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1、现代分子生物学大实验现代分子生物学大实验现代分子生物学大实验现代分子生物学大实验实验三 总RNA的提取与Northern杂交实验目的掌握植物总掌握植物总RNA的提取及凝胶电泳检测的原理及方的提取及凝胶电泳检测的原理及方法并能熟练操作法并能熟练操作对于不同的植物组织，选取不同的提取方法，提取对于不同的植物组织，选取不同的提取方法，提取植物的总植物的总RNA重点掌握重点掌握Northern杂交基本原理、基本实验步骤和杂交基本原理、基本实验步骤和检测方法检测方法利用利用Northern杂交检测目的基因的时空表达情况，杂交检测目的基因的时空表达情况，如不同生长发育阶段、不同的组织部位、不同生长如不同生
2、长发育阶段、不同的组织部位、不同生长环境等条件下相关基因的表达情况环境等条件下相关基因的表达情况植物总植物总RNA 的提取及电泳检测的提取及电泳检测掌握植物总掌握植物总RNA的提取及凝胶电泳检测的原理的提取及凝胶电泳检测的原理掌握植物总掌握植物总RNA提取的方法并熟练操作提取的方法并熟练操作用甲醛变性凝胶进行电泳，检测总用甲醛变性凝胶进行电泳，检测总RNA提取质量提取质量对于不同的植物组织，选取不同的提取方法，提取对于不同的植物组织，选取不同的提取方法，提取植物的总植物的总RNA实验原理细胞破碎，核酸溶出细胞破碎，核酸溶出液氮速冻后，对植物组织进行研磨可以破碎细胞。细胞提取液可溶出核酸。核酸的
3、纯化核酸的纯化DNA的去除酚、氯仿抽提使蛋白质变性、沉淀，可去除蛋白。多糖、次生代谢物核酸的保护（核酸的保护（内源RNA酶）低温、苯酚、氯仿、SDS可以部分抑制RNA酶的活性，保护RNA不被酶解。实验设备常规设备移液器，tip头，离心机RNA电泳金属浴，水平凝胶电泳仪，微波炉，紫外凝胶成像系统紫外分光光度计实验试剂RNA提取液100 mmol/L TrisCl pH8.520 mmol/L EDTA pH8.5 0.2M NaCl 1%SDS-巯基乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇琼脂糖、MOPS、EB替代品实验步骤新鲜植物材料新鲜植物材料液氮研磨液氮研磨抽提液抽提液混匀混匀酚酚/氯仿氯仿
4、抽提抽提水层水层中间层中间层有机层有机层加入异丙醇沉淀加入异丙醇沉淀干燥干燥水融水融反复抽提反复抽提实验步骤1.向向1.5 mL 离心管中加入离心管中加入700 L RNA提取液，提取液，35L的的-巯基乙巯基乙醇（终浓度醇（终浓度5%）。）。2.取适量材料，在液氮充分研磨成粉末后，装入离心管中，用力取适量材料，在液氮充分研磨成粉末后，装入离心管中，用力充分混匀。充分混匀。3.加入苯酚加入苯酚/氯仿氯仿/异戊醇（异戊醇（25:24:1）各）各350L，混匀，混匀10min，4 8000rpm离心离心10min。4.取上清，加入等体积的氯仿取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇（异戊醇（24:1），摇
5、床震荡），摇床震荡10min，4 8000rpm离心离心10min。5.取上清，加入等体积的异丙醇和取上清，加入等体积的异丙醇和1/10体积的体积的5 mol/L NaCl，充分，充分混匀。混匀。-20放置放置20min后后4，12000 rpm离心离心10 min。6.弃上清，弃上清，70%乙醇洗沉淀，离心，乙醇洗沉淀，离心，412000 rpm离心离心5 min。7.弃上清，通风橱内干燥沉淀。弃上清，通风橱内干燥沉淀。8.沉淀溶于沉淀溶于20 L灭菌水中，备用。灭菌水中，备用。五、实验步骤RNA浓度测定取1ul RNA样品，加水199ul后读取260nm处的吸光度值260nm处的吸光度值相
