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1、微生物细胞(xbo)的特点 微生物作为可以独立存在的个体，其生长特点、代谢的特点与植物、动物有着显著的区别(qbi)。 一般情况下，微生物由其自身完成其基本功能；第1页/共33页第一页，共33页。微生物菌种选育(xun y)的目的和意义菌种选育的目的生产科研提高产量改进质量合成新化合物简化生产工艺适应原材料缩短生产周期改变产品组分了解菌种遗传背景增加菌种遗传标记分析生物合成机制提供分子遗传学研究材料第2页/共33页第二页，共33页。微生物细胞(xbo)的改造育种 传统菌种选育技术( jsh) 杂交和原生质体融合技术( jsh) 基因工程 定向进化第3页/共33页第三页，共33页。传统菌种选育(
2、xun y)技术 自发突变(tbin)育种 诱变育种第4页/共33页第四页，共33页。微生物突变(tbin)类型 第5页/共33页第五页，共33页。遗传变异类型(lixng)遗传变异类型细胞核细胞质质粒、噬菌体和线粒体DNADNA体外重组转化或转染进入宿主细胞中DNADNA染色体数目（单、双、多倍体和非整倍体）突变重组（转化、转导、接合和融合）点突变（DNADNA分子中某一个碱基发生顺序或数目的变化所致）区段突变（染色体或DNADNA片段的缺失、易位、倒位、替换、添加等造成的突变）第6页/共33页第六页，共33页。自发(zf)突变育种 从生产(shngchn)中育种 定向培育优良菌株卡介苗的获
3、得吡哆醇高产菌株的获得第7页/共33页第七页，共33页。诱变(yu bin)育种 诱变(yu bin)育种的基本环节第8页/共33页第八页，共33页。谷氨酸棒杆菌的野生型（左）和dapD突变株（右）细胞(xbo)的电镜照片 第9页/共33页第九页，共33页。诱变育种(y zhng)中的几个原则 挑选优良的出发菌株 单一遗传纯菌株 选用对诱变剂敏感的菌株 选用有应用前景的菌株 来自生产中的自发突变菌株 选择(xunz)简单有效的诱变剂及合适剂量 处理单细胞或单孢子悬液 复合诱变剂的处理第10页/共33页第十页，共33页。营养(yngyng)缺陷型的筛选方法 1、诱变(yu bin)处理 2、淘汰
4、野生型 抗生素法 青霉素 制霉菌素(抑制甾醇的合成) 菌丝过滤法(适于真菌和放线菌) 3、检出缺陷型 4、鉴定缺陷型第11页/共33页第十一页，共33页。检出缺陷(quxin)型基本(jbn)培养基基本(jbn)培养基(含菌)基本培养基完全或补充培养基夹层培养法第12页/共33页第十二页，共33页。限量(xinling)补充法1%蛋白(dnbi)胨大，野小，变检出缺陷(quxin)型第13页/共33页第十三页，共33页。逐个(zhg)检出法完全(wnqun)培养基基本(jbn)培养基完全培养基检出缺陷型第14页/共33页第十四页，共33页。培养完全(wnqun)培养基基本(jbn)培养基影印(
5、yngyn)培养法检出缺陷型第15页/共33页第十五页，共33页。鉴定(jindng)缺陷型含菌基本(jbn)培养基含营养物滤纸(lzh)片生长谱法生长谱法(氨基酸、维生素、碱基等)第16页/共33页第十六页，共33页。各种化学诱变剂常用浓度和处理(chl)时间 诱变剂浓度处理时间（min）缓冲液终止反应方法效 应备 注亚硝酸（液体）0.010.1M510pH4.5,1M醋酸缓冲液pH8.6,0.07M Na2HPO4溶液脱去碱基中的氨基后引起碱基转换，造成突变有致癌作用，小心操作硫酸二乙酯（液体）o.51%(V/V)孢子1530，菌丝1824hpH7.0磷酸缓冲液Na2S2O3或大量稀释诱变
6、作用较强，杀菌作用较弱，使DNA的碱基和磷酸基发生烷化作用，引起突变。不溶于水，加微量乙醇可溶解亚硝基胍（固体）0.11.0mg/ml，孢子3mg/ml(高浓度及碱性pH)孢子30120,菌丝90120pH6.0, 1M磷酸或醋酸缓冲液或三羟基甲基氨基甲烷-缩苹果酸缓冲液大量稀释pH低于55.5时，同硫酸二乙酯形成亚硝酸，碱性条件下产生重氮甲烷，引起杀菌和变异有致癌作用，小心操作，避光保存，易产生突变群第17页/共33页第十七页，共33页。诱变剂使用(shyng)续1氮芥（液状物）0.11mg/ml密闭反应510甘氨酸或大量稀释烷化剂，引起染色体畸变与NaHCO3作用即释放N 芥子气糜烂性毒气
7、，小心操作乙烯亚胺（液体）1:1001:100028或低温处理3060稀释烷化剂，高浓度效果较好有剧毒，易燃，可在4冰箱小心操作，避光保存盐酸羟胺（液体）0.15%数小时或生长过程中诱变稀释与胞嘧啶作用产生转换，引起CGAT突变有损健康，注意安全操作氯化锂（白色粉末）0.30.5%加入培养基中，在生长过程中诱变稀释需与紫外线、亚硝酸、硫酸二乙酯等复合处理才有效易溶于水，易潮解5-溴鸟嘧啶（白色粉末）2030mg/ml与孢子悬浮液混合振荡培养，处理一定时间后，稀释涂皿稀释有机体缺乏胸腺嘧啶时较易掺入DNA中引起突变，能诱发正突变与回复突变碱基类似物第18页/共33页第十八页，共33页。微生物原生
