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1、第五章核酸的分子杂交第一页，本课件共有93页一、核酸分子杂交的概念一、核酸分子杂交的概念二、核酸分子杂交的用途二、核酸分子杂交的用途三、核酸分子杂交的原理三、核酸分子杂交的原理四、核酸分子杂交的过程四、核酸分子杂交的过程五、影响核酸分子杂交的因素五、影响核酸分子杂交的因素六、核酸分子杂交的基本方法六、核酸分子杂交的基本方法七、探针的标记七、探针的标记八、荧光原位杂交（八、荧光原位杂交（FISHFISH）技术及其应用）技术及其应用九、基因芯的概念与原理九、基因芯的概念与原理十、基因芯片的种类与应用十、基因芯片的种类与应用主要内容：主要内容：第二页，本课件共有93页第一部分第一部分 核酸分子杂交核
2、酸分子杂交第三页，本课件共有93页1.1.杂交杂交(hybridization(hybridization）从遗传的角度来说从遗传的角度来说,杂交指杂交指基因型不同的个体之间基因型不同的个体之间进行的交配进行的交配。遗传学中经典的也是常用的实验方法。通过遗传学中经典的也是常用的实验方法。通过不不同的基因型的个体之间的交配而取得某些双亲基因重新同的基因型的个体之间的交配而取得某些双亲基因重新组合的个体的方法组合的个体的方法。一般情况下，把通过。一般情况下，把通过生殖细胞相生殖细胞相互融合而达到这一目的过程称为互融合而达到这一目的过程称为杂交杂交；而把由体细胞；而把由体细胞相互融合达到这一结果的过
3、程称为相互融合达到这一结果的过程称为体细胞杂交体细胞杂交。一、核酸分子杂交的概念一、核酸分子杂交的概念第四页，本课件共有93页2.2.核核 酸酸 分分 子子 杂杂 交交（nucleic nucleic acid acid moleucularmoleucular hybridizationhybridization）是是指指具具有有互互补补序序列列的的两两条条核核酸酸单单链链在在一一定定条条件件下下按按碱碱基基配配对对原原则则形形成成双双链链的的过过程程。杂杂交交的的双双方方分分别别称称为为探探针针与与待待测测核核酸酸，杂杂交交后后形形成成的的异异源源双链分子称为双链分子称为杂交分子杂交分子。
4、第五页，本课件共有93页DNADNA杂交分子杂交分子DNARNA杂交分子杂交分子 DNA分子分子DNA分子分子第六页，本课件共有93页复性复性RNADNA第七页，本课件共有93页 核核酸酸分分子子杂杂交交技技术术是是目目前前生生命命科科学学研研究究领领域域中中应应用用最最广广泛泛的技术之一。的技术之一。用途：用途：1.1.是是定性定性或或定量检测定量检测特异特异DNADNA或或RNARNA序列片段的有力工具；序列片段的有力工具；2.2.在在基基因因工工程程技技术术中中，用用放放射射性性标标记记或或非非放放射射性性标标记记的的寡寡核核苷苷酸酸或或cDNAcDNA探探针针进进行行菌菌落落杂杂交交，
5、可可从从cDNAcDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中筛筛选选出出特定的克隆，获得某一重组体；特定的克隆，获得某一重组体；3.3.用用克克隆隆化化的的DNADNA片片段段作作探探针针进进行行SouthernSouthern杂杂交交，可可确确定定基基因组因组DNADNA上上特定区域的核苷酸同源顺序特定区域的核苷酸同源顺序；二、核酸分子杂交的用途二、核酸分子杂交的用途第八页，本课件共有93页4.4.用用S1S1核核酸酸酶酶或或RNARNA酶酶消消化化DNADNA/RNARNA或或者者RNARNA/RNARNA杂杂交交体体是是分析分析基因转录或基因转录或RNARNA加工加工的重要方法；的重要方
6、法；5.5.对对某某一一已已知知基基因因或或已已克克隆隆测测序序的的基基因因可可利利用用核核酸酸杂杂交技术进行染色体定位；交技术进行染色体定位；6.6.可可用用于于遗遗传传病病的的基基因因诊诊断断，用用于于限限制制性性片片段段长长度度多多态态性性作作疾疾病病的的相相关关分分析析，基基因因连连锁锁分分析析，法法医医学学上上的的性性别别分分析析和亲子鉴定和亲子鉴定。7.7.在人类学研究中也有应用价值。在人类学研究中也有应用价值。第九页，本课件共有93页核酸分子杂交的基本原理是：核酸分子杂交的基本原理是：具有互补序列的两条单具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下链核酸分子在一定条件下（适宜的（适