6、当于40g/ml单链RNA，以此来计算样品含量。260nm和280nm读数比值（A260/A280）可反映核酸的纯度纯品的A260/A280的值为2.0，低于A260/A280，有蛋白质或酚的污染。实验步骤RNA电泳RNA变性处理1ul RNA样品加入2.5ul 上样缓冲液，混匀后65温育5-10min置于冰上冷却（20ul RNA+50ul上样缓冲液）检测RNA的凝胶要配制MOPS甲醛电泳缓冲液为1M0PS 实验步骤用透明胶带将胶板的两端封好。配制0.8%的琼脂糖凝胶（1.6g琼脂糖于500ml三角瓶中，加入1MOPS 200ml），在微波炉中加热至琼脂糖溶解。10MOPS（MOPS 0.2
7、M，NaAC 50mM，EDTA 10mM，pH7.0）待溶液冷却至60左右，加入10ml甲醛，4ulEB替代品充分混匀。放置合适大小的梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在3-5 mm之间，大约需要凝固20min。注意事项特别要注意的是在所有器具严格消毒，实验过程中需要带手套，减少说话和走动等防止RNase的污染，来保证RNA不被降解。分子杂交分子杂交核酸分子杂交，其中又包括核酸分子杂交，其中又包括Southern杂交及杂交及Northern杂交。杂交。属于蛋白质分子属于蛋白质分子“杂交杂交”的的Western杂交。杂交。核酸分子杂交是指非同一分子来源但具有互补序列核酸分子杂交是指非
8、同一分子来源但具有互补序列(或某一区段互补或某一区段互补)的两条多核苷酸链，通过的两条多核苷酸链，通过WatsonCrick碱基配对形成稳定的双链分子的过程。碱基配对形成稳定的双链分子的过程。杂交的双方是待测核酸及探针（杂交的双方是待测核酸及探针（probe）待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是基因组基因组DNA或总或总RNA被人为标记上，该标记可以通过某种特定方法检被人为标记上，该标记可以通过某种特定方法检出，即成为所谓的探针。出，即成为所谓的探针。实验原理分子杂交植物材料植物材料植物材料植物材料 RNARNA DNA DNA合成探针合成探针S
9、outhern杂交杂交Northern杂交杂交原位杂交原位杂交 组织切片组织切片组织切片组织切片分子杂交是进行核酸序列分析，重组子鉴定，分子杂交是进行核酸序列分析，重组子鉴定，及检测外源基因整合及表达的强有力的手段。及检测外源基因整合及表达的强有力的手段。要证明外源基因在植物染色体上整合的最可要证明外源基因在植物染色体上整合的最可靠的方法是，只有经分子杂交鉴定过的植物靠的方法是，只有经分子杂交鉴定过的植物才可以称为转基因植物。才可以称为转基因植物。同时也可以利用同时也可以利用Northern杂交来检测不同生杂交来检测不同生长发育阶段和不同的组织部位相关基因的表长发育阶段和不同的组织部位相关基因
10、的表达情况。达情况。实验原理分子杂交Northern杂交是以杂交是以DNA或或RNA为为探针探针，检测，检测RNA链，用于外源基因转录产物特异链，用于外源基因转录产物特异mRNA的检测。的检测。将提取的植物总将提取的植物总RNA或或mRNA用变性凝胶电泳分离，用变性凝胶电泳分离，不同的不同的RNA分子分子将按分子量大小依次排布在凝胶上，将按分子量大小依次排布在凝胶上，将它们将它们原位转移到固相膜原位转移到固相膜上，在适宜的离子强度及上，在适宜的离子强度及温度下，探针与膜上同源序列杂交，形成温度下，探针与膜上同源序列杂交，形成RNA-DNA杂交双链杂交双链。利用探针中的利用探针中的digoxig
