋白白质质或或酶酶的的沉沉淀淀是是由由于于盐盐类类的的加加入入使使其其溶溶解解度度变变化化所所致致，根根据据实实际际的的观观测测，在在浓浓盐盐溶溶液液中中蛋蛋白白质的溶解度和溶液离子强度呈下列关系：质的溶解度和溶液离子强度呈下列关系：蛋白质的lgs 与离子强度 r/2关系图31第31页，本讲稿共76页由由图图可可见见值值为为外外推推值值，为为蛋蛋白白
29、质质在在纯纯水水的的溶溶解解度度对对数数值值，它它取取决决于于蛋蛋白白质质的的种种类类，也也和和溶溶液液的的温温度度及及pHpH值值有有关关，与与盐盐的的种种类类无无关关。而而K K值值主主要要由由蛋蛋白白质质的的性性质质与与盐盐的的种种类类决决定定，而而与与溶溶液液的的pHpH和和温温度度无无关。关。因此用盐析法分离蛋白质时可以有两种步骤：因此用盐析法分离蛋白质时可以有两种步骤：1 1在在一一定定的的pHpH及及温温度度条条件件下下，改改变变盐盐的的浓浓度度(即即离离子子强强度度)达到沉淀的目的，称为达到沉淀的目的，称为“K K”分级盐析法。分级盐析法。2 2在在一一定定的的离离子子强强度度
30、下下，改改变变溶溶液液的的pHpH及及温温度度达达到到沉沉淀淀的的目目的的，称为称为“”分级盐析法。分级盐析法。一般粗提蛋白质时常用第一般粗提蛋白质时常用第l l法，进一步分离、纯化时常应用第法，进一步分离、纯化时常应用第2 2法。法。32第32页，本讲稿共76页影响蛋白影响蛋白质盐析的主要因素：析的主要因素：影影响响蛋蛋白白质盐析析的的主主要要因因素素有有盐析析剂的的种种类和和用用量量，溶溶液液的的温温度度和和pHpH值。此此外外溶溶液液中中各各种种杂质的的种种类和和数数量量，对蛋蛋白白质的的溶溶解解度度都都有有直直接接的的关关系系，这些些关关系系是是相相当当复复杂而而微微妙妙的的，具具体体
31、问题必必须通通过实验加加以以解解决决。下下面面就就一一般般情情况况加加以以介介绍。33第33页，本讲稿共76页AA：盐析析剂的种的种类 可可供供选择的的盐析析剂种种类很很多多，如如MgSOMgSO4 4、(NH(NH4 4)2 2S0S04 4、NaNa2 2S0S04 4、NaHNaH2 2P0P04 4等等，不不同同的的盐其其盐析析效效果果是是各各不不相相同同的的。其其中中效效果果最最好好又又最最常常用用几几种种盐的的盐析析效效果果顺序序如如上上。一一般般来来说，含含有有多多价价阴阴离离子子的的中中性性盐的的盐析析效效果果较好好。但但即即便便是是同同一一种种盐对不不同同品品种种的的酶其其盐
32、析析效效果果也也不不相相同同，具具体体情情况况必必须具具体体分分析析。生生产上上最最多多用用的的盐析析剂是硫酸是硫酸铵，这是因是因为它在它在较低温度低温度时，溶解度也相当高，溶解度也相当高.B B：盐析析剂的用量的用量盐析析剂的用量与所沉淀的的用量与所沉淀的酶的种的种类和和酶液中液中杂质的性的性质、数量有、数量有关，关，应以收率最高的用量以收率最高的用量为标准。具体用量需通准。具体用量需通过对比比试验和生和生产实践摸索才能确定。如目前生践摸索才能确定。如目前生产 34第34页，本讲稿共76页淀淀粉粉酶(BF7658)(BF7658)，盐析析剂硫硫酸酸铵的的用用量量为4040；而而生生产葡葡萄萄
