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1、分离科学第一章沉淀法1第1页，本讲稿共76页分离科学意义分离科学意义 生产实践中成本构成，工艺过程可能就是分离过程。生产实践中成本构成，工艺过程可能就是分离过程。环保尤其是水资源利用环保尤其是水资源利用 基础医学和临床医学基础医学和临床医学 生物分离的重大前沿意义生物分离的重大前沿意义：多种新的分离技术和分离方法。：多种新的分离技术和分离方法。本课程授课倾向：与生产实践相关，次新的分离技术的方法本课程授课倾向：与生产实践相关，次新的分离技术的方法原理和应用。主要分离对象是原理和应用。主要分离对象是生物样品和天然产物。生物样品和天然产物。2第2页，本讲稿共76页沉淀法沉淀法溶剂萃取法溶剂萃取法树
2、脂法树脂法膜分离技术膜分离技术凝胶萃取法凝胶萃取法双水相萃取法双水相萃取法超临界流体萃取法超临界流体萃取法泡沫分离法泡沫分离法中草药有效成分分离示例中草药有效成分分离示例吕家根吕家根化学楼化学楼1465,14101465,3第3页，本讲稿共76页第一章第一章 沉沉 淀淀 法法为什么会溶解？为什么会溶解？沉沉淀淀法法是是化化学学工工程程中中最最常常用用和和最最简简单单的的提提取取方方法法，它它是是利利用用加加入入试试剂剂或或改改变变条条件件使使产产物物或或干干扰扰物物离离开开溶溶液液，生生成成不不溶溶性性颗颗粒粒而而沉沉降降析析出出。沉沉淀淀和和结结晶晶在在本本质质上上同同属属一一种种过过程程，
3、都都是是新新相相析析出出的的过过程程，主主要要是是物物理理变变化化，当当然然也也存存在在有有化化学学反反应应的的沉沉淀淀或或结结晶晶。沉沉淀淀和和结结晶晶的的区区别别在在于于形形态态的的不不同同，同同类类分分子子或或离离子子以以有有规规则则排排列列形形式式而而析析出出称称结结晶晶，同同类类分分子或离子以无规则的紊乱排列形式而析出称为沉淀。子或离子以无规则的紊乱排列形式而析出称为沉淀。4第4页，本讲稿共76页 沉淀法的优点为设备简单、成本低、原材料沉淀法的优点为设备简单、成本低、原材料易得，便于小批量生产，在产物浓度愈高的溶液易得，便于小批量生产，在产物浓度愈高的溶液中沉淀越有利、收率越高；缺点
4、为过滤困难、产中沉淀越有利、收率越高；缺点为过滤困难、产品质量较低需重新精制。品质量较低需重新精制。本章介绍在化学工程中使用的沉淀法主要包本章介绍在化学工程中使用的沉淀法主要包括盐析法，有机溶剂沉淀法，等电点法以及其它括盐析法，有机溶剂沉淀法，等电点法以及其它沉淀法。沉淀法。5第5页，本讲稿共76页等电点法等电点法 由由于于试试剂剂费费用用低低廉廉，是是一一些些普普通通的的酸酸或或碱碱，以以改改变变pHpH值值使使分分部部沉沉淀淀成成为为一一种种工工业业方方法法，同同样样是是富富有有吸吸引力的。引力的。等等电电点点法法主主要要用用于于一一些些两两性性电电解解质质的的产产物物中中，例例如如抗抗菌
5、菌素素(四四环环素素)、氨氨基基酸酸(谷谷氨氨酸酸)以以及及水水化化程程度度不不大大或或憎憎水水性性的的蛋蛋白白质质例例如如酪酪蛋蛋白白等等，下下面面我们以我们以谷氨酸为例谷氨酸为例来讨论等电点法的具体应用。来讨论等电点法的具体应用。6第6页，本讲稿共76页 谷氨酸的等电点谷氨酸的等电点 谷氨酸分子中合有两个酸性的羧基和一个碱谷氨酸分子中合有两个酸性的羧基和一个碱性的氨基，是一种两性电解质，它在不同性的氨基，是一种两性电解质，它在不同pHpH的溶的溶液中可以至阳离子、两性离子和阴离子等四种不液中可以至阳离子、两性离子和阴离子等四种不同的离子状态而存在，分别以同的离子状态而存在，分别以GAGA、
6、GAGA、GAGA-、GAGA2-2-表示。存在有如下平衡关系。表示。存在有如下平衡关系。由实验测得三个极性基团的表观电离常数及由实验测得三个极性基团的表观电离常数及pKpK值：值：7第7页，本讲稿共76页8第8页，本讲稿共76页不同不同pH时谷氨酸的电离平衡时谷氨酸的电离平衡9第9页，本讲稿共76页从从谷谷氨氨酸酸的的各各级级电电离离常常数数，用用电电子子计计算算机机可可以以方方便便求求得得在在不同不同pHpH值下各种离子的分配情况。值下各种离子的分配情况。计算公式的导出，令浓度单位为计算公式的导出，令浓度单位为mmoL/mLmmoL/mL整理后得：整理后得：若溶液中谷氨酸的总量为若溶液中谷
