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1、L/O/G/O仪器分析法仪器分析法仪器分析法仪器分析法紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 Contents：概述概述generalization 光的吸收定律光的吸收定律朗伯朗伯比尔定律比尔定律 紫外紫外可见分光光度计可见分光光度计 分光光度法分析条件的选择分光光度法分析条件的选择 41232.1 概述概述generalization 分分分分光光光光光光光光度度度度法法法法是是基基于于物物质质分分子子对对光光的的选选择择性性吸吸收收而而建建立立起起来来的的分分析析方方法法。按按物物质质吸吸收收光光的的波波长长不不同同，可可分分为为可可见见分分光光光光度度
2、法法、紫紫外外分分光光光光度度法法及及红红外外分分光光度法。光光度法。特点：特点：*灵灵敏敏度度较较高高，适适用用于于微微量量组组分分的的测测定定。但但相相对对误误差差较大。较大。*具具有有操操作作方方便便、仪仪器器设设备备简简单单、灵灵敏敏度度和和选选择择性性较较好等优点，为常规的仪器分析方法。好等优点，为常规的仪器分析方法。紫外紫外可见分光光度法的局限性可见分光光度法的局限性:(Disadvantage of UV-Vis Spectrophotometers)有些有机化合物在紫外可见光区没有吸收有些有机化合物在紫外可见光区没有吸收谱带谱带,更有个别的化合物紫外可见吸收光谱图大更有个别的化
3、合物紫外可见吸收光谱图大致相似。所以根据紫外可见光谱图不能完全决致相似。所以根据紫外可见光谱图不能完全决定这些物质的分子结构。定这些物质的分子结构。一分子吸收光谱(molecular absorption spectrum)在分子中存在着电子的运动，以及组成分子的各原子间的振动和分子作为整体的转动。分子的总能量可以认为等于这三种运动能量之和。即：E分子=E电子+E振动+E转动 如果用 E电子，E振动以及E转动表示各能级差，则：E电子 E振动E转动 由分子中的电子能级、振动能级和转动能级由分子中的电子能级、振动能级和转动能级跃迁产生的光谱分别称为跃迁产生的光谱分别称为电子光谱、振动光谱和电子光谱
4、、振动光谱和转动光谱转动光谱。其对应的波谱区范围如下：。其对应的波谱区范围如下：Ee Ev Er 电子光谱电子光谱 振动光谱振动光谱 转动光谱转动光谱 紫外可见光紫外可见光 近红外、中红外区近红外、中红外区 远红外、微波区远红外、微波区 由于分子选择性的吸收了某些波长的光，所以这些由于分子选择性的吸收了某些波长的光，所以这些光的能量就会降低光的能量就会降低，将这些波长的光及其所吸收的能量，将这些波长的光及其所吸收的能量按一定顺序排列起来，就得到了分子的吸收光谱。按一定顺序排列起来，就得到了分子的吸收光谱。了解紫外了解紫外可见吸收光可见吸收光谱图：谱图：最大吸收峰：最大吸收峰：最大吸收波长最大吸
5、收波长 次峰：次峰：最小吸收波长最小吸收波长 末端吸收末端吸收 二有机化合物的紫外二有机化合物的紫外可见吸收光谱可见吸收光谱 UV-Vis absorption spectrum of organic compounds 与紫外与紫外与紫外与紫外-可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成单键的单键的单键的单键的 电子电子电子电子、形成、形成、形成、形成双键的双键的双键的双键的 电子电子电子电子以及未参与成键的以及未参与成键的以及未参与成键的以及未参与成键的n n电子电子电子电子(孤对电子孤对
6、电子孤对电子孤对电子）。跃迁类型有：跃迁类型有：跃迁类型有：跃迁类型有：*、n n *、*、n n *四种。四种。四种。四种。C H H O o ooo=o=n有机分子能级跃迁有机分子能级跃迁 有机分子包括有机分子包括:成键轨道成键轨道 、；反键轨道反键轨道 *、*非键轨道非键轨道 n 例如例如 CH2O分子的轨道：分子的轨道：*n*n*n 1、饱合有机化合物饱合有机化合物的电子跃迁类型为的电子跃迁类型为*，跃迁所需的能量最大，跃迁所需的能量最大，吸收峰一般出现在远紫吸收峰一般出现在远紫外区外区，吸收峰低于，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。，实际应用价值不大。如乙烷的最大吸收峰在如乙烷