7、宜的温度温度及及离子强度离子强度等）等）碱基互补配对结合，重新形成双链碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸；在这一过程中，核酸分子经历了分子经历了变性变性和和复性复性的变化，以及复性过程中分子间键的变化，以及复性过程中分子间键的形成和断裂等。杂交的双方是的形成和断裂等。杂交的双方是待测核酸待测核酸序列和序列和已知核已知核酸酸序列。在杂交体系中序列。在杂交体系中已知已知的的核酸序列核酸序列称作称作探针探针（probe），探针通常用于进行核素或非核素示踪标记。），探针通常用于进行核素或非核素示踪标记。三、核酸分子杂交的原理三、核酸分子杂交的原理第十页，本课件共有93页探针的意义：探针
8、的意义：要检测某一样品或基因组要检测某一样品或基因组DNADNA中特定中特定的的DNADNA顺序或基因片段，首先必须获得相应的探针，顺序或基因片段，首先必须获得相应的探针，即已知顺序的即已知顺序的DNADNA或或RNARNA片段，并使它带上可检测片段，并使它带上可检测到的示踪到的示踪标记标记。A T C G G T A C A T T A G C C A T G T A 探针探针序列序列待测样本待测样本序列序列第十一页，本课件共有93页分子杂交的形式：分子杂交的形式：固固液相杂交液相杂交 一般在进行某一核酸顺序的检测时，一般在进行某一核酸顺序的检测时，先将待测的单链靶核酸先将待测的单链靶核酸固
9、定在适当的载体固定在适当的载体上，然后置于含相应上，然后置于含相应单链核酸探针的单链核酸探针的杂交反应体系杂交反应体系中，通过碱基互补配对原则，两条中，通过碱基互补配对原则，两条单链的同源顺序通过氢键互相结合，形成双链结构。经过对标记探针单链的同源顺序通过氢键互相结合，形成双链结构。经过对标记探针的检测可以判断待检测样品中相应顺序的的检测可以判断待检测样品中相应顺序的存在与否存在与否及及分子量大小分子量大小。液相杂交液相杂交 有时也将待测核酸和已知核酸同时放在有时也将待测核酸和已知核酸同时放在液液体中体中进行杂交反应。进行杂交反应。两种杂交形式的两种杂交形式的基本原理都是一样的。基本原理都是一
10、样的。第十二页，本课件共有93页1.1.变变性性：在在物物理理或或化化学学因因素素作作用用下下，例例如如加加热热、酸酸碱碱或或紫紫外外线线照照射射，可可以以导导致致两两条条DNADNA链链之之间间的的氢氢键键断断裂裂，而而核核酸酸分分子子中中的的所所有有共共价价键键（如如磷磷酸酸二二酯酯键键、糖糖苷苷键键等等）则不受影响，称为则不受影响，称为DNADNA变性变性（DNA denaturationDNA denaturation）。）。四、核酸分子杂交的过程四、核酸分子杂交的过程DNADNA的的变性变性与与复性复性导致导致DNADNA变性的常用方法有三种：变性的常用方法有三种：热变性热变性碱变性
11、碱变性化学试剂变性。化学试剂变性。第十三页，本课件共有93页变性的情况：变性的情况：a.T70a.T700 0C C，DNADNA几乎不变性；几乎不变性；b.70b.700 0CT90CT90c.T900 0C C，DNADNA变性使双链打开，成为单链分子；变性使双链打开，成为单链分子；d.T100d.T1000 0C C，DNADNA双链分离。双链分离。所以，一般核酸变性的温度都选在所以，一般核酸变性的温度都选在90901001000 0C C之间。之间。（1 1）热变性）热变性：当升高核酸溶液的温度时，核酸双当升高核酸溶液的温度时，核酸双链间的氢键发生断裂，核酸的双链逐渐打开。链间的氢键发
12、生断裂，核酸的双链逐渐打开。第十四页，本课件共有93页（2 2）酸碱变性）酸碱变性：当核酸溶液的：当核酸溶液的pHpH低于低于3 3或高于或高于1010时，核酸的时，核酸的双链可以完全打开成为单链核酸分子。在分子杂交中，双链可以完全打开成为单链核酸分子。在分子杂交中，最常用最常用的核酸变性方法是的核酸变性方法是碱变性碱变性。因通常需要的核酸的载体如。因通常需要的核酸的载体如凝凝胶胶或或膜膜对热都不稳定对热都不稳定。（3 3）化学试剂变性）化学试剂变性：当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂如：当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂如尿素、甲醛尿素、甲醛等时，两条链之间的氢键可以断裂而形成单链核酸分子。