11、enin和和anti-digoxigenin-Ap抗抗体结合，再通过碱性磷酸酶体结合，再通过碱性磷酸酶AP与与CDP-star底物作用，底物作用，检测检测CDP-star的化学发光间接进行定量分析。的化学发光间接进行定量分析。若经杂交，样品中无杂交带出现，表明虽然外源基若经杂交，样品中无杂交带出现，表明虽然外源基因已经整合到植物细胞染色体上，但在该取材部位因已经整合到植物细胞染色体上，但在该取材部位及生理状态下该基因并未有效表达。及生理状态下该基因并未有效表达。实验原理Northern杂交实验原理RNA提取细胞破碎，核酸溶出细胞破碎，核酸溶出液氮速冻后，对植物组织进行液氮速冻后，对植物组织进行
12、研磨研磨可以破碎细胞。可以破碎细胞。细胞细胞提取液提取液可溶出核酸。可溶出核酸。核酸的纯化核酸的纯化DNA的去除的去除酚、氯仿抽提使酚、氯仿抽提使蛋白质蛋白质变性、沉淀，可去除蛋白。变性、沉淀，可去除蛋白。多糖、次生代谢物多糖、次生代谢物核酸的保护（核酸的保护（内源内源RNA酶酶）低温、苯酚、氯仿、低温、苯酚、氯仿、SDS可以部分抑制可以部分抑制RNA酶的酶的活性，保护活性，保护RNA不被酶解。不被酶解。探针探针探针序列需与感兴趣的基因互补探针序列需与感兴趣的基因互补探针需要有荧光或同位素标记以利于检测探针需要有荧光或同位素标记以利于检测长度一般为长度一般为25-2000bp的的DNA或或RN
13、A实验原理 探针制备gene XPCRprobeU碱性磷酸酶碱性磷酸酶OPO3HPO4OO目标目标mRNASpacerDigoxigenin探针探针Anti-Digoxigenin AntibodyDigoxigenin HaptenAlkaline phosphataseCDP-Star不稳定中间产物分解发光不稳定中间产物分解发光 Northern杂交使用了生物素标记。生物素标记检测是以杂交使用了生物素标记。生物素标记检测是以DIG-dUTP为底物，用随机掺入法进行为底物，用随机掺入法进行DNA标记，标记，PCR合成标记有地合成标记有地高辛的探针，然后加入抗地高辛（高辛的探针，然后加入抗地高
14、辛（DIG）碱性磷酸酶碱性磷酸酶复合物复合物 Anti-DIG-AP的抗体，利用碱性磷酸酶和化学底物作用检测到杂的抗体，利用碱性磷酸酶和化学底物作用检测到杂交的靶交的靶DNA。实验原理信号检测核酸分子杂交又可分为核酸分子杂交又可分为核酸在体外与探针杂交（膜上印迹杂交）核酸在体外与探针杂交（膜上印迹杂交）在细胞内进行杂交（细胞原位杂交）在细胞内进行杂交（细胞原位杂交）分子杂交可以在液相及固相中进行，目前实验室分子杂交可以在液相及固相中进行，目前实验室中广泛采用的是在固相膜上进行的固液杂交。中广泛采用的是在固相膜上进行的固液杂交。膜上印迹杂交膜上印迹杂交将待测的将待测的DNA或或RNA分子经琼脂糖
15、凝胶电泳分分子经琼脂糖凝胶电泳分离后原位转移到固相支持物（硝酸纤维素膜或离后原位转移到固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上尼龙膜）上杂交液（液相）中的探针与印迹到固相膜上的杂交液（液相）中的探针与印迹到固相膜上的特异片段发生杂交特异片段发生杂交实验原理分子杂交的实验涉及到的三项技术分子杂交的实验涉及到的三项技术核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术印迹技术印迹技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交的实验涉及到的三大内容分子杂交的实验涉及到的三大内容制备被检的核酸或蛋白质样品制备被检的核酸或蛋白质样品(或标本或标本)制备杂交探针制备杂交探针印迹及杂交印迹及杂交实验原理实验设备常规设备常规设备移液器，移液
