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1、核酸分子杂交你现在浏览的是第一页，共52页一、概念：一、概念：1 1、分子杂交、分子杂交（hybridization):有一定同源性的两条核酸有一定同源性的两条核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱基互单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱基互补退火形成稳定的双链分子的过程补退火形成稳定的双链分子的过程。2、印迹印迹（bloting）：将：将DNADNA、RNARNA或蛋白质固定到固体支或蛋白质固定到固体支持物上的过程。持物上的过程。3、探针（、探针（probe）：核酸探针是指用放射性核素、生物素或）：核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生
2、特异性互补的其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知已知DNA或或RNA片段。片段。你现在浏览的是第二页，共52页4、种类：、种类：固相杂交（固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的）是将变性的DNA固固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。液相杂交（液相杂交（solution hbridization）指使变性的待测核酸）指使变性的待测核酸单链与已知的核酸单链（探针）在溶液中保温，使之形单链与已知的核酸单链（探针）在溶
3、液中保温，使之形成杂交复合物。成杂交复合物。DNA与与DNA杂交杂交DNA与与RNA杂交杂交RNA与与RNA杂交杂交你现在浏览的是第三页，共52页5、几种常见的杂交：、几种常见的杂交：分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的经显影后显示出目的DNA或或RNA分子所处的位置。根据被分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：(1)Southern杂交：杂交：DNA片段经电
4、泳分离后，从凝胶片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为被检对象为DNA，探针为，探针为DNA或或RNA。(2)Northern杂交：杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中转移片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。被检对到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。被检对象为象为RNA,探针为探针为DNA或或RNA。你现在浏览的是第四页，共52页二、二、Southern杂交杂交1、步骤：、步骤：Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的杂交可用来检测经限制性内切酶切
5、割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下列步片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下列步骤骤:(1)酶切酶切DNA,凝胶电泳分离各酶切片段凝胶电泳分离各酶切片段,然后使然后使DNA原位变性。原位变性。(2)将将DNA片段转移到固体支持物片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或硝酸纤维素滤膜或尼龙膜尼龙膜)上。上。(3)预杂交滤膜预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。掩盖滤膜上非特异性位点。(4)让探针与同源让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。异性结合的探针。(5)通过显影检查目的通过显影检查目的DNA所在的位置。所在的位置。你现在浏览的
6、是第五页，共52页Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素，包括目的杂交能否检出杂交信号取决于很多因素，包括目的DNA在总在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的到滤膜上的DNA量以及探针与目的量以及探针与目的DNA间的配对情况等。在间的配对情况等。在最佳条件下，放射自显影曝光数天后最佳条件下，放射自显影曝光数天后,Southern杂交能很灵杂交能很灵敏地检测出低于敏地检测出低于0.1pg与与32 P标记的高比活性探针的标记的高比活性探针的(109 cpm/g)互补互补DNA。如果将。如果将10g基因组基因组DNA转移到滤膜上，
7、并转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交，曝光过夜，则可检测出哺与长度为几百个核苷酸的探针杂交，曝光过夜，则可检测出哺乳动物基因组中乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。大小的单拷贝序列。你现在浏览的是第六页，共52页2、固体支持物的种类：、固体支持物的种类：带正电荷的尼龙膜、硝酸纤维膜、带正电荷的尼龙膜、硝酸纤维膜、PVDF膜膜 尼龙膜尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。膜介于二者之间。尼龙膜结合尼龙膜结
8、合DNA和和RNA能力可达能力可达480600g/cm2，可，可结合短至结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和和RNA能力可达能力可达80100g/cm2，对于，对于200bp的核酸片段结合不的核酸片段结合不强；强；PVDF膜结合膜结合DNA和和RNA能力可达能力可达125300g/cm2。你现在浏览的是第七页，共52页 尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；，结合