7、氨酸的总量为1mmo11mmo1，即：，即：10第10页，本讲稿共76页合并得：合并得：令：令：则：则：11第11页，本讲稿共76页设设H H+浓度为浓度为x x则则A A、B B、C C、D D都是都是x x的函数，就可用电的函数，就可用电子计算机进行演算，其结果描绘成下图。子计算机进行演算，其结果描绘成下图。12第12页，本讲稿共76页从从计计算算机机得得到到的的数数据据或或上上图图，就就能能得得到到任任一一pHpH值值下下离离子子的的分分配配情情况况，例例如如当当pHpH值值3.223.22时时，GAGA：GAGA：GAGA-：GAGA2-2-7.8617.861：84.2484.24，
8、7.8617.861：0.2789100.278910-5-5。若若pHpH达达到到7 7左左右右时时，随随着着-羧羧基基的的电电离离，谷谷氨氨酸酸主主要要以以阴阴离离子子GAGA-存存在在，占占溶溶液液离离子子总总数数的的99.61%99.61%，pHpH值值再再继继续续升升高高，随随着着-谷谷氨氨酸酸电电离离，并并与与溶溶液液中中的的OHOH-中中和和，使使谷谷氨氨酸酸以以另另一一种种阴阴离离子子GAGA2-2-存存在在，在在pHpH值值1313时时，阴阴离离子子GAGA2-2-占占溶溶液液中中离离子子总总数数的的99.9599.95。从从上上可可见见，谷谷氨氨酸酸根根据据溶溶液液pHpH
9、值值的的不不同同，可可以以成成为为带带正正电电荷荷的的阳阳离离子子，也也可可以以成成为为带带负负电电荷荷的的阴阴离离子子。当当介介质质达达到到一一定定的的pHpH值值(3.22)(3.22)时，谷氨酸呈电中性，此时就称为谷氨酸的等电点。时，谷氨酸呈电中性，此时就称为谷氨酸的等电点。13第13页，本讲稿共76页 在等电点时，谷氨酸分子中氨基和羧基相互在等电点时，谷氨酸分子中氨基和羧基相互中和的结果，生成一种内盐形式的分子，它可以中和的结果，生成一种内盐形式的分子，它可以看成为羧基电离产生的看成为羧基电离产生的H H+与氨基结合成两性离子与氨基结合成两性离子(或或偶极离子偶极离子)，因此谷氨酸的等
10、电点也就是呈电中性时溶，因此谷氨酸的等电点也就是呈电中性时溶液的液的pHpH值习惯上以值习惯上以pIpI表示。可利用其总电离平衡常数表示。可利用其总电离平衡常数值求得。值求得。14第14页，本讲稿共76页因为在等电点时，溶液中总静电荷为零，所以因为在等电点时，溶液中总静电荷为零，所以GAGA-GAGA+，则上式可简化为，则上式可简化为 因因15第15页，本讲稿共76页谷谷氨氨酸酸在在等等电电点点时时，绝绝大大部部分分以以偶偶极极离离子子(GA(GA+)状状态态存存在在，分分子子内内部部正正负负电电荷荷相相等等，并并且且有有等等量量的的带带不不同同电电荷荷的的阳阳离离子子(GA(GA+)和和阴阴
11、离离子子(GA(GA-)，因因此此，溶溶液液的的总总静静电电荷荷等等于于零零。谷谷氨氨酸酸分分子子之之间间由由于于相相互互碰碰撞撞并并通通过过静静电电引引力力的的作作用用结结合合成成较较大大的的聚聚合合体体而而沉沉淀淀。所所以以在在等等电电点点时时表表现现有有最最低低溶溶解解度度性性质质见见表表。工工业业生生产产中中等等电电点点法法提提取取谷氨酸，就是利用这一特性。谷氨酸，就是利用这一特性。16第16页，本讲稿共76页A：谷氨酸结晶：谷氨酸结晶L-L-谷谷氨氨酸酸结结晶晶属属于于斜斜方方晶晶系系离离子子晶晶体体，具具有有多多晶晶型型性性质质，在在不不同同的的条条件件下下，可可以以得得到到。型型
12、谷谷氨氨酸酸结结晶晶和和型型谷谷氨氨酸酸结结晶晶。由由x x射射线线衍衍射仪测得空间三方向晶轴如下：射仪测得空间三方向晶轴如下：17第17页，本讲稿共76页由由表表可可知知-型型结结晶晶晶晶轴轴长长短短接接近近，因因此此，晶晶体体粗粗壮壮，呈呈颗颗粒粒状状；而而-型型结结晶晶，其其晶晶轴轴长长短短悬悬殊殊，b b方方向向轴轴特特别别长长，呈呈针针状或鳞片状。状或鳞片状。-型型结结晶晶是是大大型型结结晶晶，在在纯纯谷谷氨氨酸酸溶溶液液个个为为斜斜方方六六面面晶晶体体(观观察察等等电电析析出出的的晶晶体体为为四四面面晶晶体体)。纯纯度度高高、颗颗粒粒大大、质质量量重重、易易沉沉降降、与与母母液液分
13、分离离容容易易，是是一一种种理理想想的的结结晶晶，而而-型型结结晶晶晶晶粒粒细细、纯纯度度低低、质质量量轻轻、难难沉沉降降、不不易易沉沉淀淀析析出出，因因此此在在生生产产中中要要控控制制结结晶晶条条件件，以以析析出出-型型结结晶晶，如如出出现现-型型结晶则沉淀物细、结晶不易沉降、分离困难、收率大减。结晶则沉淀物细、结晶不易沉降、分离困难、收率大减。18第18页，本讲稿共76页B B：影响晶型的条件：影响晶型的条件 1 1发发酵酵液液中中谷谷氨氨酸酸浓浓度度对对晶晶型型的的影影响响。由由下下表表所所列列数数字字表表明明，在在室室温温自自然然冷冷却却条条件件下下随随着着谷谷氨氨酸酸含含量量的的升升