13、等时，两条链之间的氢键可以断裂而形成单链核酸分子。除物理、化学因素外，除物理、化学因素外，DNADNA分子的组成也影响变性。最主要的因分子的组成也影响变性。最主要的因素是素是DNADNA分子中的分子中的GCGC含量，含量，GCGC含量高的含量高的DNADNA不易变性，而不易变性，而ATAT含量高含量高的的DNADNA容易变性。容易变性。另外另外,环状环状DNADNA比线性比线性DNADNA难于变性难于变性.第十五页，本课件共有93页 DNADNA的变性是可逆的的变性是可逆的，即两条互补的单链，即两条互补的单链DNADNA分子在分子在变性条件除去后变性条件除去后重新重新按碱基互补原则以氢键相连按
14、碱基互补原则以氢键相连形成形成双链双链DNADNA分子分子，这一过程称作，这一过程称作DNADNA复性复性（DNA DNA renaturationrenaturation）。如果是如果是异源双链分子的结合异源双链分子的结合则称为则称为杂交杂交(hybridization)。相似的复性或杂交反应可以发生在任何具有互补核苷酸相似的复性或杂交反应可以发生在任何具有互补核苷酸顺序的两条单股核酸链之间，如顺序的两条单股核酸链之间，如DNA/DNA/DNADNA，DNA/DNA/RNARNA，RNA/RNA/RNARNA或人工合成的寡核苷酸片段与或人工合成的寡核苷酸片段与DNADNA、RNARNA等。等
15、。2.2.复性复性第十六页，本课件共有93页1.1.核酸分子的浓度和长度：核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快；分子浓度越大，复性速度越快；分子 量越大，复性速度越慢。量越大，复性速度越慢。一般情况下：探针浓度为一般情况下：探针浓度为0.10.10.5g0.5g；长度为；长度为5050300 bp300 bp2.2.温度：温度：适宜温度为适宜温度为 比比TmTm值值低低 25 250 0C C TmTm双链双链DNADNA变性一半所需要的温度变性一半所需要的温度(DNA(DNA的溶解温度，的溶解温度，meltingmelting temperature,Tm temperature,T
16、m）3.3.离子强度：离子强度：低离子（低离子（NaNa+）强度下，核酸杂交非常缓慢，离）强度下，核酸杂交非常缓慢，离 子强度增加，杂交反应率增提高。所以，必须维持较高的子强度增加，杂交反应率增提高。所以，必须维持较高的 杂交反应液和洗膜液的盐浓度杂交反应液和洗膜液的盐浓度 五、影响核酸分子杂交的因素五、影响核酸分子杂交的因素 核酸分子杂交实际上就是两条互补的单链核酸分子通过复性重新缔合形核酸分子杂交实际上就是两条互补的单链核酸分子通过复性重新缔合形成双链的过程。这一过程受到成双链的过程。这一过程受到诸多因素诸多因素的影响。的影响。第十七页，本课件共有93页4 4.杂杂交交液液中中的的甲甲酰酰
17、胺胺：甲甲酰酰胺胺能能降降低低核核酸酸杂杂交交的的TmTm值值，从而使得：（从而使得：（1 1）在低温下探针更稳定；）在低温下探针更稳定；（2 2）能更好地保留非共价结合）能更好地保留非共价结合 的核酸。的核酸。一般是：一般是：50%50%甲酰胺甲酰胺 35 3542420 0C C5 5.核酸分子的复杂性：核酸分子的复杂性：不同顺序的总长度不同顺序的总长度(碱基数）碱基数）6 6.非特异性杂交反应：非特异性杂交反应：须在杂交前封闭非特异性杂须在杂交前封闭非特异性杂 交位点，以减少其对探针的非特异性吸附作用交位点，以减少其对探针的非特异性吸附作用第十八页，本课件共有93页1.Southern1
18、.Southern印迹杂交（印迹杂交（Southern blotSouthern blot）鉴别鉴别DNADNA靶分子（待测核酸是靶分子（待测核酸是DNADNA）六、核酸分子杂交的基本方法六、核酸分子杂交的基本方法3.3.斑点杂交、斑点杂交、4.4.原位杂交、原位杂交、5.5.核酸酶保护实验等。核酸酶保护实验等。2.Northern2.Northern印迹杂交（印迹杂交（Northern blotNorthern blot）鉴别鉴别RNARNA靶分子（待测核酸是靶分子（待测核酸是RNARNA）根据其用途可将核酸分子杂交分为几种基本类型：根据其用途可将核酸分子杂交分为几种基本类型：第十九页，本课
19、件共有93页SouthernSouthern印印迹迹杂杂交交是是指指DNADNA与与DNADNA的的杂杂交交，将将电电泳泳分分离离的的待待测测DNADNA片片段段转转印印并并结结合合到到一一定定的的固固相相支支持持物物上上，然然后后用用标标记记的的DNADNA探探针针检检测测待待测测DNADNA的的一一种种方方法法。这这是是19751975年年英英国国爱爱丁丁堡堡大大学学的的SouthernSouthern建建立立的的方方法法，因因此此而而得名。得名。基本步骤：基本步骤：（一）（一）SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交 1.1.待测核酸样品的制备待测核酸样品的制备（1 1）制备待测