9、不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。蛋白印迹。就韧性而言：就韧性而言：尼龙膜尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；碎；PVDF膜较强。膜较强。就重复性而言：就重复性而言：尼龙膜尼龙膜可反复用于可反复用于分子杂交分子杂交，杂交后，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；使用；PVDF膜可以重复使用。膜可以重复使用。你现在浏览的是第八页，共52页3、转膜的方式：、转膜的方式：将将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有从凝胶中转移到固体支持物上
10、的方法主要有3种种:(1)毛细管转移。本方法由毛细管转移。本方法由Southern发明，故又称为发明，故又称为Southern转移转移(或印迹或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单。毛细管转移方法的优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较转移后杂交信号较弱。弱。(2)电泳转移。将电泳转移。将DNA变性后变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用，可直接转移较水解作用，可直接转移较大的大的DNA片段。缺点是转移中电流较大，温度难以控制。片段。缺点是转移中
11、电流较大，温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时，才采用电泳转通常只有当毛细管转移和真空转移无效时，才采用电泳转移。移。你现在浏览的是第九页，共52页(3)真空转移。有多种真空转移的商品化仪器真空转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是将硝它们一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上，再将酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上，再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的一个贮液槽中流下，凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的一个贮液槽中流下，洗脱出凝胶中的洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速，使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速，在在30分钟内就能从正常厚度分
12、钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度和正常琼脂糖浓度(1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比比Southern转移强转移强2-3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂，倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂，并且在洗膜不严格时，其背景比毛细转移要高。并且在洗膜不严格时，其背景比毛细转移要高。你现在浏览的是第十页，共52页你现在浏览的是第十一页，共52页你现在浏览的是第十二页，共52页你现在浏览的是第十三页，共52页4、毛细管转移法转膜用的溶液：、毛细管转移法转膜用的溶液：（1）高盐溶液：）高盐溶液：1.5M NaCl（2）0.4N Na
13、OH如果如果DNA分子大，可以用分子大，可以用0.25N HCL处理或用紫外线处理，处理或用紫外线处理，将将DNA分子适当打断，以提高转移的效果，注意处理的时间适分子适当打断，以提高转移的效果，注意处理的时间适度！度！你现在浏览的是第十四页，共52页5、转膜后、转膜后DNA的固定方式：的固定方式：转膜后，膜用转膜后，膜用2SSC漂洗，然后固定：漂洗，然后固定：（1）80干烤干烤0.5-2小时；小时；（2）254nm波长的紫外线照射尼龙膜带波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。的一面。后一种方法较为繁琐后一种方法较为繁琐,但却优先使用但却优先使用,因为某些批号的带正电因为某些批号的带正电荷的尼龙
14、膜经此处理后荷的尼龙膜经此处理后,杂交信号可以增强。然而为获得最佳杂交信号可以增强。然而为获得最佳效果效果,务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可促进务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可促进DNA上上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构,而过而过度照射却使度照射却使DNA上一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面上一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。导致杂交信号减弱。你现在浏览的是第十五页，共52页三、三、Northern杂交杂交 Northern杂交与杂交与Southern杂交很相似。主要区别是杂交很相似。主要区别是被