14、高高，-型谷氨酸结晶增多，水分增多，纯度降低，分离因难型谷氨酸结晶增多，水分增多，纯度降低，分离因难。19第19页，本讲稿共76页 A A：谷氮酸的含量：谷氮酸的含量 发发酵酵液液中中谷谷氨氨酸酸含含量量在在4 4以以上上时时，等等电电结结晶晶操操作作容容易易，收收率率可可达达6060左左右右，谷谷氨氨酸酸含含量量太太低低，如如1.5-3.5%1.5-3.5%常常温温下下溶溶液液的的过过饱饱和和率率小小，结结晶晶的的生成速度慢、收率低，因此，对产生成速度慢、收率低，因此，对产酸酸较较低低的的发发酵酵液液为为了了提提高高收收率率，中中和和时时采采取取多多加加高高流流分分(离离子子交交换换柱柱洗洗
15、脱脱下下的的高高流流液液，加加酸酸调调至至1.51.5用用于于等等电电中中和和)，以以增增加加谷谷氨氨酸酸含含量量；同同时时在在晶晶核核形形成成前前投投入入晶晶种种，以以促促进进结结晶晶的的形形成成。此此外外，也也可可在在去去菌菌体体后后7070下下进进行行真真空空浓浓缩缩，然然后后再再等等电电点点提提取取，也也可可采采用用离离子子交交换换柱柱直接吸附分离，再等电结晶。直接吸附分离，再等电结晶。20第20页，本讲稿共76页由由表表可可知知，析析出出结结晶晶的的温温度度超超过过3030时时，-型型晶晶体体增增加加。因因此此，必必须须把把发发酵酵液液温温度度降降到到3030以以下下，以以避避免免形
16、成形成-型晶体。型晶体。2 2结晶析出温度对晶型的影响。结晶析出温度对晶型的影响。21第21页，本讲稿共76页vB B：温度的影响：温度的影响v 谷氨酸的溶解度随温度的降低而变小，结晶析出温度对晶谷氨酸的溶解度随温度的降低而变小，结晶析出温度对晶体型式有很大影响。粒状的体型式有很大影响。粒状的型晶体，结晶温度必须降低到型晶体，结晶温度必须降低到3030以下，以避免形成以下，以避免形成型晶体。型晶体。v在等电中和过程中，温度缓慢下降，结晶颗粒粗大。降温过快。在等电中和过程中，温度缓慢下降，结晶颗粒粗大。降温过快。结晶颗粒细小，最后温度越低越好，可以使谷氨酸充分析出。低结晶颗粒细小，最后温度越低越
17、好，可以使谷氨酸充分析出。低温等电点法，终温控制在温等电点法，终温控制在3-53-5，收率可提高到，收率可提高到8080左右。左右。v由于结晶过程是放热反应，温度较难控制，原则上必须避免由于结晶过程是放热反应，温度较难控制，原则上必须避免温度回升，温度的逆转会引起温度回升，温度的逆转会引起 晶型向晶型向晶型的转变，导晶型的转变，导致收率下降，生产上以控制酸的流加速度来确保温度的缓致收率下降，生产上以控制酸的流加速度来确保温度的缓慢下降。慢下降。22第22页，本讲稿共76页C C：加酸速度的影响：加酸速度的影响加加酸酸的的目目的的在在于于使使pHpH降降低低到到谷谷氨氨酸酸的的等等电电点点。加加
18、酸酸速速度度的的快快慢慢对对晶晶体体的的大大小小影影响响较较大大。缓缓慢慢加加酸酸使使谷谷氨氨酸酸的的溶溶解解度度逐逐渐渐下下降降，晶晶核核的的形形成成不不会会太太多多大大快快，育育晶晶后后颗颗粒粒大大易易沉沉降降分分离离，加加酸酸速速度度过过快快，容容易易形形成成局局部部过过饱饱和和，晶晶核核形形成成太太快快太太多多，结结晶晶颗颗粒粒小小，不不易易沉沉降降分分离离，影影响响收收率率。操操作作上上一一般般采采用用前前期期加加酸酸稍稍快快，中中期期(晶晶核核形形成成前前)加加酸酸要要缓缓，后期加酸要慢的原则，直至后期加酸要慢的原则，直至pHpH降低至等电点为止。降低至等电点为止。谷谷氨氨酸酸的的
19、溶溶解解度度在在等等电电点点偏偏酸酸时时增增加加较较慢慢，偏偏碱碱时时增增加加较较快快，pHpH值值以以控控制制在在3.0-3.23.0-3.2为为最最好好，如如低低于于3.03.0提提取取收收率率也也会会降低。降低。23第23页，本讲稿共76页工工厂厂生生产产一一般般用用盐盐酸酸中中和和，如如用用硫硫酸酸易易形形成成型型结结晶晶同同时时对对发发酵酵液液中中的的CaCa2+2+要要进进行行预预处处理理，以以防防止止硫硫酸酸钙钙沉沉淀淀降降低低谷谷氨氨酸酸纯纯度度，等等电电点点-离离子子交交换换法法采采用用高高流流分分调调pHpH，流流加加速速度度一一定定要要慢慢，防防止止局局部部过饱和。过饱和