33、糖氧化糖氧化酶、硫酸、硫酸铵的用量需高达的用量需高达7070。由由于于硫硫酸酸铵用用量量大大，且且易易吸吸湿湿结块，不不易易溶溶解解，为了了能能够快快速速溶溶解解，用用前前需需加加以以粉粉碎碎，然然后后边溶溶解解边加加到到酶液液中中，加加盐的的速速度度应尽尽可可能能避避免免盐析析剂积聚聚罐罐底底。搅拌拌能能加加快快盐的的溶溶解解和和加加速速胶胶体体溶溶液液的的破破坏坏，有有利利于于酶的的沉沉降降，但但强烈烈的的搅拌拌会会产生生泡泡沫沫，引引起起酶蛋蛋白白质的的表表面面变性性和和氧氧化化使使酶液液活活力力下下降降，并并且且会会使使沉沉淀淀破破碎碎，形形成成细小小颗粒粒，沉沉降降不不完完全全，进而
34、而增增加加过滤的的困困难，所所以以应该适中。适中。C C：盐析的温度析的温度盐析析时温度的温度的选择要以不降低要以不降低酶的活力的活力为原原则，应在其保持在其保持稳定的温度范定的温度范围内内进行行盐析，但也需适当地析，但也需适当地顾及及盐析效果，可析效果，可以根据以根据实验结果决定，一般果决定，一般规律是温度愈低沉淀的形成愈不容律是温度愈低沉淀的形成愈不容易但也有相反的情况。易但也有相反的情况。实际上可供上可供选择的的 35第35页，本讲稿共76页范范围较大，所以多数是在常温下大，所以多数是在常温下进行行盐析。析。DD：盐析的析的pHpH值 盐析析的的pHpH选择也也要要以以不不降降低低酶的的
35、活活力力为原原则。同同样也也要要通通过试验决决定定，加加盐后后的的酶液液形形成成沉沉淀淀的的pHpH值(等等电点点)与与原原来来酶液液相相比比改改变不不大大。由由于于蛋蛋白白质在在等等电点点时最最易易沉沉淀淀，故故可可选择等等电点点的的pHpH值作作为盐析析的的pHpH值。但但为防防pHpH值对酶活活力力的影响，可通的影响，可通过试验选择在在酶稳定的定的pHpH范范围内内进行行盐析。析。EE：溶液中：溶液中杂质的影响的影响 酶液液中中杂质的的组成成以以及及这些些成成分分对盐衍衍效效果果的的影影响响是是极极为复复杂的的，尤尤其其是是溶溶液液中中所所含含的的各各种种蛋蛋白白质和和其其它它酶对需需要
36、要提提取取的的酶会会相相互互作作用用。盐析析条条件件的的选择应以以最最大大可可能能沉沉淀淀出出需需要要的的酶为原原则，要要通通过试验具具体体选择。此此外外，特特别重重要要的的是是重重金金属属离离子子的的影影响响，重重金金属属的的存存在在会会导致致酶的的大大量量损失失。例例如如，所所用用器器具具产生生铜锈可使可使酶活力大幅度活力大幅度 36第36页，本讲稿共76页降低，根据降低，根据试验，十万分之一的硫酸，十万分之一的硫酸铜会使脂肪会使脂肪酶的活力的活力损失失9090左右。人左右。人为因素因素带来的来的杂质应当尽量避免，当尽量避免，发酵液的酵液的贮放不能太久放不能太久应及及时处理，否理，否则进一
37、步一步发酵和酵和杂菌孳生都菌孳生都会降低会降低酶液的活力。液的活力。37第37页，本讲稿共76页用硫酸铵盐析法生产蛋白酶制剂用硫酸铵盐析法生产蛋白酶制剂 嗜碱性芽孢杆菌分泌 38第38页，本讲稿共76页有机溶有机溶剂沉淀法沉淀法 有有机机溶溶剂沉沉淀淀法法常常应用用于于酶制制剂、氨氨基基酸酸、抗抗生生素素等等发酵酵产物的提取上。下面我物的提取上。下面我们谈酶的有机溶的有机溶剂沉淀法。沉淀法。有机溶有机溶剂沉淀原理沉淀原理 有有机机溶溶剂如如丙丙酮、乙乙醇醇、甲甲醇醇等等使使蛋蛋白白质、酶等等沉沉淀淀，早早期期人人们认为是是由由于于加加入入溶溶剂后后，使使溶溶液液的的介介电常常数数降降低低，因因