15、检测对象为被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行其电泳在变性条件下进行,以去除以去除RNA中的二级结构中的二级结构,保证保证RNA完全按分子大小分离。变性完全按分子大小分离。变性电泳主要有电泳主要有2种种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳。电泳后乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳。电泳后的琼脂糖凝胶用与的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将转移相同的方法将RNA转移到转移到硝酸纤维素滤膜上硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。然后与探针杂交。注意：注意：（1）RNA对碱性敏感，不能用对碱性敏感，不能用NaOH溶液作为转膜夜。如溶液作为转膜夜。如果琼脂糖浓度高于果琼脂糖浓度高于1%，或凝胶厚度大
16、于，或凝胶厚度大于0.5cm，或待分，或待分析的析的RNA大于大于2.5kb,需用需用0.05mol/L NaOH浸泡凝胶浸泡凝胶20分钟分钟,部分水解部分水解RNA并提高转移效率。浸泡后用经并提高转移效率。浸泡后用经DEPC处理的处理的水淋洗凝胶水淋洗凝胶,并用并用20SSC浸泡凝胶浸泡凝胶45分钟。然后再转移到分钟。然后再转移到滤膜上。滤膜上。你现在浏览的是第十六页，共52页（2）含甲醛的凝胶在）含甲醛的凝胶在RNA转移前需用经转移前需用经DEPC处理的处理的水淋洗数次水淋洗数次,以除去甲醛。以除去甲醛。（3）尼龙膜的不足之处是背景较高）尼龙膜的不足之处是背景较高,用用RNA探针时尤为探针
17、时尤为严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液中严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液中,会导致会导致杂交背景明显升高杂交背景明显升高,可通过提高预杂交和杂交步骤中有关可通过提高预杂交和杂交步骤中有关阻断试剂的量来予以解决。阻断试剂的量来予以解决。你现在浏览的是第十七页，共52页四、菌落原位杂交四、菌落原位杂交对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张尼龙膜上。经培养
18、一段时间后，对菌落进行原位一张尼龙膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于裂解。主平板应贮存于4直至得到筛选结果。直至得到筛选结果。你现在浏览的是第十八页，共52页五、斑点杂交五、斑点杂交 斑点杂交是指将斑点杂交是指将DNA或或RNA样品直接点在硝酸纤样品直接点在硝酸纤维素滤膜上维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的是否存在特异的DNA或或RNA。同一种样品经不同倍数的。同一种样品经不同倍数的稀释稀释,还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、经济的分析经济的分析
19、DNA或或RNA的方法的方法,在基因分析和基因诊断中在基因分析和基因诊断中经常用到经常用到,是研究基因表达的有力工具。但由于目的序是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离列未与非目的序列分离,不能了解目的序列的长度。尤其不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时当本底干扰较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。难以区分目的序列信号和干扰信号。你现在浏览的是第十九页，共52页六、影响杂交的因素六、影响杂交的因素 1、温度、温度 杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温度。若反应温度低于度。若反应温度低于Tm 1015，碱基顺
20、序高度同源的，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在如两个同源性在50%左右或更低些的左右或更低些的DNA，调整杂交温，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。首先确定杂交温度。你现在浏览的是第二十页，共52页 通常有三种温度可供试验，即
21、最适复性温度、苛刻复通常有三种温度可供试验，即最适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。温度的选择及温度对杂交的性温度及非苛刻复性温度。温度的选择及温度对杂交的影响见下表。最适复性温度（影响见下表。最适复性温度（Optimunm renaturation temperature,TOR）：）：Tor=Tm 25苛刻复性温度：苛刻复性温度：Ts=Tm (10或或15)非苛刻复性温度：非苛刻复性温度：Tns=Tm (30或或35)在在2SSC反应液中，可以根据下列公式计算最适复性温度：反应液中，可以根据下列公式计算最适复性温度：TOr=0.51(G+C%)+47。你现在浏览的是第二十一页，共52
22、页DNAG+C%杂交反应温度（杂交反应温度（）TorTsTns3062.3 73.352.33564.9 74.954.94067.4 77.457.44570.0 80.060.05072.5 82.562.55575.1 85.165.1DNADNA杂交温度的选择范围（杂交温度的选择范围（2SSC）你现在浏览的是第二十二页，共52页如果综合考虑：如果综合考虑：Effective Tm81.5+16.6(logMNa+)+0.41(%G+C)0.72(%formamide)根据所用的杂交溶液确定杂交的温度：一般来说，杂交相根据所用的杂交溶液确定杂交的温度：一般来说，杂交相为水溶液时为水溶液时