8、质体融合(rngh)第19页/共33页第十九页，共33页。 原生质体融合(rngh)-第20页/共33页第二十页，共33页。 原生质体制(tzh)备：（1） 根据材料选择破壁酶 细菌：溶菌酶 真菌: Zymolyase-20T，5000T， Novozyme 234，蜗牛酶，纤维素酶， 溶壁酶，崩溃酶， 几丁质酶等（2） 缓冲液（3）酶解条件 温度(wnd)、时间、酶成分配比等第21页/共33页第二十一页，共33页。 融合(rngh)电融合技术： 原生质体在电场中，由于(yuy)加直流脉冲，膜被击穿，导致融合的发生。特点： 空间定向，时间同步，显微镜监视化学因子诱导融合： 聚乙二醇（polye
9、theneglycol, PEG） Ca 2+ 、Mg 2+ 等阳离子 pH第22页/共33页第二十二页，共33页。再生(zishng) 恢复细胞(xbo)原貌，能够再生长 高渗培养基 蔗糖 （0.6 M） 山梨醇 (1.0 M) 氯化钠 (0.7 M)第23页/共33页第二十三页，共33页。基因工程(jyn gngchng)一、概念 基因工程是指在基因水平上的遗传工程，即用人工方法将所需要的某一供体生物的遗传物质DNA大分子提取出来，在离体条件下进行切割后，把它和载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，以让外来的遗传物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种
10、崭新的育种技术。所以基因工种是人们在分子生物学理论指导下的一种自觉的能象工程一样(yyng)可事先设计和控制的育种新技术，是人工的离体的分子水平上的一种遗传重组技术，是一种可完全超远缘杂交的育种新技术，因而是一种最新、最有前途的定向育种新技术。第24页/共33页第二十四页，共33页。二、主要(zhyo)操作过程 （一）基因分离 1、分别提取供体细胞（各种( zhn)生物都可选用）的DNA与作为载体的松驰型细菌质粒（也可用噬菌体或病毒作载体）。 2、根据“工程蓝图”的要求，在供体DNA中加入专一性很强的限制性核酸内切酶，从而获得带有特定基因并露出粘性末端的DNA单链部分（必须时可人工合成粘性末端
11、）。第25页/共33页第二十五页，共33页。（二）体外重组(zhn z) 把供体细胞DNA片段与质粒DNA片段放在试管中，在较低的温度（56）下混合“退火”。由于每一种限制性内切酶所切断的双链DNA片段的粘接末端有相同的核苷酸组成，所以当两者混在一起时，凡粘接末端上碱基互补片段就会因氢键的作用而彼此吸引(xyn)，重新形成双链，这时在外加的连接酶作用下，供体的DNA与质粒DNA片段相连，形成了一个完整复制能力的环状重组体“杂种质粒”。 第26页/共33页第二十六页，共33页。（三）重组(zhn z)载体导入受体细胞内（四）复制、表达 这种杂种(zzhng)质粒进入受体细胞后，通过自我复制而扩增
12、，并使受体细胞表达为供体细胞所固有的部分遗传性状，这种受体菌，即成为“工程菌”。 第27页/共33页第二十七页，共33页。（五）筛选(shixun)、繁殖 质粒，或所带DNA能表达产生一定(ydng)产物，可通过一选择性培养基或试剂鉴别出来。 原来100000g胰脏仅能提取34g胰岛素，而用工程菌发酵生产，只要几升发酵液便可取得同样数量的产品。第28页/共33页第二十八页，共33页。分子(fnz)育种 容错(rn cu)PCR DNA shuffling第29页/共33页第二十九页，共33页。容错(rn cu)PCR（Error-prone Polymerase Chain Reaction,
13、 ep-PCR） Taq聚合酶是从一株耐热(nai r)细菌Thermus aquaticus中分离获得，由于它缺乏35的校正活性，因此在PCR过程中会插入一些错误的碱基。在通常情况下，发生错误碱基插入的频率为0.12x10-4。通过改变PCR的一些反应条件，可以增加这种错误碱基插入的频率，从而可用来实现基因的定向进化。 第30页/共33页第三十页，共33页。在PCR系统中可用于增加碱基错误(cuw)插入频率的方法 1. 增加MgCl2浓度；2. 加入一定(ydng)浓度的MnCl2；3. 在PCR中采用不平衡的核苷酸浓度；4. 核苷酸类似物的三磷酸衍生物的混合物. 第31页/共33页第三十一页，共33页。DNA shufflingvDNA Shuffling 技术v一个或多个不同来源的基因切成片段v无引物PCR扩增v筛选一个或多个所需的性状v重复DNA Shufflingv获得高百分比的功能基因库v主要优点：大大减少与鉴别所需候选产物有 关的成本和时间v v难点：设计(shj)一个高效的分析和筛选方法 第32页/共33页第三十二页，共33页。感谢您的观看(gunkn)！第33页/共33页第三十三页，共33页。