16、器，tip头，离心机头，离心机RNA电泳电泳金属浴，水金属浴，水平凝胶电泳仪，微波炉，平凝胶电泳仪，微波炉，紫外凝胶紫外凝胶成像系统成像系统紫外分光光度计紫外分光光度计转膜过程转膜过程3M滤纸，普通滤纸，尼龙膜，托盘，玻璃板，滤纸，普通滤纸，尼龙膜，托盘，玻璃板，封口膜，封口膜，1000克重物，吸水纸，保鲜膜，手术克重物，吸水纸，保鲜膜，手术刀片，刀柄刀片，刀柄预杂交、杂交预杂交、杂交水浴摇床，杂交袋，封口器水浴摇床，杂交袋，封口器洗膜、信号检测洗膜、信号检测摇床，杂交袋，摇床，杂交袋，X-光片，暗室，暗盒光片，暗室，暗盒实验试剂RNA提取液（提取液（TSE）100 mmol/L Tris-C
17、l pH8.520 mmol/L EDTA pH8.5 200 mmol/L NaCl 1%SDS PVPP、-巯基乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、巯基乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇乙醇琼脂糖、琼脂糖、MOPS、EB 20SSC:3 mol/L NaCl，1.3 mol/L 柠檬酸钠（柠檬酸钠（PH 7.0）鲑精鲑精DNA杂交液：杂交液：7%SDS，50mmol/L Na3PO4（pH 7.0），），2%blocking stock solution，5SSC，50甲酰胺，甲酰胺，0.1%Sodium N-lauroyl Sarcoine Buffer I:0.1 mol/L mal
18、eic acid，0.15 mol/L NaCl（pH 7.5）Buffer II:10%blocking stock solution(Anti-dig)Buffer III:0.1 mol/L Tris，0.1 mol/L NaCl(pH9.5)(CDP-star)Washing 1：2SSC，0.1%SDSWashing 2：0.1SSC，0.1%SDS显影液、定影液显影液、定影液实验试剂转基因烟草叶片转基因烟草叶片烟草的烟草的NLF基因及标记基因基因及标记基因GUS实验材料本部分实验总流程图预杂交、杂交预杂交、杂交预杂交、杂交预杂交、杂交RNARNA提取提取提取提取1 2 3 4 5
19、6 7RNARNA电泳电泳电泳电泳转膜转膜转膜转膜信号检测信号检测信号检测信号检测实验步骤RNA提取植物材料植物材料植物材料植物材料液氮研磨液氮研磨液氮研磨液氮研磨抽提液抽提液抽提液抽提液混匀混匀混匀混匀酚酚酚酚/氯仿氯仿氯仿氯仿抽提抽提抽提抽提水层水层水层水层中间层中间层中间层中间层有机层有机层有机层有机层加入异丙醇沉淀加入异丙醇沉淀加入异丙醇沉淀加入异丙醇沉淀干燥干燥干燥干燥水融水融水融水融反复抽提反复抽提反复抽提反复抽提实验步骤RNA提取向向1.5 mL 离心管中加入离心管中加入700 L RNA提取液，提取液，35L的的-巯基乙醇巯基乙醇（终浓度（终浓度5%），适量），适量PVPP。取
20、适量材料，在液氮充分研磨成粉末后，装入离心管中，用力充取适量材料，在液氮充分研磨成粉末后，装入离心管中，用力充分混匀。分混匀。加入苯酚加入苯酚/氯仿氯仿/异戊醇（异戊醇（25:24:1）各）各350L，混匀，混匀10min，4 8000rpm离心离心10min。取上清，加入等体积的氯仿取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇（异戊醇（24:1），摇床震荡），摇床震荡10min，4 8000rpm离心离心10min。取上清，加入等体积的异丙醇和取上清，加入等体积的异丙醇和1/2体积的体积的1.2 mol/L NaCl，充分，充分混匀。混匀。-20放置放置30min后后4，12000 rpm离心离心10