38、而而使使蛋蛋白白质或或酶分分子子间静静电引引力力(库仑力力)增增大大。后后来来又又提提出出了了另另一一种种说法法，认为是是由由于于蛋蛋白白质或或酶的的溶溶剂化化，使使原原来来和和蛋蛋白白质或或酶结合合的的水水为溶溶剂所所取取代代因因而而降降低低了了它它们的的溶溶解解度度，但但是是这种理种理论不能不能说明明许多多问题。39第39页，本讲稿共76页 何何以以丙丙酮、乙乙醇醇之之类溶溶剂在在所所谓脱脱去去蛋蛋白白质或或酶水水膜膜的的过程程中中容容易易使使它它们变性性、而而盐析析脱脱水水时不不造造成成它它们的的变性性呢呢?事事实证明明丙丙酮、乙乙醇醇等等有有机机溶溶剂不不仅是是蛋蛋白白质或或酶的的沉沉
39、淀淀剂，更更重重要要的的还是是它它们的的一一种种变性性剂，可可见有有机机溶溶剂使使蛋蛋白白质或或酶沉沉淀淀和和变性性之之间有有区区别又又相相关关联。近近来来对蛋蛋白白质或或酶变性性的的研研究究有有所所发展展，有有可可能能对有有机机溶溶剂沉沉淀淀蛋蛋白白质或或酶的的机机理理作作出出新新的的探探索索，有有机机溶溶剂可可能能破破坏坏蛋蛋白白质或或酶的的某某种种键如如氢键，使使其其空空间结构构发生生某某种种程程度度的的变形形，致致使使一一些些原原来来包包在在内内部部的的疏疏水水基基团暴暴露露于于表表面面并并与与有有机机溶溶剂的的疏疏水水基基团结合合形形成成硫硫水水层，从从而而使使蛋蛋白白质或或酶沉沉淀
40、淀，当当蛋蛋白白质或或配配的的空空间结构构发生生变形形超超过一一定定程程度度就就会会导致致完完全全的的变性性。可可见，必必须把把有有机机溶溶剂使使蛋蛋白白质或或酶沉沉淀淀和和变性之性之间的关系有机地的关系有机地结合起来，才能正确地合起来，才能正确地阐明其机理。明其机理。40第40页，本讲稿共76页有有机机溶溶剂沉沉淀淀法法的的优点点是是某某些些蛋蛋白白质沉沉淀淀的的浓度度范范围相相当当广广，所所得得产品品的的纯度度较高高，从从沉沉淀淀的的蛋蛋白白质或或酶中中除除去去有有机机溶溶剂是是很很方方便便的的，而而且且有有机机溶溶剂本本身身可可部部分分地地作作为它它们的的杀菌菌剂，因因而而使使有有机机溶
41、溶剂法法有有可可能能用用于于大大规模模的的蛋蛋白白质分分级过程程中中。缺缺点点是是需需要要耗耗用用大大量量的的溶溶剂，溶溶剂的的来来源源，库存存都都比比较困困难或或麻麻烦，并并且且提提炼操作需在低温下操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性也比行，使用上有一定的局限性也比盐析法低。析法低。影响沉淀的因素影响沉淀的因素 有有机机溶溶剂沉沉淀淀法法其其影影响响的的因因素素是是多多方方面面的的，如如溶溶剂的的种种类和和用用量量、沉沉淀淀的的温温度度、pHpH值和和时间，溶溶液液中中的的盐类，吸吸附附剂的的性性质和和用用量量等等。不不同同有有机机溶溶剂沉沉淀淀蛋蛋白白质的的效效率率，受受蛋蛋白白质的的