20、）制备待测DNADNA：从样本的细胞或组织中制备从样本的细胞或组织中制备DNADNA（2 2）DNADNA的限制酶消化：的限制酶消化：将将DNADNA切割成大小不同的片段切割成大小不同的片段第二十页，本课件共有93页 2.2.待待测测DNADNA样样品品的的电电泳泳分分离离：将将DNADNA样样品品在在0.80.81.0%1.0%琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中电电泳泳，以以对对DNADNA片片段段进进行行分分离离（琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶是是由由琼琼脂脂糖糖形形成成的的网网状状物物质质，具具有有分分子子筛筛的的作作用用，DNADNA因因其其分分子子大大小小而而在在琼脂糖凝胶中的泳动琼脂糖凝胶中的泳动速度
21、不同速度不同达到分离）。达到分离）。3.3.凝凝胶胶中中核核酸酸的的变变性性：对对凝凝胶胶中中的的DNADNA进进行行碱碱变变性性，使使其其形形成成较短的单链片段。较短的单链片段。4.Southern 4.Southern 转膜：转膜：将凝胶中的将凝胶中的DNADNA片段转移到硝酸纤维膜片段转移到硝酸纤维膜（NCNC）等固相支持物上。各个）等固相支持物上。各个DNADNA片段在膜上的相对位置与在凝片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置是一样的，故称为胶中的相对位置是一样的，故称为印迹印迹（blotblot）。）。第二十一页，本课件共有93页（1 1）毛毛细细管管虹虹吸吸印印迹迹法法：利利用用
22、浓浓盐盐转转移移缓缓冲冲液液的的推推动动作用，将凝胶中的作用，将凝胶中的DNADNA转移到固相支持物上。转移到固相支持物上。（见下页图见下页图）（2 2）电电转转印印法法：通通过过电电泳泳作作用用将将凝凝胶胶中中的的DNADNA转转移移到到滤滤膜膜上。上。（3 3）真空转移法：其原理与毛细管虹吸印迹法相同。）真空转移法：其原理与毛细管虹吸印迹法相同。Southern Southern 转膜的方法转膜的方法第二十二页，本课件共有93页重物重物湿滤纸湿滤纸吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板胶胶膜膜湿滤纸湿滤纸湿滤纸桥湿滤纸桥支持平台支持平台玻璃容器玻璃容器20SSC毛细管虹吸法毛细管虹吸法Southern转
23、膜示意图转膜示意图第二十三页，本课件共有93页5.5.探针的制备：探针的制备：用缺口平移或随机引物标记的方法用缺口平移或随机引物标记的方法 制备探针、标记。制备探针、标记。7.7.杂交结果的检测杂交结果的检测（1 1）放射线标记放射线标记放射自显影，感光胶片，显出黑放射自显影，感光胶片，显出黑 色杂交带；色杂交带；（2 2）非放射线标记非放射线标记直接显出杂交带，进行检测。直接显出杂交带，进行检测。6.Southern6.Southern杂交杂交（1 1）预杂交预杂交 封闭膜上所有能与封闭膜上所有能与DNADNA结合的位点转印后结合的位点转印后 的膜在的膜在预杂交液（不含探针的杂交液）预杂交液
24、（不含探针的杂交液）4 46 6小时小时（2 2）杂交杂交 （过夜）（过夜）第二十四页，本课件共有93页分子杂交实验分子杂交实验目目 录录第二十五页，本课件共有93页放放射射自自显显影影照照片片目目 录录第二十六页，本课件共有93页分分子子杂杂交交电电泳泳图图目目 录录第二十七页，本课件共有93页8.8.SouthernSouthern印迹杂交在医学中的应用印迹杂交在医学中的应用 SouthernSouthern印迹杂交技术已有印迹杂交技术已有3030余年的历史，在余年的历史，在核酸的结构和功能研究中作出过重要贡献。核酸的结构和功能研究中作出过重要贡献。如：发现成熟如：发现成熟B B细胞中免疫
25、球蛋白基因重排细胞中免疫球蛋白基因重排现象；进行克隆基因的酶切图谱分析；特定基现象；进行克隆基因的酶切图谱分析；特定基因的定性和定量；因的定性和定量；DNADNA多态性多态性(RFLP,RAPD,AFLP(RFLP,RAPD,AFLP等等)分析分析 第二十八页，本课件共有93页 NorthernNorthern印印迹迹杂杂交交是是指指将将待待测测RNARNA样样品品经经电电泳泳分分离离后后转转移移到到固固相相支支持持物物上上，然然后后与与标标记记的的核核酸酸探探针针进进行行固固液液相相杂杂交交，以以检检测测RNARNA（主主要要是是mRNAmRNA）的的方方法法。其其基基本本原原理理和和基基本