23、,则在则在65杂交，而在杂交，而在50%甲酰胺溶液中时甲酰胺溶液中时,则在则在42下杂交。下杂交。2、离子强度离子强度离子强度增加离子强度增加，Tm值增加值增加，一般用一般用0.9-0.75 mol/L 的的NaCl3、DNA的浓度的浓度最低检测水平为单拷贝为：最低检测水平为单拷贝为：0.5pg你现在浏览的是第二十三页，共52页4、探针的浓度：、探针的浓度：总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。另总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。另外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。要获得较满意的敏感性，膜杂交中要获得较满意的敏感性，膜杂交中
24、32P标记探针与非放标记探针与非放射性标记探针的用量分别为射性标记探针的用量分别为510ng/ml和和251000ng/ml 探针质量衡量的指标：比活性即探针质量衡量的指标：比活性即 cpm/g 如果比活性为如果比活性为108cpm/g，用的浓度为，用的浓度为10g/ml，比活性为比活性为109cpm/g，用的浓度为，用的浓度为2g/ml。你现在浏览的是第二十四页，共52页5 5、探针的长度和同源性、探针的长度和同源性：为了保证杂交的特意性，一般需要用为了保证杂交的特意性，一般需要用500pb左右的长左右的长度的探针。但是，探针过量的条件下，杂交率主要依度的探针。但是，探针过量的条件下，杂交率
25、主要依赖于探针长度（复杂度）和探针浓度。在浓度一定时，赖于探针长度（复杂度）和探针浓度。在浓度一定时，杂交率主要影响因素是探针的长度，长的探针杂交时杂交率主要影响因素是探针的长度，长的探针杂交时间很长，而短探针容易退火，因此标记好的探针长度间很长，而短探针容易退火，因此标记好的探针长度为为100 nt左右，太短将探针与目的序列的结合。左右，太短将探针与目的序列的结合。你现在浏览的是第二十五页，共52页探针与被检测的探针与被检测的DNA之间的同源性也影响之间的同源性也影响Tm：1%mismatch of two DNA lowers the Tm 1.4 如果杂交温度为如果杂交温度为67.5，要
26、求，要求DNA间的同源性为间的同源性为87.5%，在，在65、5xSSC的条件下，要求探针与被检测的的条件下，要求探针与被检测的DNA之间的同源性为多少？之间的同源性为多少？假设：（假设：（GC）45 Tm81.5+16.6(log0.825)+0.41(45%)=98.6 同源性同源性100(98.665.0)/1.4=83.1%你现在浏览的是第二十六页，共52页6、杂交液的成分、杂交液的成分：反应液中每增加反应液中每增加1%的的甲酰胺甲酰胺浓度，浓度，tm值可降低值可降低0.72。6M尿素，降低尿素，降低Tm约约30惰性多聚体可用来促进惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。对
27、单个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达的探针可增加高达100倍。倍。硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。这是一种多聚胺，平均分子量为这是一种多聚胺，平均分子量为500000。另一种常见的。另一种常见的促进剂是聚乙二醇（促进剂是聚乙二醇（PEG），），PEG分子量小（分子量小（60008000）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些条件下在某些条件下5%
28、10%硫酸葡聚糖效果较好，若用硫酸葡聚糖效果较好，若用5%10%PEG则可产生很高的本底。因此，使用促进剂时有必则可产生很高的本底。因此，使用促进剂时有必要优化条件。要优化条件。你现在浏览的是第二十七页，共52页 选用不同的封闭试剂：如选用不同的封闭试剂：如Denhardts试剂、肝素或一试剂、肝素或一种由种由5%脱脂奶粉组成的脱脂奶粉组成的BLOTTO或或block reagent,这些这些试剂中需加入断裂的鲑鱼精子试剂中需加入断裂的鲑鱼精子DNA或酵母或酵母DNA，并和，并和SDS一起使用。与一起使用。与Denhardts试剂相比试剂相比,BLOTTO价格便宜价格便宜,使使用方便用方便,同
29、样可获得满意的结果，但它不能用于同样可获得满意的结果，但它不能用于RNA杂交。杂交。一般而言一般而言,尼龙膜用尼龙膜用Denhardts试剂比用试剂比用BLOTTO能得到更能得到更高的信噪比。高的信噪比。你现在浏览的是第二十八页，共52页7、杂交的时间、杂交的时间在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引间。时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行起非特异结合增多。一般杂交反应要进行16h左右。左右。8、杂交液的体积：一般来说使用较小体积的杂交液
30、比较好，因、杂交液的体积：一般来说使用较小体积的杂交液比较好，因为在小体积溶液中，核酸重新配对的速度快、探针用量少，从为在小体积溶液中，核酸重新配对的速度快、探针用量少，从而使滤膜上的而使滤膜上的DNA在反应中起主要作用。但在杂交中必须保在反应中起主要作用。但在杂交中必须保证有足够的杂交溶液覆盖杂交膜。一般杂交液的用量为证有足够的杂交溶液覆盖杂交膜。一般杂交液的用量为1ml/10cm2 你现在浏览的是第二十九页，共52页七、洗膜时应注意的事项七、洗膜时应注意的事项 1、洗膜的温度和、洗膜的温度和SSC的浓度：的浓度：Stringency:a term used in hybridization
31、 experiments to denote the degree of homology between the probe and the filter bound nucleic acid,the higher the stringency,the higher percent homology between the probe and the filter bound nucleic acid.（1）Non-stringent wash:2xSSC,65Effective Tm 81.5+16.6(log0.33)0.41(45%)92.2 homology 100（9265）/1.