42、种种类、温温度度、pHpH和和杂质等等因因素素所所影影响响，但但大大致致上上以以丙丙酮为最最佳佳，乙乙醇醇次次之之，甲甲醇醇更次，具体要通更次，具体要通过试验加以加以选择。41第41页，本讲稿共76页乙醇是最常用的沉淀乙醇是最常用的沉淀剂在沉淀在沉淀过程中乙醇与水混合程中乙醇与水混合时放出大放出大量的量的稀稀释热，使溶液的温度，使溶液的温度显著升高。著升高。对不耐不耐热的的酶影响影响较大，大，生生产上常用上常用搅拌、少量多次加入的拌、少量多次加入的办法，以避免温度法，以避免温度骤然升然升高高损失失酶活力。有机溶活力。有机溶剂对酶的沉淀能力也受到温度的影响，的沉淀能力也受到温度的影响，一般温度越
43、低沉淀越完全，所以沉淀一般温度越低沉淀越完全，所以沉淀过程必程必须注意冷却降温，注意冷却降温，使沉淀在使沉淀在较低的温度下低的温度下进行。行。用用有有机机溶溶剂沉沉淀淀酶类有有产生生变性性的的可可能能，尤尤其其是是在在还没没有有沉沉淀淀之之前前，这种种可可能能性性更更大大。所所以以在在加加溶溶剂时要要搅拌拌均均匀匀，其其量量不不能能一一下下子子过多多，以以防防局局部部浓度度过高高，引引起起酶的的失失活活，并并且且又又要要在在形形成成沉沉淀淀之之前前，尽尽可可能能快快速速加加完完，以以缩短短溶溶剂与与酶的的接接触触时间，沉沉淀淀完完全全后后，应立立即即压滤和和烘烘干干，尽尽快快除除去去湿湿酶中中
44、的的有有机机溶溶剂。在在沉沉淀淀过程程中中，加加入入一一些些对酶有有保保护作作用用的的盐类，对减减少少酶活活的的损失失，提提高高收收率率十十分分有有利利，并并且且还可可以以使使沉沉淀淀物物凝凝聚聚而而易易于于过滤。所以在所以在酶沉淀前先用适量的磷酸二沉淀前先用适量的磷酸二氢钠 Why?Why?42第42页，本讲稿共76页和氯化钙进行热处理，再用乙醇沉淀，有利于过滤的进行。和氯化钙进行热处理，再用乙醇沉淀，有利于过滤的进行。如如果果在在有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀的的同同时时还还用用吸吸附附的的办办法法，则则要要注注意意吸吸附附剂剂及及其其用用量量和和吸吸附附温温度度的的选选择择：由由于于酶酶的的作
45、作用用，底底物物对对酶酶有有保保护护作作用用，所所以以一一般般采采用用底底物物作作吸吸附附剂剂，不不同同吸吸附附剂剂的的吸吸附附能能力力不不同同，在在用用淀淀粉粉作作吸吸附附剂剂时时，玉玉米米淀淀粉粉的的吸吸附附力力较较大大，应应采采用用增增加加吸吸附附剂剂用用量量和和在在较较低低温温度度下下吸吸附附，则则效效果果较较好好。以以湿湿淀淀粉粉作作吸吸附附剂剂时时、应应先先经经80-l0080-l00加加热热或或加加l0l0硫硫酸酸钠钠于于9898处理，处理，2020分钟后使用。分钟后使用。从从上上可可见见，无无论论是是盐盐析析法法，还还是是有有机机溶溶剂剂法法沉沉淀淀产产物物都都存存在在着着一一