26、本过过程程与与SouthernSouthern印印迹迹杂杂交交基基本本相相同同。只只是是在在以以下下几几点点有有所不同。所不同。（二）（二）NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交1.1.靶核酸靶核酸RNARNA2.RNA2.RNA电泳电泳在变性胶中进行（加入变性剂，以维持单在变性胶中进行（加入变性剂，以维持单 链线性状态）链线性状态）3.3.转膜转膜电泳后不需要再进行变性和中和，直接用毛电泳后不需要再进行变性和中和，直接用毛 细管虹吸法细管虹吸法等方法转移。转移。第二十九页，本课件共有93页（三）斑点及狭缝印迹杂交（三）斑点及狭缝印迹杂交特点：特点：简单、快速，可在同一张膜上同时进行
27、多个样品简单、快速，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；的检测；但不能鉴别分子量，且特异性不高，有一定比但不能鉴别分子量，且特异性不高，有一定比例的假阳性。例的假阳性。将将RNARNA或或DNADNA变性后变性后直接点样直接点样于硝酸纤维膜和尼龙膜于硝酸纤维膜和尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为研究，称为斑点印迹斑点印迹(dot blotdot blot)。如如印迹印迹是线状则为是线状则为狭缝印迹狭缝印迹或或狭线印迹狭线印迹(slot blotslot blot）第三十页，本课件共有93页 （四）原位杂交（四）原位杂交 核
28、酸保持在细胞或组织样本中，经适当的方法处理细核酸保持在细胞或组织样本中，经适当的方法处理细胞或组织后，将标记的核酸胞或组织后，将标记的核酸探针探针与与细胞或组织中的核酸细胞或组织中的核酸进行进行杂交杂交，称为，称为原位杂交（原位杂交（in situin situ hybridization hybridization）。这是一种标记这是一种标记DNADNA与整个染色体杂交并且发生杂交的区域可通与整个染色体杂交并且发生杂交的区域可通过显微镜观察的技术。过显微镜观察的技术。特点：特点：（1 1）不受组织成分的影响；不受组织成分的影响；（2 2）灵敏度高；灵敏度高；（3 3）可完整保可完整保持细胞或
29、组织形态，准确反映组织细胞的相互关系及功能；持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系及功能；（4 4）可检测多个探针。可检测多个探针。核核酸酸原原位位杂杂交交包包括括组组织织细细胞胞的的固固定定、预预杂杂交交、杂杂交交、冲冲洗洗及及信号检测信号检测等基本步骤。等基本步骤。第三十一页，本课件共有93页1.1.组织或细胞的固定组织或细胞的固定2.2.组织细胞杂交前的预处理（预杂交）组织细胞杂交前的预处理（预杂交）3.3.探针的选择和标记探针的选择和标记4.4.杂交杂交5.5.杂交结果检测杂交结果检测 重点介绍重点介绍荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescence fluorescence
30、in situin situ hybridization,FISH hybridization,FISH）第三十二页，本课件共有93页概概念念：液液相相杂杂交交是是指指待待测测核核酸酸分分子子与与核核酸酸探探针针都都存存在在于于杂杂交交液液中中，碱碱基基互互补补的的单单链链核核酸酸分分子子在在液液体体中中配配对对形形成成杂交分子。杂交分子。种类：种类：A.RNA A.RNA酶保护分析法酶保护分析法(RNase protection assay,RPA)(RNase protection assay,RPA)用用于于mRNAmRNA定定量量、mRNAmRNA末末端端定定位位及及确确定定内内含含子
31、子在在相相应应基基因因中中的的位位置等。置等。（五）液相杂交（五）液相杂交1.1.制备待测制备待测RNA;2.RNARNA;2.RNA探针的标记探针的标记3.3.杂交杂交;4.;4.除去单链除去单链RNARNA5.5.电泳分析电泳分析 第三十三页，本课件共有93页B.B.核核 酸酸 酶酶 S1S1保保 护护 分分 析析 法法(nuclease(nuclease S1 S1 protection assay)protection assay)用用于于基基因因转转录录起起始始位位点点分分析析及及内内含含子子剪剪切切位位点分析。点分析。其原理与其原理与RNARNA酶保护分析法类似酶保护分析法类似.第