32、4 80.7%（2）Stringent wash:0.1xSSC，65Effective Tm 81.5+16.6(log0.0165)0.41(45%)70.4 homology 100（70.465）/1.4 96.1%你现在浏览的是第三十页，共52页2、洗膜的时间与次数：、洗膜的时间与次数：一般用一般用2XSSC洗洗12次，然后用严格的洗液洗次，然后用严格的洗液洗2次，每次次，每次30分钟。分钟。你现在浏览的是第三十一页，共52页八、脱探针的方法及注意事项八、脱探针的方法及注意事项：尼龙膜可以重复利用，因此杂交后不能干燥，一定尼龙膜可以重复利用，因此杂交后不能干燥，一定保持湿润。保持湿润
33、。处理方法：处理方法：0.1X SCC/0.1%SDS、100 510分钟分钟 DNA的膜还可以用的膜还可以用0.2N NaOH处理处理你现在浏览的是第三十二页，共52页九、标记的方法九、标记的方法 1 1、缺口平移法、缺口平移法、缺口平移法、缺口平移法 （Nick TranslationNick Translation）原理及过程：原理及过程：原理及过程：原理及过程：反应体系中反应体系中反应体系中反应体系中DNADNA酶酶酶酶I I随机在探针随机在探针随机在探针随机在探针DNADNA上打开缺口，然后上打开缺口，然后上打开缺口，然后上打开缺口，然后利用利用利用利用DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶
34、聚合酶I 5 3I 5 3外切酶活性，在缺口处按外切酶活性，在缺口处按外切酶活性，在缺口处按外切酶活性，在缺口处按5 35 3方向切除单核苷酸；同时方向切除单核苷酸；同时方向切除单核苷酸；同时方向切除单核苷酸；同时DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I有有有有5 35 3的聚合酶的聚合酶的聚合酶的聚合酶活性，在缺口处活性，在缺口处活性，在缺口处活性，在缺口处33端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记
35、单核苷酸，并被随核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。机掺入。机掺入。机掺入。DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I的两种作用交替进行，探针即被标记。的两种作用交替进行，探针即被标记。的两种作用交替进行，探针即被标记。的两种作用交替进行，探针即被标记。你现在浏览的是第三十三页，共52页你现在浏览的是第三十四页，共52页2 2、随机引物法（、随机引物法（、随机引物法（、随机引物法（6 6核苷酸引物标记法）核苷酸引物标记法）核苷酸引物标记法）核苷酸引物标记法）原理及过程：利用原理及过程：利用原理及过程：利用原理及过程：利
36、用E.coli DNAE.coli DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I的的的的KlenowKlenow亚单位，合亚单位，合亚单位，合亚单位，合成含有标记核苷酸的成含有标记核苷酸的成含有标记核苷酸的成含有标记核苷酸的DNADNA链。链。链。链。KlenowKlenow具有具有具有具有5 35 3聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶活性。活性。活性。活性。被标记的被标记的被标记的被标记的DNADNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在（探针）变性成单链，引物与模板结合。在（探针）变性成单链，引物与模板结合。在（探针）变性成单链，引物与模板结合。在KlenowKlenow的催化下，以引物的催化下，以引物的催
37、化下，以引物的催化下，以引物33端为起点，沿模板端为起点，沿模板端为起点，沿模板端为起点，沿模板3 53 5方向方向方向方向合成合成合成合成DNADNA新链。反应体系中含有标记的新链。反应体系中含有标记的新链。反应体系中含有标记的新链。反应体系中含有标记的dNTP,dNTP,随机掺入新合随机掺入新合随机掺入新合随机掺入新合成的成的成的成的DNADNA链中，探针即被标记。链中，探针即被标记。链中，探针即被标记。链中，探针即被标记。你现在浏览的是第三十五页，共52页你现在浏览的是第三十六页，共52页3、末端标记、末端标记你现在浏览的是第三十七页，共52页（2 2）交换反应标记法）交换反应标记法你现