20、。D D：晶种：晶种 适时投放品种，有利于产品收率的提高。投放晶种的条件要准确，适时投放品种，有利于产品收率的提高。投放晶种的条件要准确，应控制在溶液的介稳区，生产上是根据含量和应控制在溶液的介稳区，生产上是根据含量和PHPH值来决定投种时间，值来决定投种时间，一般谷氨酸含量为一般谷氨酸含量为5 5左右时，在左右时，在pH4.0-4.5pH4.0-4.5投品种；含量为投品种；含量为3.53.5-4.04.0时，在时，在pH3.5-4.0pH3.5-4.0投放品种，投种量为发酵液的投放品种，投种量为发酵液的0.20.2-0.3-0.3。晶种要求纯度高、粒度均匀，投放晶种的目的是控制晶核数量，使晶
21、晶种要求纯度高、粒度均匀，投放晶种的目的是控制晶核数量，使晶体颗粒大，容易分离，提高收率。体颗粒大，容易分离，提高收率。24第24页，本讲稿共76页E E：育晶养晶：育晶养晶在在pH4.5-5.0pH4.5-5.0左左右右，一一般般就就出出现现晶晶核核，应应停停止止加加酸酸，搅搅拌拌育育晶晶2 2小小时时晶晶不不断断溶溶解解、在在大大结结晶晶颗颗粒粒上上聚聚集集沉沉积积的的过过程程，可可以以使使产产品颗粒粗大。品颗粒粗大。F F：搅拌的影响：搅拌的影响 在不搅拌的情况下自然起晶，晶体的大小不均匀。采用缓慢冷在不搅拌的情况下自然起晶，晶体的大小不均匀。采用缓慢冷却，适当搅拌。可使温度和却，适当搅
22、拌。可使温度和pHpH均匀，有利于晶体长大，减少颗均匀，有利于晶体长大，减少颗垃的互相粘连使晶体均匀一致，避免晶接的形成。但搅拌太垃的互相粘连使晶体均匀一致，避免晶接的形成。但搅拌太快，翻动激烈，会引起晶体的磨损，结果晶体细小；太馒，温快，翻动激烈，会引起晶体的磨损，结果晶体细小；太馒，温度和度和pHpH值不均匀，局部晶核过多，晶体也会细小，搅拌转速与值不均匀，局部晶核过多，晶体也会细小，搅拌转速与设备直径和搅拌桨叶大小有关，一般以设备直径和搅拌桨叶大小有关，一般以2020一一3030转分为宜。生转分为宜。生产上采用桨式搅拌器，二挡交叉安装。产上采用桨式搅拌器，二挡交叉安装。25第25页，本讲
23、稿共76页G G：残糖的影响：残糖的影响 发发酵酵液液残残糖糖高高，易易产产生生型型品品体体，因因此此残残糖糖含含量量越越低低越越好好，有有利利于于提提高高等等电电点点结结晶晶的的收收率率。如如残残糖糖太太高高可可适适当当增增加加高高流流分分提提高高溶溶液液中中谷谷氨酸含量，以扩大谷氨酸与残糖之比值，有利于氨酸含量，以扩大谷氨酸与残糖之比值，有利于晶体的形成。晶体的形成。H H：菌体的影响：菌体的影响粪粪产产碱碱杆杆菌菌发发酵酵液液中中残残存存的的菌菌体体的的大大小小及及数数量量，因因菌菌种种不不同同而而异异。AS1.542AS1.542菌菌发发酵酵后后，菌菌体体大大，数数量量少少，质质量量轻
24、轻，易易于于分分离离；而而AslAsl229229菌菌体体数数量量多多而而且且重重，难难分分离离，故故采采用用等等电电点点提提取取谷谷氨氨酸酸时时，宜宜用用AS1.542AS1.542菌。菌。26第26页，本讲稿共76页I I：染菌的影响：染菌的影响 对对于于染染菌菌和和噬噬菌菌体体感感染染都都会会降降低低纯纯度度和和收收率率，使使操操作作围围难难，所所以以要要防防重重于于治治，严严格格操操作作、酵酵液液及及时时处处理理，保保证证新新鲜鲜不不腐腐败。败。此此外外，发发酵酵液液中中有有L-L-天天冬冬氨氨酸酸、苯苯丙丙氨氨酸酸等等氨氨基基酸酸存存在在时时，能能促促进进型型晶晶体体的的生生成成，钙
25、钙盐盐、镁镁盐盐等等杂杂质质对对谷谷氨氨酸酸结结晶晶也也有有影影响响，CaCa2 2含含量量达达到到0.340.34克克100100毫毫升升时时就就会会影影响响谷谷氨氨酸酸的的结晶析出。结晶析出。27第27页，本讲稿共76页v为什么会有溶解度？为什么会有溶解度？v盐析法又称中性盐沉淀法，在溶液中加入中性盐能盐析法又称中性盐沉淀法，在溶液中加入中性盐能破坏蛋白质或酶的胶体性质，消除微粒上的电荷，破坏蛋白质或酶的胶体性质，消除微粒上的电荷，促使蛋白质或酶沉淀，此法一般应用于蛋白质分离促使蛋白质或酶沉淀，此法一般应用于蛋白质分离和酶制剂工业的发酵液提取。和酶制剂工业的发酵液提取。v盐析原理盐析原理v
26、 蛋白质或酶溶液是复杂的胶体系统，由两相组成：蛋白质或酶溶液是复杂的胶体系统，由两相组成：液体分散介质和固体分散内相液体分散介质和固体分散内相(即分散物质即分散物质)，分，分散内相的颗粒大小为散内相的颗粒大小为1-1001-100毫微米（纳米）。毫微米（纳米）。盐析法盐析法28第28页，本讲稿共76页胶体溶液不是稳定的，在一定的条件下，它们的颗粒能相聚胶体溶液不是稳定的，在一定的条件下，它们的颗粒能相聚结而沉降。所以首先应对胶体溶液的形成有所了解：结而沉降。所以首先应对胶体溶液的形成有所了解：在蛋白质或酶的颗粒表面分布着各种亲水基团，如在蛋白质或酶的颗粒表面分布着各种亲水基团，如-NH-NH2