32、三十四页，本课件共有93页1.cDNA1.cDNA探针探针：逆转录：逆转录 cDNA cDNA 克隆于载体克隆于载体 扩增重组扩增重组 质粒质粒 提取质粒提取质粒 消化重组质粒消化重组质粒 切割切割cDNAcDNA片段片段 分离纯化分离纯化 cDNA cDNA探针探针 cDNAcDNA探针应用最广泛探针应用最广泛2.2.基因组基因组DNADNA探针探针：从基因组文库：从基因组文库 筛选特定基因（或基筛选特定基因（或基 因片段）因片段）克隆克隆 扩增扩增 纯化纯化 切取片段切取片段 分离纯化分离纯化 探针探针3.3.寡核苷酸探针寡核苷酸探针：一定长度的寡核苷酸片段（十几个核苷酸：一定长度的寡核苷
33、酸片段（十几个核苷酸 以上）以上）4.RNA4.RNA探针探针：以：以RNARNA作为探针作为探针 （基因克隆和体外转录获得）（基因克隆和体外转录获得）七、探针的标记七、探针的标记（一）探针的种类（一）探针的种类第三十五页，本课件共有93页1.1.核素标记物核素标记物一般用一般用-3232P,P,但但5 5末端必须用末端必须用-3232P P。2.2.非核素标记物非核素标记物（1 1）半抗原：）半抗原：生物素生物素(biotin)(biotin)和和地高辛地高辛(digoxin,digacin,DIG)（2 2）配体：）配体：生物素既是生物素既是半抗原半抗原，又是，又是亲和素亲和素(avidi
34、navidin，抗生物素蛋白抗生物素蛋白)，故可用生物素，故可用生物素-亲和素反亲和素反 应进行杂交信号检测应进行杂交信号检测（3 3）荧光素：）荧光素：异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素(FITC)(FITC)（4 4）化学发光探针）化学发光探针（二）标记物（二）标记物第三十六页，本课件共有93页1.1.缺口平移法缺口平移法(nick translation)(nick translation)(见图见图)2.2.随机引物法随机引物法(randon primer)(randon primer)（见图）（见图）3.PCR3.PCR标记法标记法4.4.末端标记法末端标记法 （三）标记方法（三）标记方法
35、第三十七页，本课件共有93页缺口平移法标记缺口平移法标记DNADNA探针探针DNase；Mg2+53 模板模板DNADNA35533 随机打开缺口随机打开缺口5DNA聚合酶；聚合酶；-32P-dCTP；dNTPs标记的探针标记的探针第三十八页，本课件共有93页随机引物法标记随机引物法标记DNADNA探针探针53 模板模板DNADNA3553变性变性53Klenow聚合酶；聚合酶；-32P-dCTP；dNTPs变性变性标记的探针标记的探针随机引物随机引物第三十九页，本课件共有93页1.1.乙醇沉淀法乙醇沉淀法2.Sephadex G-502.Sephadex G-50柱层析法柱层析法3.3.微柱
36、离心法微柱离心法 （四）探针的纯化（四）探针的纯化第四十页，本课件共有93页 印迹技术的类别及应用印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术(Southern blotting)用于基因组用于基因组DNADNA、重组质粒和噬菌体的、重组质粒和噬菌体的分析。分析。（二）（二）RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)用于用于RNARNA的定性定量分析的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。第四十一页，本课件共有93页Western Blot 图
37、片图片第四十二页，本课件共有93页三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较第四十三页，本课件共有93页八、荧光原位杂交（八、荧光原位杂交（FISH）技术）技术及其在医学上的应用及其在医学上的应用第四十四页，本课件共有93页（一）荧光原位杂交技术的概念（一）荧光原位杂交技术的概念第四十五页，本课件共有93页 荧光原位杂交荧光原位杂交(Fluorescence(Fluorescence in situ in situ hybridization,FISH)FISH)是一种在放射性原位杂交基础上发展起来的非放射性原是一种在放射性原位杂交基础上发展起来的非放射性原位杂交技术，是把位杂交技术，是把生物素生物