38、在浏览的是第三十八页，共52页十、标记的种类十、标记的种类理想的标记物理想的标记物：具有高度的灵敏性具有高度的灵敏性与探针结合后，不影响杂交及探针的主要理化特性与探针结合后，不影响杂交及探针的主要理化特性检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率低，环境污检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率低，环境污染少，价格低廉；染少，价格低廉；若用酶促方法标记，应对若用酶促方法标记，应对Km影响不大影响不大你现在浏览的是第三十九页，共52页1、同位素、同位素-32PdNTP、-32SdNTP用用缺口平移法和随机引物法缺口平移法和随机引物法缺口平移法和随机引物法缺口平移法和随机引物法-32P-ATP用于末端标记用
39、于末端标记放射性同位素（放射性同位素（radiosotlope）是不稳定的，它会）是不稳定的，它会“变变”。放射性同位。放射性同位 素的原子核很不稳定，会不间断地、自素的原子核很不稳定，会不间断地、自发地放射出射线，直至变成另一种稳定同位发地放射出射线，直至变成另一种稳定同位 素，这就是素，这就是所谓所谓“核衰变核衰变”。放射性同位素衰变的快慢，通常用放射性同位素衰变的快慢，通常用“半衰半衰 期期”来表示。来表示。半衰期（半衰期（half-life）即一定数量放射性同位素原子数目减）即一定数量放射性同位素原子数目减少到其初始值一少到其初始值一 半时所需要的时间。半时所需要的时间。你现在浏览的是
40、第四十页，共52页同位素的特性：同位素的特性：检测特异性强；检测特异性强；灵敏度高；灵敏度高；对酶促反应无任何影响，也不影响碱基配对的特异对酶促反应无任何影响，也不影响碱基配对的特异性和稳定性；性和稳定性；易造成放射性污染；易造成放射性污染；半衰期短的同位素应用受到限制，随用随标记，立即使半衰期短的同位素应用受到限制，随用随标记，立即使用，不能长时间存放。用，不能长时间存放。你现在浏览的是第四十一页，共52页同位素同位素符号符号半衰期半衰期射线能量（射线能量（MeV）氢氢-33H12.3年年0.018碳碳-1414C5720年年0.156磷磷3232P14.3天天1.71硫硫3535S87.1
41、天天0.167碘碘131131I8.05天天0.605常用同位素的特征常用同位素的特征你现在浏览的是第四十二页，共52页你现在浏览的是第四十三页，共52页2 2、非放射性标记、非放射性标记优点：无环境污染，可较长时间贮存优点：无环境污染，可较长时间贮存方法：方法：1.1.酶标记法酶标记法 2.2.化学标记法化学标记法要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异亲和性、分子量要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异亲和性、分子量小，对探针杂交无影响或影响甚小，不影响小，对探针杂交无影响或影响甚小，不影响DNA三维空间构三维空间构象的形成。象的形成。常用的标记物：生物素（常用的标记物：生物素（biot
42、in）、地高辛）、地高辛（digoxigenin）、光生物素（）、光生物素（photobiotin）、补骨脂素、）、补骨脂素、2-乙酰氨基芴（乙酰氨基芴（2-acetylomino fluorene）你现在浏览的是第四十四页，共52页地高辛（地高辛（Digoxigenin 简写简写Digo-）又称异羟基洋地黄毒甙）又称异羟基洋地黄毒甙配基，这种类固醇半抗原仅限于洋地黄类植物，其抗体与配基，这种类固醇半抗原仅限于洋地黄类植物，其抗体与其它任何固醇类似物如人体中的性激素等无交叉反应，地其它任何固醇类似物如人体中的性激素等无交叉反应，地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷（高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷
43、酸核苷（dUTP）上形成）上形成digoxigenin 11-dUTP你现在浏览的是第四十五页，共52页地高辛标记技术源于一种从洋地黄类植物（毛地黄和毛花地高辛标记技术源于一种从洋地黄类植物（毛地黄和毛花毛地黄）中提取的类固醇（毛地黄）中提取的类固醇（Steroid）物质）物质 Digoxigenin（DIG），在医学上可用于治疗各种急性和慢性心功能不），在医学上可用于治疗各种急性和慢性心功能不全以及室上性心动过速、心房颤动和扑动等疾病。由于洋全以及室上性心动过速、心房颤动和扑动等疾病。由于洋地黄植物的花和叶片地黄植物的花和叶片Digoxigenin在自然界中的唯一来源，在自然界中的唯一来源，