27、 2，-OH-OH，这些亲水基团吸聚着许多水分子，这种作用称为水合，这些亲水基团吸聚着许多水分子，这种作用称为水合，水分子在颗粒表面形成一层水膜水分子在颗粒表面形成一层水膜(溶剂化膜溶剂化膜)，由于水膜的存，由于水膜的存在，颗粒间被分隔开，水膜愈大，胶体溶液愈稳定。同时像在，颗粒间被分隔开，水膜愈大，胶体溶液愈稳定。同时像蛋白酶等酶分子中，含有不同数目的酸性和碱性氨基酸，其蛋白酶等酶分子中，含有不同数目的酸性和碱性氨基酸，其肽链的两端有不同数目的自由羧基和氨基，这些基团使蛋白肽链的两端有不同数目的自由羧基和氨基，这些基团使蛋白酶颗粒表面带有一定的电荷，因相同电荷的排斥作用，也使酶颗粒表面带有一
28、定的电荷，因相同电荷的排斥作用，也使颗粒彼此分离，所以蛋白酶水溶液是一种稳定的亲水胶体溶颗粒彼此分离，所以蛋白酶水溶液是一种稳定的亲水胶体溶液，如果在溶液中加入一定量的促淀剂，由于沉淀剂液，如果在溶液中加入一定量的促淀剂，由于沉淀剂(NH(NH4 4)2 2S0S04 4的亲水性比蛋白质或酶的亲水性大，它能与大量的水分的亲水性比蛋白质或酶的亲水性大，它能与大量的水分子结合，使水膜退化、消失而脱水，子结合，使水膜退化、消失而脱水，29第29页，本讲稿共76页同同时时由由于于(NH(NH4 4)2 2S0S04 4的的解解离离，中中和和了了蛋蛋白白质质或或酶酶颗颗粒粒所所带带的的电电荷荷，颗颗粒粒
29、间间失失去去相相互互的的排排斥斥力力，在在布布朗朗运运动动的的互互相相碰碰撞撞下下，蛋蛋白白质质或或酶酶分子结合成聚集物而沉淀析出，其机理可用图：分子结合成聚集物而沉淀析出，其机理可用图：30第30页，本讲稿共76页从从上上述述机机理理可可见见，蛋蛋白白质质或或酶酶的的沉沉淀淀是是由由于于盐盐类类的的加加入入使使其其溶溶解解度度变变化化所所致致，根根据据实实际际的的观观测测，在在浓浓盐盐溶溶液液中中蛋蛋白白质的溶解度和溶液离子强度呈下列关系：质的溶解度和溶液离子强度呈下列关系：蛋白质的lgs 与离子强度 r/2关系图31第31页，本讲稿共76页由由图图可可见见值值为为外外推推值值，为为蛋蛋白白
30、质质在在纯纯水水的的溶溶解解度度对对数数值值，它它取取决决于于蛋蛋白白质质的的种种类类，也也和和溶溶液液的的温温度度及及pHpH值值有有关关，与与盐盐的的种种类类无无关关。而而K K值值主主要要由由蛋蛋白白质质的的性性质质与与盐盐的的种种类类决决定定，而而与与溶溶液的液的pHpH和温度无关。和温度无关。因此用盐析法分离蛋白质时可以有两种步骤：因此用盐析法分离蛋白质时可以有两种步骤：1 1在在一一定定的的pHpH及及温温度度条条件件下下，改改变变盐盐的的浓浓度度(即即离离子子强强度度)达达到到沉沉淀淀的目的，称为的目的，称为“K K”分级盐析法。分级盐析法。2 2在在一一定定的的离离子子强强度度
31、下下，改改变变溶溶液液的的pHpH及及温温度度达达到到沉沉淀淀的的目目的，称为的，称为“”分级盐析法。分级盐析法。一般粗提蛋白质时常用第一般粗提蛋白质时常用第l l法，进一步分离、纯化时常应用第法，进一步分离、纯化时常应用第2 2法。法。32第32页，本讲稿共76页影响蛋白质盐析的主要因素：影响蛋白质盐析的主要因素：影影响响蛋蛋白白质质盐盐析析的的主主要要因因素素有有盐盐析析剂剂的的种种类类和和用用量量，溶溶液液的的温温度度和和pHpH值值。此此外外溶溶液液中中各各种种杂杂质质的的种种类类和和数数量量，对对蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度都都有有直直接接的的关关系系，这这些些关关系系是是相相当当复
32、复杂杂而而微微妙妙的的，具具体问题必须通过实验加以解决。下面就一般情况加以介绍。体问题必须通过实验加以解决。下面就一般情况加以介绍。33第33页，本讲稿共76页 A A：盐析剂的种类：盐析剂的种类 可可供供选选择择的的盐盐析析剂剂种种类类很很多多，如如MgSOMgSO4 4、(NH(NH4 4)2 2S0S04 4、NaNa2 2S0S04 4、NaHNaH2 2P0P04 4等等，不不同同的的盐盐其其盐盐析析效效果果是是各各不不相相同同的的。其其中中效效果果最最好好又又最最常常用用几几种种盐盐的的盐盐析析效效果果顺顺序序如如上上。一一般般来来说说，含含有有多多价价阴阴离离子子的的中中性性盐盐