46、定定的的问问题题，所所以以近近年年来来采采用用可可溶溶性性天天然然或或合合成成的的聚聚合合物物和和多多聚聚电电解质来沉淀产物，此法在回收、精制中起着愈来愈大作用。解质来沉淀产物，此法在回收、精制中起着愈来愈大作用。43第43页，本讲稿共76页AA多聚多聚电解解质法法 聚聚乙乙烯亚胺胺、羧甲甲基基纤维素素和和离离子子型型多多糖糖如如肝肝素素等等。如如用用聚聚丙丙烯酸酸可可逆逆沉沉淀淀蛋蛋白白质的的现象象，可可以以作作为分分离离和和精精制制某某些些酶工工业技技术的的基基础(乳乳糖糖酶、溶溶菌菌酶、淀淀粉粉酶等等等等)，这些些沉沉淀淀剂的的作作用用，同同离离子子交交换色色谱一一样，与与蛋蛋白白质上上
47、的的净电荷荷以以及及聚聚电解解质的的大大小小和和电荷荷密密度度有有关关，蛋蛋白白质分分子子的的相相反反电荷荷与与聚聚电解解质结合合，形形成成一一个个多多分分子子络合合物物，当当络合合物物超超过游游离离蛋蛋白白质的的溶溶解解度度极极限限值时，就就发生生沉沉淀。淀。BB水溶性非离子型聚合物法水溶性非离子型聚合物法 用用聚聚乙乙二二醇醇沉沉淀淀酵酵母母的的酶浸浸出出液液研研究究表表明明，离离子子强度度以以及及溶溶液液的的pHpH和和蛋蛋白白质的的浓度度响响应这个个过程程。在在蛋蛋白白质浓度度相相当当低低时发生生分分级，在在蛋蛋白白质浓度高度高时发生通常的沉淀。生通常的沉淀。聚聚电解解质沉淀法沉淀法4
48、4第44页，本讲稿共76页显然使用聚乙二醇比然使用聚乙二醇比盐析要好。析要好。在在工工业规模模上上用用聚聚乙乙二二醇醇分分级已已成成功功地地应用用在在制制取取高高纯度度的的L-L-天天门冬冬酰胺胺酶上收率上收率为83.783.7。除除了了上上述述列列举的的沉沉淀淀蛋蛋白白质的的聚聚合合物物以以外外，还有有其其它它的的带电聚聚合合物物，如如DEAE-DEAE-右右旋旋葡葡糖糖，聚聚乙乙烯胺胺，右右旋旋葡葡糖糖和和精精朊的的硫硫酸酸盐等等。等等。45第45页，本讲稿共76页金属离子沉淀法金属离子沉淀法金属离子的沉淀作用是由子它金属离子的沉淀作用是由子它们能与蛋白能与蛋白质分子中的特殊部位起反分子中
49、的特殊部位起反应造成的。例如造成的。例如锌易与易与组胺酸残基中的咪胺酸残基中的咪唑基基结合，使蛋白合，使蛋白质的等的等电点点转移，从而降低蛋白移，从而降低蛋白质的溶解度。金属离子沉淀蛋白的溶解度。金属离子沉淀蛋白质，一般，一般可分可分为三三类：第一：第一类为能与能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物化合物强烈烈结合的一些金属离子，如合的一些金属离子，如Mn2+Mn2+、Fe2+Fe2+、Co2+Co2+、Ni2+Ni2+、Cu2+Cu2+、Zn2+Zn2+、Cd2+Cd2+；第二；第二类为能与能与羧酸酸结合而不与含氮化合物合而不与含氮化合物结合合的一些金属离子
50、，如的一些金属离子，如Ca2+Ca2+、Ba2+Ba2+、Mg2+Mg2+、Pb2+Pb2+；第三；第三类为与疏基化与疏基化合物合物强烈烈结合的一些金属离子，如合的一些金属离子，如Hg2+Hg2+、Ag+Ag+、Pb2+Pb2+。实际应用用时，金属离子的金属离子的浓度常度常为0.02mol/L0.02mol/L。复合物中金属离子的去除，可用离。复合物中金属离子的去除，可用离子交子交换法或法或EDTAEDTA金属螯合金属螯合剂。46第46页，本讲稿共76页例例子子：四四环环素素类类抗抗生生素素在在碱碱性性条条件件下下能能和和钙钙、镁镁、钡钡等等重重金金属属离离子子或或溴溴代代十十五五烷烷基基吡吡