44、因此抗因此抗DIG的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要。这一点，正是以满足特异性标记的需要。这一点，正是DIG胜于生物胜于生物素素(Biotin)的地方的地方同样是小分子标记物，生物素广泛存在同样是小分子标记物，生物素广泛存在于各种组织中，对于灵敏度很高的标记检测实验来说，样品自于各种组织中，对于灵敏度很高的标记检测实验来说，样品自身含有的内源生物素，就会对结果产生干扰。地高辛就能够很身含有的内源生物素，就会对结果产生干扰。地高辛就能够很好地避免这个问题好地避免这个问题。你现在浏览的是第四十六页，共52页 通过随机引物或缺口翻译法（
45、多用随机引物法），将通过随机引物或缺口翻译法（多用随机引物法），将dig-11-dUTP与探针的核酸分子相连，构成与探针的核酸分子相连，构成Dig-配基标配基标记的核酸探针。将这种标记的探针与核酸分子之间的记的核酸探针。将这种标记的探针与核酸分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交，然后用偶联有酶或同源序列在一定条件下互补杂交，然后用偶联有酶或荧光素的羊抗高地辛抗体荧光素的羊抗高地辛抗体Tab（抗原结合片段）结合物作（抗原结合片段）结合物作为酶标或荧光标记，再分别用显色底物使杂交部位显色或产为酶标或荧光标记，再分别用显色底物使杂交部位显色或产生荧光以达到检测目的。生荧光以达到检测目的。对于对于D
46、IG 标记探针的杂交检测，可选用连接有碱性磷酸标记探针的杂交检测，可选用连接有碱性磷酸酶（酶（alkaline phosphatase），过氧化物酶），过氧化物酶(peroxidase),荧荧光素（光素（fluorescein）,若丹明（若丹明（rhodamine）或是胶体金）或是胶体金（colloidal gold）高亲和性的抗）高亲和性的抗DIG抗体共轭物；也可选抗体共轭物；也可选用不带任何共轭连接的抗用不带任何共轭连接的抗DIG抗体和二级抗体。抗体和二级抗体。你现在浏览的是第四十七页，共52页DIG 系统的优势：系统的优势：（1）高灵敏度，完全可满足实验需要，某些方面甚至可与）高灵敏度，
47、完全可满足实验需要，某些方面甚至可与放射性标记的灵敏度向媲美放射性标记的灵敏度向媲美（2）曝光时间短，结果显示时间以分钟计算，无需）曝光时间短，结果显示时间以分钟计算，无需几小时甚至几天的自显影过程几小时甚至几天的自显影过程（3）安全环保，不接触放射性物质，不会对环境造成污）安全环保，不接触放射性物质，不会对环境造成污染染（4）探针可重复使用，最少可以稳定储存一年）探针可重复使用，最少可以稳定储存一年（5）可轻松进行探针拨离和重探）可轻松进行探针拨离和重探 你现在浏览的是第四十八页，共52页检测的灵敏度主要依赖于对不同抗检测的灵敏度主要依赖于对不同抗DIG抗体共轭物抗体共轭物显示方法的选择。以
48、连接有碱性磷酸酶的抗显示方法的选择。以连接有碱性磷酸酶的抗DIG 抗体为例：抗体为例：即可以使用即可以使用NBT或或BCIP做底物的显色法，也可以使用做底物的显色法，也可以使用HNPP荧光碱性磷酸酶底物，检测的灵敏度常规可达荧光碱性磷酸酶底物，检测的灵敏度常规可达到到0.1pg 你现在浏览的是第四十九页，共52页 常用的免疫酶学检测方法有两类：一是常用的免疫酶学检测方法有两类：一是Dig HRP（辣根过氧化物酶）检测体系，以（辣根过氧化物酶）检测体系，以DAB（四氢氯化二氨（四氢氯化二氨基联苯胺）基联苯胺）/H2O2为底物，结果为棕色；或以为底物，结果为棕色；或以4-氯氯-1-萘酚萘酚/H2O
49、2为底物，结果为蓝色。另一是为底物，结果为蓝色。另一是Dig AKP检测体系：检测体系：以以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。与免疫细胞为底物，结果为蓝紫色沉淀。与免疫细胞化学方法相似，如应用酶促反应会较单一信号的标记物化学方法相似，如应用酶促反应会较单一信号的标记物如荧光素具有更高的灵敏度。同样是酶促化学反应，如荧光素具有更高的灵敏度。同样是酶促化学反应，AKP灵敏度和分辨率较灵敏度和分辨率较HRP高约高约10倍左右，但倍左右，但HRP的优的优点为价廉、稳定。点为价廉、稳定。你现在浏览的是第五十页，共52页你现在浏览的是第五十一页，共52页DIG标记的标记的dUTP代替部分代替部分dTTP掺入待标探针中，经掺入待标探针中，经杂交后用与碱性磷酸酶杂交后用与碱性磷酸酶Ap（alkaline phosphatase）连接的连接的DIG抗体发生免疫反应，通过抗体发生免疫反应，通过Ap使反应底物使反应底物CSPD脱磷，脱磷后的产物不稳定，继续分解同时释脱磷，脱磷后的产物不稳定，继续分解同时释放出光子，可用放出光子，可用X-光片显示杂交信号。光片显示杂交信号。你现在浏览的是第五十二页，共52页