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1、第四节第四节 微生物细胞工程微生物细胞工程微生物是一个相当笼统的概念，既包括细菌、放线菌这样微生物是一个相当笼统的概念，既包括细菌、放线菌这样微小的原核生物，又涵盖菇类、霉菌等真核生物。微小的原核生物，又涵盖菇类、霉菌等真核生物。微生物细胞工程微生物细胞工程是指应用微生物细胞进行细胞水平的研究是指应用微生物细胞进行细胞水平的研究和生产。具体和生产。具体内容包括内容包括各种微生物细胞的培养、遗传性状各种微生物细胞的培养、遗传性状的改变、微生物细胞的直接利用以及获得微生物细胞代谢的改变、微生物细胞的直接利用以及获得微生物细胞代谢产物等。产物等。本节仅从细胞工程的角度，概述通过原生质体融合的手段本节
2、仅从细胞工程的角度，概述通过原生质体融合的手段改造微生物种性、创造新变种的途径与方法。改造微生物种性、创造新变种的途径与方法。一一 微生物细胞融合微生物细胞融合早在早在1958年，年，冈田善雄冈田善雄发现，用紫外线灭活的仙台病毒可发现，用紫外线灭活的仙台病毒可以诱发艾氏腹水瘤细胞融合产生多核体。以诱发艾氏腹水瘤细胞融合产生多核体。1976年巨大芽抱杆菌、枯草杆菌、裂殖酵母等原生质体融年巨大芽抱杆菌、枯草杆菌、裂殖酵母等原生质体融合取得成功，构巢曲霉和烟曲霉、娄地青霉和产黄青霉等合取得成功，构巢曲霉和烟曲霉、娄地青霉和产黄青霉等真菌种间原生质体融合也获得成功。真菌种间原生质体融合也获得成功。（一
3、）（一）微生物细胞微生物细胞融合工艺融合工艺菌种选择菌种选择扩大培养扩大培养大量菌体细胞大量菌体细胞高渗溶液高渗溶液(SMM(SMM(SMM(SMM液、液、液、液、DPDPDPDP液液液液)脱壁酶脱壁酶脱壁酶脱壁酶(蜗牛酶、溶菌酶蜗牛酶、溶菌酶蜗牛酶、溶菌酶蜗牛酶、溶菌酶)原生质体原生质体原生质体原生质体融合剂融合剂融合剂融合剂(PEG)(PEG)(PEG)(PEG)原生质体融合原生质体融合原生质体融合原生质体融合去融合剂去融合剂去融合剂去融合剂融合原生质体融合原生质体融合原生质体融合原生质体培养基培养基培养基培养基细胞壁再生细胞壁再生细胞壁再生细胞壁再生菌落繁殖菌落繁殖菌落繁殖菌落繁殖融合体
4、筛选融合体筛选融合体筛选融合体筛选（二）（二）影响微生物细胞融合的因素影响微生物细胞融合的因素微生物原生质体融合受下列因素的影响：微生物原生质体融合受下列因素的影响：参与融合菌株的遗传性状参与融合菌株的遗传性状。参与融合的菌株一般都需要参与融合的菌株一般都需要有选择标记有选择标记，标记主要通过，标记主要通过诱变诱变获得。在获得。在进行融合时，应先测定各个标记的自发回复突变率。若回复突变率过进行融合时，应先测定各个标记的自发回复突变率。若回复突变率过高，则不宜作为选择标记。高，则不宜作为选择标记。制备原生质体的菌龄。制备原生质体的菌龄。制备细菌原生质体应取制备细菌原生质体应取对数生长中期菌龄的细
5、胞对数生长中期菌龄的细胞，因为此时的细胞壁，因为此时的细胞壁中肽聚糖的含量最低，对溶菌酶也最敏感。中肽聚糖的含量最低，对溶菌酶也最敏感。培养基成分。培养基成分。细菌在不同的培养基中培养对溶菌酶的敏感程度不一。细菌在不同的培养基中培养对溶菌酶的敏感程度不一。培养培养用基本培养基用基本培养基比用完全培养基效果更好。比用完全培养基效果更好。细胞的前处理。细胞的前处理。由于细胞壁结构的差异，同样是革兰氏阳性菌，对溶菌酶的由于细胞壁结构的差异，同样是革兰氏阳性菌，对溶菌酶的敏感程度也不一样。芽孢杆菌对溶菌酶的敏感性大于棒状杆敏感程度也不一样。芽孢杆菌对溶菌酶的敏感性大于棒状杆菌。在棒状杆菌制备原生质体前