38、素或或地高辛地高辛(DIG)(DIG)等标记物质标记等标记物质标记的的DNADNA片段作为片段作为探针探针（probeprobe），与染色体），与染色体DNADNA进行进行分子分子杂交杂交，利用，利用荧光色素荧光色素为检测信号，在为检测信号，在荧光显微镜荧光显微镜下直下直接检测探针互补的接检测探针互补的DNADNA片段的存在部位。片段的存在部位。第四十六页，本课件共有93页 实际上是分子生物学与细胞生物学交叉结合而形成实际上是分子生物学与细胞生物学交叉结合而形成的一种现代生物技术，属于的一种现代生物技术，属于分子细胞生物学分子细胞生物学的范畴。的范畴。FISHFISH技术技术现已成为现已成为分
39、子生物学分子生物学与与分子细胞遗传学分子细胞遗传学研究中的重要手段。研究中的重要手段。第四十七页，本课件共有93页（二）（二）FISHFISH的基本原理的基本原理第四十八页，本课件共有93页 依据依据碱基互补碱基互补原理，将原理，将DNADNA探针用特殊修饰的核苷酸探针用特殊修饰的核苷酸分子标记分子标记（如（如biotin-dUTPbiotin-dUTP或或digoxigenin-dUTPdigoxigenin-dUTP），然后），然后将标记将标记探针直接探针直接杂交杂交到染色体或到染色体或DNADNA纤维切片上，再通纤维切片上，再通过直接过直接检测检测（荧光素直接标记的探针）或用荧光素分子（
40、荧光素直接标记的探针）或用荧光素分子藕联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来间接检测藕联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来间接检测DNADNA在染色体或在染色体或DNADNA纤维上的定位。纤维上的定位。FISHFISH基于基于免疫组织化学免疫组织化学（抗原抗体反应，即与荧光素（抗原抗体反应，即与荧光素偶联的抗体和抗原结合）与偶联的抗体和抗原结合）与分子杂交分子杂交原理。原理。第四十九页，本课件共有93页（三）用于（三）用于FISHFISH的探针类型的探针类型a.a.着丝粒探针着丝粒探针(centromeric probe)(centromeric probe)b.b.全染色体或染色体区带特异性探
41、针全染色体或染色体区带特异性探针(whole chromosome or region-specific probe)(whole chromosome or region-specific probe)第五十页，本课件共有93页c.c.染色体特异性单一序列探针（染色体特异性单一序列探针（unique sequence unique sequence probe probe，USPUSP）d.d.端粒染色体探针端粒染色体探针(telomeric chromosome probes(telomeric chromosome probes 第五十一页，本课件共有93页探针探针DNA染色体标本染色体
42、标本切口平移法切口平移法前处理前处理探针探针DNA变性变性染色体染色体DNADNA变性变性单链单链DNA单链单链DNADNA用用PI、DAPI对染色体染色对染色体染色（四）荧光原位杂交（四）荧光原位杂交（FISHFISH）示意图）示意图 探针探针DNA与染色体与染色体DNA分子杂交分子杂交用抗生物素蛋白用抗生物素蛋白荧光素处理荧光素处理找出杂交信号找出杂交信号 用荧光显微镜观察用荧光显微镜观察生物素（地高辛）标记生物素（地高辛）标记第五十二页，本课件共有93页第五十三页，本课件共有93页（五）（五）FISHFISH衍生技术衍生技术 随随着着分分子子生生物物学学实实验验技技术术的的不不断断发发展
43、展,FISH,FISH技技术术也也在不断发展，已形成了一系列衍生技术在不断发展，已形成了一系列衍生技术:1.1.染色体涂染染色体涂染(chromosomal painting)(chromosomal painting)技术技术 2.2.多彩色荧光原位杂交多彩色荧光原位杂交(multicolor-FISH)(multicolor-FISH)又称多色涂染技术又称多色涂染技术(multiplex-FISH)(multiplex-FISH)第五十四页，本课件共有93页第五十五页，本课件共有93页第五十六页，本课件共有93页双色双色FISHFISH图图第五十七页，本课件共有93页双色双色FISHFIS
44、H图图第五十八页，本课件共有93页第五十九页，本课件共有93页第六十页，本课件共有93页第六十一页，本课件共有93页多色多色FISHFISH图图第六十二页，本课件共有93页第六十三页，本课件共有93页第六十四页，本课件共有93页 由于由于FISHFISH具有安全、经济、灵敏快速和精确具有安全、经济、灵敏快速和精确等优点，它已被广泛运用于：等优点，它已被广泛运用于：9 9.基因诊断、产前诊断及肿瘤病理学等领域基因诊断、产前诊断及肿瘤病理学等领域 1 1.基因定位基因定位2 2.染色体的同源性、染色体起源与进化的研究染色体的同源性、染色体起源与进化的研究3 3.染色体与基因突变的研究染色体与基因突