33、的的盐盐析析效效果果较较好好。但但即即便便是是同同一一种种盐盐对对不不同同品品种种的的酶酶其其盐盐析析效效果果也也不不相相同同，具具体体情情况况必必须须具具体体分分析析。生生产产上上最最多多用用的的盐盐析析剂剂是是硫酸铵，这是因为它在较低温度时，溶解度也相当高硫酸铵，这是因为它在较低温度时，溶解度也相当高.B B：盐析剂的用量：盐析剂的用量 盐析剂的用量与所沉淀的酶的种类和酶液中杂质的性质、盐析剂的用量与所沉淀的酶的种类和酶液中杂质的性质、数量有关，应以收率最高的用量为标准。具体用量需通过对数量有关，应以收率最高的用量为标准。具体用量需通过对比试验和生产实践摸索才能确定。如目前生产比试验和生产
34、实践摸索才能确定。如目前生产 34第34页，本讲稿共76页淀淀粉粉酶酶(BF7658)(BF7658)，盐盐析析剂剂硫硫酸酸铵铵的的用用量量为为4040；而而生生产产葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶、硫酸铵的用量需高达硫酸铵的用量需高达7070。由由于于硫硫酸酸铵铵用用量量大大，且且易易吸吸湿湿结结块块，不不易易溶溶解解，为为了了能能够够快快速速溶溶解解，用用前前需需加加以以粉粉碎碎，然然后后边边溶溶解解边边加加到到酶酶液液中中，加加盐盐的的速速度度应应尽尽可可能能避避免免盐盐析析剂剂积积聚聚罐罐底底。搅搅拌拌能能加加快快盐盐的的溶溶解解和和加加速速胶胶体体溶溶液液的的破破坏坏，有有利利于于酶酶的的沉
35、沉降降，但但强强烈烈的的搅搅拌拌会会产产生生泡泡沫沫，引引起起酶酶蛋蛋白白质质的的表表面面变变性性和和氧氧化化使使酶酶液液活活力力下下降降，并并且且会会使使沉沉淀淀破破碎碎，形形成成细细小小颗颗粒粒，沉沉降降不不完完全全，进进而而增增加加过过滤滤的困难，所以应该适中。的困难，所以应该适中。C C：盐析的温度：盐析的温度 盐析时温度的选择要以不降低酶的活力为原则，应在其保持稳盐析时温度的选择要以不降低酶的活力为原则，应在其保持稳定的温度范围内进行盐析，但也需适当地顾及盐析效果，可以根定的温度范围内进行盐析，但也需适当地顾及盐析效果，可以根据实验结果决定，一般规律是温度愈低沉淀的形成愈不容易但据实
36、验结果决定，一般规律是温度愈低沉淀的形成愈不容易但也有相反的情况。实际上可供选择的也有相反的情况。实际上可供选择的 35第35页，本讲稿共76页范围较大，所以多数是在常温下进行盐析。范围较大，所以多数是在常温下进行盐析。D D：盐析的：盐析的pHpH值值 盐盐析析的的pHpH选选择择也也要要以以不不降降低低酶酶的的活活力力为为原原则则。同同样样也也要要通通过过试试验验决决定定，加加盐盐后后的的酶酶液液形形成成沉沉淀淀的的pHpH值值(等等电电点点)与与原原来来酶酶液液相相比比改改变变不不大大。由由于于蛋蛋白白质质在在等等电电点点时时最最易易沉沉淀淀，故故可可选选择择等等电电点点的的pHpH值值
37、作作为为盐盐析析的的pHpH值值。但但为为防防pHpH值值对对酶酶活活力力的的影影响响，可可通通过过试试验选择在酶稳定的验选择在酶稳定的pHpH范围内进行盐析。范围内进行盐析。E E：溶液中杂质的影响：溶液中杂质的影响 酶酶液液中中杂杂质质的的组组成成以以及及这这些些成成分分对对盐盐衍衍效效果果的的影影响响是是极极为为复复杂杂的的，尤尤其其是是溶溶液液中中所所含含的的各各种种蛋蛋白白质质和和其其它它酶酶对对需需要要提提取取的的酶酶会会相相互互作作用用。盐盐析析条条件件的的选选择择应应以以最最大大可可能能沉沉淀淀出出需需要要的的酶酶为为原原则则，要要通通过过试试验验具具体体选选择择。此此外外，特
38、特别别重重要要的的是是重重金金属属离离子子的的影影响响，重重金金属属的的存存在在会会导导致致酶酶的的大大量量损损失失。例例如，所用器具产生铜锈可使酶活力大幅度如，所用器具产生铜锈可使酶活力大幅度 36第36页，本讲稿共76页降低，根据试验，十万分之一的硫酸铜会使脂肪酶的活力损失降低，根据试验，十万分之一的硫酸铜会使脂肪酶的活力损失9090左右。人为因素带来的杂质应当尽量避免，发酵液的贮放不能太久左右。人为因素带来的杂质应当尽量避免，发酵液的贮放不能太久应及时处理，否则进一步发酵和杂菌孳生都会降低酶液的活力。应及时处理，否则进一步发酵和杂菌孳生都会降低酶液的活力。37第37页，本讲稿共76页用硫