6、，菌体前培养需要菌。在棒状杆菌制备原生质体前，菌体前培养需要添加少量添加少量青霉素青霉素以阻止肽聚糖合成过程中的转肽作用，从而削弱细胞以阻止肽聚糖合成过程中的转肽作用，从而削弱细胞壁对溶菌酶的抗性。壁对溶菌酶的抗性。二二 原核细胞的原生质体融合原核细胞的原生质体融合细菌是最典型的原核单细胞生物，细胞外有一层成分不同、细菌是最典型的原核单细胞生物，细胞外有一层成分不同、结构相异的坚韧细胞壁，形成抵抗不良环境因素的天然屏结构相异的坚韧细胞壁，形成抵抗不良环境因素的天然屏障。障。根据细胞壁成分的差异将细菌分成根据细胞壁成分的差异将细菌分成革兰氏阳性细菌和革兰革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌氏阴性细菌两
7、大类。两大类。前者前者肽聚糖肽聚糖约占细胞壁成分的约占细胞壁成分的90，而后者的细胞壁上除，而后者的细胞壁上除了部分了部分肽聚糖肽聚糖外还有大量的外还有大量的脂多糖脂多糖等有机大分子。由此决等有机大分子。由此决定了它们对溶菌酶的敏感性有很大差异。定了它们对溶菌酶的敏感性有很大差异。溶菌酶溶菌酶广泛存在于动植物、微生物细胞及其分泌物中。它广泛存在于动植物、微生物细胞及其分泌物中。它能能特异地切开肽聚糖中特异地切开肽聚糖中N-乙酰胞壁酸与乙酰胞壁酸与N-乙酰葡萄糖胺之乙酰葡萄糖胺之间的间的-1，4糖苷键糖苷键，从而使革兰氏，从而使革兰氏阳性菌阳性菌细胞壁溶解。细胞壁溶解。由于革兰氏由于革兰氏阴性细
8、菌阴性细菌细胞壁组成成分的差异，处理革兰氏细胞壁组成成分的差异，处理革兰氏阴性菌时，除了阴性菌时，除了溶菌酶溶菌酶外，一般还要添加适量的外，一般还要添加适量的EDTA(乙乙二胺四乙酸二胺四乙酸)，才能除去它们的细胞壁，制得原生质体或，才能除去它们的细胞壁，制得原生质体或原生质球。原生质球。三三 真菌的原生质体融合真菌的原生质体融合真菌主要包括单细胞的酵母类和多细胞菌丝类。真菌主要包括单细胞的酵母类和多细胞菌丝类。降解真菌细胞壁、制备原生质体是融合的关键降解真菌细胞壁、制备原生质体是融合的关键。真菌的细胞壁成分较复杂真菌的细胞壁成分较复杂，主要由几丁质及各类葡聚糖构，主要由几丁质及各类葡聚糖构成
9、纤维网状结构，夹杂着少量的甘露糖、蛋白质和脂类。成纤维网状结构，夹杂着少量的甘露糖、蛋白质和脂类。因此可在含有渗透压稳定剂的反应介质中加入因此可在含有渗透压稳定剂的反应介质中加入消解酶消解酶进行进行酶解，也可用酶解，也可用蜗牛复合酶蜗牛复合酶进行处理，原生质体的得率都在进行处理，原生质体的得率都在90以上。此外还有以上。此外还有纤维素酶、几丁质酶、新酶纤维素酶、几丁质酶、新酶等。等。真菌原生质体融合的要点与前述细胞融合类似，多以真菌原生质体融合的要点与前述细胞融合类似，多以PEG为融合剂，在特异的选择培养基上筛选融合子。为融合剂，在特异的选择培养基上筛选融合子。但真菌多为单倍体，但真菌多为单倍体，只有形成真正单倍重组体的融合子才只有形成真正单倍重组体的融合子才能稳定传代能稳定传代；杂合双倍体和异核体的融合子遗传特性不稳；杂合双倍体和异核体的融合子遗传特性不稳定，需经多代考证才能最后断定是否为真正的杂合细胞。定，需经多代考证才能最后断定是否为真正的杂合细胞。思考题1微生物细胞工程的主要研究内容微生物细胞工程的主要研究内容2微生物细胞融合工艺微生物细胞融合工艺