45、变的研究4 4.异常染色体及染色体病检测异常染色体及染色体病检测5 5.外源染色体的鉴定外源染色体的鉴定6 6.转基因动植物外源基因整合位点的检测转基因动植物外源基因整合位点的检测7 7.比较基因组结构和功能比较基因组结构和功能8 8.DNADNA分子及基因物理图谱的构建分子及基因物理图谱的构建第六十五页，本课件共有93页（六）（六）FISHFISH 技术应用实例技术应用实例第六十六页，本课件共有93页杨征等杨征等(2000)(2000)：以人的：以人的rasras基因基因为探针，运用荧光原位杂交技术，为探针，运用荧光原位杂交技术，首次对首次对rasras基因基因在玉米中同源序列进行了定位。结
46、果表明：在玉米中同源序列进行了定位。结果表明：rasras探针探针在第在第2 2号号和第和第7 7号染色体号染色体上均检出了杂交信号。上均检出了杂交信号。A.A.在在第第2 2和第和第7 7号染色体长臂号染色体长臂 同时检出同时检出rasras探针杂交信号；探针杂交信号；B.B.在在2 2条条第第7 7号号染色体长臂同染色体长臂同 时检出时检出rasras探针杂交信号；探针杂交信号；RasRas基因基因：促进细胞增殖，抑制细胞凋亡的原癌基因促进细胞增殖，抑制细胞凋亡的原癌基因第六十七页，本课件共有93页C.C.rasras探针杂交信号在探针杂交信号在 第第7 7号号染色体长臂上；染色体长臂上；
47、D.D.rasras探针杂交信号在探针杂交信号在 第第2 2号号染色体长臂上；染色体长臂上；第六十八页，本课件共有93页E.E.同时检出同时检出rasras探针探针2 2个个或或1 1 个个杂交信号的间期细胞；杂交信号的间期细胞；F.F.同时检出同时检出rasras探针探针4 4个个 杂交信号的间期细胞；杂交信号的间期细胞；第六十九页，本课件共有93页汪旭等汪旭等(1999).(1999).利用利用多色多色荧光原位杂交，分析了荧光原位杂交，分析了2-2-（4-4-噻唑）噻唑）苯丙咪唑（苯丙咪唑（TBTB）对小鼠精子）对小鼠精子8 8号、号、X X及及Y Y染色体分离的影响。染色体分离的影响。a
48、.a.正常精子正常精子8X8X，8Y8Y；b.88Xb.88X精子；精子；c.8YYc.8YY精子；精子；d.88yyd.88yy精子（精子（红色红色：CY3CY3荧光，荧光，8 8号染色体号染色体信信号。号。绿色绿色：FITCFITC荧光，荧光，Y Y染色体染色体信号。信号。黄色黄色：CY3+FITCCY3+FITC，X X染色体染色体信号。信号。兰色兰色：DAPIDAPI，精子染色质精子染色质）第七十页，本课件共有93页ABC夏薇等（夏薇等（20012001）：）：FISHFISH方法结合方法结合G G显带检显带检测人测人E E珠蛋白基因在珠蛋白基因在转基因鼠转基因鼠染色体染色体整合整合A
49、.A.转基因鼠转基因鼠NO.1 NO.1 荧光信号位于荧光信号位于1515号号染色体染色体D D区区；B.B.转基因鼠转基因鼠NO.2 NO.2 荧光信号位于荧光信号位于1 1号号染色体染色体C C区区；C.C.转基因鼠转基因鼠NO.3 NO.3 荧光信号位于荧光信号位于7 7号号染色体染色体C C区区；第七十一页，本课件共有93页 重点掌握：重点掌握：一、核酸分子杂交的概念一、核酸分子杂交的概念 二、原理二、原理 三、种类：三、种类：1.1.SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交 四、探针的种类：四、探针的种类：1.cDNA1.cDNA探针；探针；2.2.基因组基因组DNADNA探
50、针；探针；3.3.寡核苷酸探针；寡核苷酸探针；4.RNA4.RNA探针探针五、标记的方法：五、标记的方法：1.1.缺口平移法；缺口平移法；2.2.随机引物法；随机引物法；3.PCRPCR标记法；标记法；2.2.NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交3.3.斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交4.4.原位杂交原位杂交5.5.液相杂交液相杂交4.4.末端标记法末端标记法 第七十二页，本课件共有93页基基 因因 芯芯 片片 Gene chip Song Fangzhou2012.3第二部分第二部分 第七十三页，本课件共有93页内容提要内容提要n什么是基因芯片什么是基因芯片n基因芯片的原理基