39、酸铵盐析法生产蛋白酶制剂用硫酸铵盐析法生产蛋白酶制剂 嗜碱性芽孢杆菌分泌 38第38页，本讲稿共76页有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀法法常常应应用用于于酶酶制制剂剂、氨氨基基酸酸、抗抗生生素素等等发发酵产物的提取上。下面我们谈酶的有机溶剂沉淀法。酵产物的提取上。下面我们谈酶的有机溶剂沉淀法。有机溶剂沉淀原理有机溶剂沉淀原理 有有机机溶溶剂剂如如丙丙酮酮、乙乙醇醇、甲甲醇醇等等使使蛋蛋白白质质、酶酶等等沉沉淀淀，早早期期人人们们认认为为是是由由于于加加入入溶溶剂剂后后，使使溶溶液液的的介介电电常常数数降降低低，因因而而使使蛋蛋白白质质或或酶酶分分子子间间静静电电引引力力(
40、库库仑仑力力)增增大大。后后来来又又提提出出了了另另一一种种说说法法，认认为为是是由由于于蛋蛋白白质质或或酶酶的的溶溶剂剂化化，使使原原来来和和蛋蛋白白质质或或酶酶结结合合的的水水为为溶溶剂剂所所取取代代因因而而降降低低了了它它们们的的溶溶解解度度，但但是是这种理论不能说明许多问题。这种理论不能说明许多问题。39第39页，本讲稿共76页 何何以以丙丙酮酮、乙乙醇醇之之类类溶溶剂剂在在所所谓谓脱脱去去蛋蛋白白质质或或酶酶水水膜膜的的过过程程中中容容易易使使它它们们变变性性、而而盐盐析析脱脱水水时时不不造造成成它它们们的的变变性性呢呢?事事实实证证明明丙丙酮酮、乙乙醇醇等等有有机机溶溶剂剂不不仅仅
41、是是蛋蛋白白质质或或酶酶的的沉沉淀淀剂剂，更更重重要要的的还还是是它它们们的的一一种种变变性性剂剂，可可见见有有机机溶溶剂剂使使蛋蛋白白质质或或酶酶沉沉淀和变性之间有区别又相关联。淀和变性之间有区别又相关联。近近来来对对蛋蛋白白质质或或酶酶变变性性的的研研究究有有所所发发展展，有有可可能能对对有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀蛋蛋白白质质或或酶酶的的机机理理作作出出新新的的探探索索，有有机机溶溶剂剂可可能能破破坏坏蛋蛋白白质质或或酶酶的的某某种种键键如如氢氢键键，使使其其空空间间结结构构发发生生某某种种程程度度的的变变形形，致致使使一一些些原原来来包包在在内内部部的的疏疏水水基基团团暴暴露露于于表表面面
42、并并与与有有机机溶溶剂剂的的疏疏水水基基团团结结合合形形成成硫硫水水层层，从从而而使使蛋蛋白白质质或或酶酶沉沉淀淀，当当蛋蛋白白质质或或配配的的空空间间结结构构发发生生变变形形超超过过一一定定程程度度就就会会导导致致完完全全的的变变性性。可可见见，必必须须把把有有机机溶溶剂剂使使蛋蛋白白质质或或酶酶沉沉淀淀和和变性之间的关系有机地结合起来，才能正确地阐明其机理。变性之间的关系有机地结合起来，才能正确地阐明其机理。40第40页，本讲稿共76页有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀法法的的优优点点是是某某些些蛋蛋白白质质沉沉淀淀的的浓浓度度范范围围相相当当广广，所所得得产产品品的的纯纯度度较较高高，从从沉沉淀淀
43、的的蛋蛋白白质质或或酶酶中中除除去去有有机机溶溶剂剂是是很很方方便便的的，而而且且有有机机溶溶剂剂本本身身可可部部分分地地作作为为它它们们的的杀杀菌菌剂剂，因因而而使使有有机机溶溶剂剂法法有有可可能能用用于于大大规规模模的的蛋蛋白白质质分分级级过过程程中中。缺缺点点是是需需要要耗耗用用大大量量的的溶溶剂剂，溶溶剂剂的的来来源源，库库存存都都比比较较困困难难或或麻麻烦烦，并并且且提提炼炼操操作作需需在在低低温温下下进进行，使用上有一定的局限性也比盐析法低。行，使用上有一定的局限性也比盐析法低。影响沉淀的因素影响沉淀的因素 有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀法法其其影影响响的的因因素素是是多多方方面面的的，
44、如如溶溶剂剂的的种种类类和和用用量量、沉沉淀淀的的温温度度、pHpH值值和和时时间间，溶溶液液中中的的盐盐类类，吸吸附附剂剂的的性性质质和和用用量量等等。不不同同有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀蛋蛋白白质质的的效效率率，受受蛋蛋白白质质的的种种类类、温温度度、pHpH和和杂杂质质等等因因素素所所影影响响，但但大大致致上上以以丙丙酮酮为为最最佳佳，乙醇次之，甲醇更次，具体要通过试验加以选择。乙醇次之，甲醇更次，具体要通过试验加以选择。41第41页，本讲稿共76页 乙醇是最常用的沉淀剂在沉淀过程中乙醇与水混合时放出乙醇是最常用的沉淀剂在沉淀过程中乙醇与水混合时放出大量的大量的稀释热稀释热，使溶液的温度显著