21、min。弃上清，弃上清，70%乙醇洗沉淀，离心，乙醇洗沉淀，离心，412000 rpm离心离心5 min。弃上清，通风橱内干燥沉淀。弃上清，通风橱内干燥沉淀。沉淀溶于沉淀溶于20 L灭菌水中，备用。灭菌水中，备用。实验步骤RNA浓度检测RNA浓度测定浓度测定取取1ul RNA样品，加水样品，加水199ul后读取后读取260nm处的吸光度值处的吸光度值260nm处的吸光度值相当于处的吸光度值相当于40g/ml单链单链RNA，以此来计算样品含量。，以此来计算样品含量。260nm和和280nm读数比值（读数比值（A260/A280）可）可反映核酸的纯度反映核酸的纯度纯品的纯品的A260/A280的值
22、为的值为2.0，低于低于A260/A280，有蛋白质或酚的污染。，有蛋白质或酚的污染。实验步骤RNA浓度检测实验步骤RNA电泳RNA变性处理变性处理1ul RNA样品加入样品加入2.5ul 上样缓冲液，混匀上样缓冲液，混匀后后65温育温育5-10min置于冰上冷却置于冰上冷却检测检测RNA的凝胶配制的凝胶配制MOPS甲醛甲醛电泳缓冲液为电泳缓冲液为1M0PS 用透明胶带将胶板的两端封好。用透明胶带将胶板的两端封好。配制配制0.8%的琼脂糖凝胶（的琼脂糖凝胶（0.16g琼脂糖琼脂糖于于50ml三角瓶中三角瓶中，加入，加入1MOPS 20ml），在微波炉中加热至琼脂糖溶，在微波炉中加热至琼脂糖溶解
23、。解。10MOPS（MOPS 0.2M，NaAC 50mM，EDTA 10mM，pH7.0）待溶液冷却至待溶液冷却至60左右，加入左右，加入1ml甲醛，甲醛，2ul溴化乙锭充分混匀。溴化乙锭充分混匀。放置合适大小的梳子，将温热的琼脂放置合适大小的梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在3-5 mm之间，大约需要凝固之间，大约需要凝固20min。实验步骤RNA电泳实验步骤Northern 杂交流程1 2 3 4 5 6 7实验步骤RNA浓度的测定及调整浓度的测定及调整对提取的总对提取的总RNA进行含量测定（进行含量测定（CTAB法）。法）。根据测定的吸光度根据测
24、定的吸光度(A260)进行浓度的调整和稀释进行浓度的调整和稀释（OD26040g/ml)。一般调节总。一般调节总RNA的浓度到的浓度到1 ug/uL。要求上样量一致。要求上样量一致。电泳电泳制备大板胶。用制备大板胶。用15ug样品进行样品进行甲醛变性胶甲醛变性胶电泳电泳(0.8%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶)，电压为，电压为50V，5h，低电压长时间电泳，使各分子量的，低电压长时间电泳，使各分子量的mRNA充充分分开。紫外凝胶成像检测电泳效果。分分开。紫外凝胶成像检测电泳效果。转膜转膜将电泳好的胶，切去上样孔、两边至合适的大小，放于用将电泳好的胶，切去上样孔、两边至合适的大小，放于用20SSC润湿的，
25、无气泡的普通滤纸上，依次放上与胶等大的醋润湿的，无气泡的普通滤纸上，依次放上与胶等大的醋酸纤维膜，酸纤维膜，3MM滤纸，用玻璃棒或试管轻轻地赶气泡。用封口滤纸，用玻璃棒或试管轻轻地赶气泡。用封口膜封边，放上叠好的吸水纸，压上约膜封边，放上叠好的吸水纸，压上约1000 g的重物。的重物。烘干烘干转膜过夜后，取出尼龙膜，用铅笔标记上样孔、编号，置于转膜过夜后，取出尼龙膜，用铅笔标记上样孔、编号，置于50烘干烘干30min。交联交联短波紫外线固定短波紫外线固定30s。核酸分子中的部分胸腺嘧啶残基与膜上带正电荷的氨基基核酸分子中的部分胸腺嘧啶残基与膜上带正电荷的氨基基团相互交联，从而使结合更加牢固团相