45、升高。对不耐热的酶影响较大，生，使溶液的温度显著升高。对不耐热的酶影响较大，生产上常用搅拌、少量多次加入的办法，以避免温度骤然升高损失酶活产上常用搅拌、少量多次加入的办法，以避免温度骤然升高损失酶活力。有机溶剂对酶的沉淀能力也受到温度的影响，一般温度越低沉淀力。有机溶剂对酶的沉淀能力也受到温度的影响，一般温度越低沉淀越完全，所以沉淀过程必须注意冷却降温，使沉淀在较低的温度下进越完全，所以沉淀过程必须注意冷却降温，使沉淀在较低的温度下进行。行。用用有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀酶酶类类有有产产生生变变性性的的可可能能，尤尤其其是是在在还还没没有有沉沉淀淀之之前前，这这种种可可能能性性更更大大。所所以以
46、在在加加溶溶剂剂时时要要搅搅拌拌均均匀匀，其其量量不不能能一一下下子子过过多多，以以防防局局部部浓浓度度过过高高，引引起起酶酶的的失失活活，并并且且又又要要在在形形成成沉沉淀淀之之前前，尽尽可可能能快快速速加加完完，以以缩缩短短溶溶剂剂与与酶酶的的接接触触时时间间，沉沉淀淀完完全全后后，应应立立即即压压滤滤和和烘烘干干，尽尽快快除除去去湿湿酶酶中中的的有有机机溶溶剂。剂。在在沉沉淀淀过过程程中中，加加入入一一些些对对酶酶有有保保护护作作用用的的盐盐类类，对对减减少少酶酶活活的的损损失失，提提高高收收率率十十分分有有利利，并并且且还还可可以以使使沉沉淀淀物物凝凝聚聚而而易易于于过滤。所以在酶沉淀
47、前先用适量的磷酸二氢钠过滤。所以在酶沉淀前先用适量的磷酸二氢钠 Why?Why?42第42页，本讲稿共76页和氯化钙进行热处理，再用乙醇沉淀，有利于过滤的进行。和氯化钙进行热处理，再用乙醇沉淀，有利于过滤的进行。如如果果在在有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀的的同同时时还还用用吸吸附附的的办办法法，则则要要注注意意吸吸附附剂剂及及其其用用量量和和吸吸附附温温度度的的选选择择：由由于于酶酶的的作作用用，底底物物对对酶酶有有保保护护作作用用，所所以以一一般般采采用用底底物物作作吸吸附附剂剂，不不同同吸吸附附剂剂的的吸吸附附能能力力不不同同，在在用用淀淀粉粉作作吸吸附附剂剂时时，玉玉米米淀淀粉粉的的吸吸附附力
48、力较较大大，应应采采用用增增加加吸吸附附剂剂用用量量和和在在较较低低温温度度下下吸吸附附，则则效效果果较较好好。以以湿湿淀淀粉粉作作吸吸附附剂剂时时、应应先先经经80-l0080-l00加加热热或或加加l0l0硫硫酸酸钠钠于于9898处理，处理，2020分钟后使用。分钟后使用。从从上上可可见见，无无论论是是盐盐析析法法，还还是是有有机机溶溶剂剂法法沉沉淀淀产产物物都都存存在在着着一一定定的的问问题题，所所以以近近年年来来采采用用可可溶溶性性天天然然或或合合成成的的聚聚合合物物和和多多聚聚电电解解质质来来沉沉淀淀产产物物，此此法法在在回回收收、精精制制中中起起着着愈愈来愈大作用。来愈大作用。43
49、第43页，本讲稿共76页A A 多聚电解质法多聚电解质法 聚聚乙乙烯烯亚亚胺胺、羧羧甲甲基基纤纤维维素素和和离离子子型型多多糖糖如如肝肝素素等等。如如用用聚聚丙丙烯烯酸酸可可逆逆沉沉淀淀蛋蛋白白质质的的现现象象，可可以以作作为为分分离离和和精精制制某某些些酶酶工工业业技技术术的的基基础础(乳乳糖糖酶酶、溶溶菌菌酶酶、淀淀粉粉酶酶等等等等)，这这些些沉沉淀淀剂剂的的作作用用，同同离离子子交交换换色色谱谱一一样样，与与蛋蛋白白质质上上的的净净电电荷荷以以及及聚聚电电解解质质的的大大小小和和电电荷荷密密度度有有关关，蛋蛋白白质质分分子子的的相相反反电电荷荷与与聚聚电电解解质质结结合合，形形成成一一个
50、个多多分分子子络络合合物物，当当络络合合物物超超过过游游离离蛋蛋白白质质的的溶解度极限值时，就发生沉淀。溶解度极限值时，就发生沉淀。B B 水溶性非离子型聚合物法水溶性非离子型聚合物法 用用聚聚乙乙二二醇醇沉沉淀淀酵酵母母的的酶酶浸浸出出液液研研究究表表明明，离离子子强强度度以以及及溶溶液液的的pHpH和和蛋蛋白白质质的的浓浓度度响响应应这这个个过过程程。在在蛋蛋白白质质浓浓度度相相当当低低时时发发生生分分级，在蛋白质浓度高时发生通常的沉淀。级，在蛋白质浓度高时发生通常的沉淀。聚电解质沉淀法聚电解质沉淀法44第44页，本讲稿共76页显然使用聚乙二醇比盐析要好。显然使用聚乙二醇比盐析要好。在在工