26、互交联，从而使结合更加牢固 预杂交预杂交使非特异性使非特异性DNA分子及其它高分子化合物不与待测的分子及其它高分子化合物不与待测的RNA分子杂交，从而使待测的分子杂交，从而使待测的RNA分子在杂交时能与探针进行分子在杂交时能与探针进行特异性结合。特异性结合。鲑精鲑精DNA 100，变性，变性5min，之后冰上备用，之后冰上备用将结合了将结合了RNA的硝酸纤维素膜置于杂交袋内并加入的硝酸纤维素膜置于杂交袋内并加入5ml预预杂交液，杂交液，25ul变性好的鲑精变性好的鲑精DNA，排除袋内的气泡后，封，排除袋内的气泡后，封口，口，50恒温水浴，震荡恒温水浴，震荡1h。杂交杂交在预杂交袋中加入变性好的
27、的在预杂交袋中加入变性好的的探针探针5uL，赶气泡，封袋，赶气泡，封袋，50水浴震荡过夜。水浴震荡过夜。实验步骤实验步骤转膜 实验步骤转膜琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶醋酸纤维素膜醋酸纤维素膜 预杂交预杂交buffer中含有中含有 blocking reagents能占据膜上的可结合位点能占据膜上的可结合位点实验步骤实验步骤杂交实验步骤加入抗体Anti-Dig实验步骤加入发光底物CDP-STAR实验步骤洗膜X光片的曝光光片的曝光将封好的膜放在暗盒中，暗室中在其上放置好将封好的膜放在暗盒中，暗室中在其上放置好X光片，盖好暗盒，光片，盖好暗盒，X光片曝光光片曝光45min。显影液、定影液冲洗显影液、定影液冲
28、洗X光片。光片。观察、分析杂交结果。观察、分析杂交结果。实验步骤信号检测注意事项RNA提取中要特别注意防止提取中要特别注意防止RNA的降解。注意器具的降解。注意器具的消毒，实验过程中带手套，减少说话和走动等防的消毒，实验过程中带手套，减少说话和走动等防止止RNase的污染，来保证的污染，来保证RNA不被降解。不被降解。准确调节总准确调节总RNA的浓度，保证上样的质、量。的浓度，保证上样的质、量。低电压长时间电泳，以保证杂交质量。低电压长时间电泳，以保证杂交质量。转膜时应该使所有的转膜时应该使所有的RNA分子都转移到尼龙膜上，分子都转移到尼龙膜上，才能够保证杂交结果的准确性。才能够保证杂交结果的
29、准确性。掌握紫外固定的时间，时间过长会造成核酸的断裂。掌握紫外固定的时间，时间过长会造成核酸的断裂。保证杂交时间和探针的加入量。保证杂交时间和探针的加入量。保证洗膜的质量，保证杂质的洗脱。保证洗膜的质量，保证杂质的洗脱。严格控制曝光时间以得到清晰的杂交结果。严格控制曝光时间以得到清晰的杂交结果。作业按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验原理、实验材料、实验用品及药品、实验步原理、实验材料、实验用品及药品、实验步骤、实验结果。骤、实验结果。阐述阐述Northern 杂交的基本原理。杂交的基本原理。分析实验结果。分析实验结果。Northern 杂交时注意哪些问题才能够得到好杂交时注意哪些问题才能够得到好的杂交结果？的杂交结果？实验结果与分析杂交结果杂交结果杂交结果杂交结果1,CK;2,200mM Na2CO3处理2h;3,200mM Na2CO3处理 6h;4,200mM Na2CO3处理 12h;5,200mM Na2CO3处理 24h;6,200mM Na2CO3处理 48h;7,200mM Na2CO3处理 72h;8,天然盐碱地End!