7、的最大吸收峰在135nm处。处。2、n*跃迁，所需的能量比跃迁，所需的能量比*跃迁所需的能量少，跃迁所需的能量少，吸收光谱的波长一般在吸收光谱的波长一般在150250nm处。一般发生在有机化合处。一般发生在有机化合物中的物中的H被杂原子取代后的产物中，如碘代乙烷的吸收峰在被杂原子取代后的产物中，如碘代乙烷的吸收峰在259nm处。处。这种能使吸收峰向长波方向移动而产生这种能使吸收峰向长波方向移动而产生红移红移现象的原子团现象的原子团称为称为助色团助色团。红移与蓝移红移与蓝移红移与蓝移红移与蓝移在有机化合物中，常常由于取代基的变更或溶在有机化合物中，常常由于取代基的变更或溶剂的改变，使化合物的最大
8、吸收包产发生移动，向长波方向移剂的改变，使化合物的最大吸收包产发生移动，向长波方向移动称为红移动，向短波方向移动称为蓝移。动称为红移动，向短波方向移动称为蓝移。3、不饱和有机化合物的电子跃迁类型为、不饱和有机化合物的电子跃迁类型为n*，*跃迁，所需的能量较低，吸收峰跃迁，所需的能量较低，吸收峰一般大于一般大于200nm。这两类跃迁都要求有机化合物的分子中含这两类跃迁都要求有机化合物的分子中含有不饱和键的官能团，这种含有不饱和键的基有不饱和键的官能团，这种含有不饱和键的基团称为团称为生色团生色团。在以上几种跃迁中，只有在以上几种跃迁中，只有-*和和n-*两两种跃迁的能量小，相应波长出现在种跃迁的
9、能量小，相应波长出现在近紫外区近紫外区甚至可见光区，甚至可见光区，且对光的吸收强烈，是我们且对光的吸收强烈，是我们研究的重点。研究的重点。v4.无机化合物的紫外无机化合物的紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱v主要有两种方式：主要有两种方式：（1）电荷迁移跃迁电荷迁移跃迁 电荷在配合物的中心离子与配位体电荷在配合物的中心离子与配位体之间进行跃迁（及配合物内在的氧化还原反应）。之间进行跃迁（及配合物内在的氧化还原反应）。（2）配位场跃迁配位场跃迁 对于过渡金属元素而言，核外层的电对于过渡金属元素而言，核外层的电子可以在不同的能级轨道间跃迁，如子可以在不同的能级轨道间跃迁，如f-f;d-d跃迁。跃迁。v
10、5.影响紫外影响紫外可见吸收光谱的因素可见吸收光谱的因素v影响：谱带位移；谱带强度的变化等。影响：谱带位移；谱带强度的变化等。v谱带位移谱带位移：表现为物质的最大吸收波长发生移动，包：表现为物质的最大吸收波长发生移动，包括有红移和蓝移。括有红移和蓝移。v谱带强度的变化谱带强度的变化：包括增色效应（吸收强度增加）与：包括增色效应（吸收强度增加）与减色效应（吸收强度减小）。减色效应（吸收强度减小）。v影响的因素：影响的因素：（1）共轭效应的影响）共轭效应的影响A：电子共轭体系增大，最大吸收波长红移，吸收强电子共轭体系增大，最大吸收波长红移，吸收强度也增加。这是由于共轭效应，使得电子离域到多个度也增
11、加。这是由于共轭效应，使得电子离域到多个原子之间，导致原子之间，导致-*跃迁能量降低。同时跃迁的几跃迁能量降低。同时跃迁的几率也增大，则吸收强度也随之增大。率也增大，则吸收强度也随之增大。B 空间阻碍使共轭体系破坏，最大吸收波长蓝移，吸收空间阻碍使共轭体系破坏，最大吸收波长蓝移，吸收强度减小。强度减小。v（2）取代基的影响）取代基的影响v（3）溶剂的影响）溶剂的影响A 溶剂的极性溶剂的极性不同往往会引起某些化合物吸收光谱的红不同往往会引起某些化合物吸收光谱的红移或蓝移。移或蓝移。B 溶剂的酸度影响溶剂的酸度影响 对于具有酸碱性的被测物质，溶剂对于具有酸碱性的被测物质，溶剂的的pH变化，则溶质的
12、存在形式也发生变化，使分子变化，则溶质的存在形式也发生变化，使分子中共轭效应发生改变，则使吸收红移或蓝移。中共轭效应发生改变，则使吸收红移或蓝移。vC 极限波长极限波长 作为溶剂，在远紫外区都有吸收，而测作为溶剂，在远紫外区都有吸收，而测量通常是在近紫外和可见区，所以溶剂的吸收对溶质量通常是在近紫外和可见区，所以溶剂的吸收对溶质不产生影响，但如果测定是在溶剂的极限波长以下，不产生影响，但如果测定是在溶剂的极限波长以下，则溶剂本身的吸收将影响测定。因此，测定只能在溶则溶剂本身的吸收将影响测定。因此，测定只能在溶剂的极限波长以上进行。剂的极限波长以上进行。2.2 光的吸收定律光的吸收定律Lambe
13、rt-beer定律定律 Light absorption law-Lambert-beer law 光的选择性吸收与物质颜色的关系：光的选择性吸收与物质颜色的关系：1可见光的颜色和互补色：可见光的颜色和互补色：在可见光范围内，不同波长的光的颜色是不同的。在可见光范围内，不同波长的光的颜色是不同的。平常所见的白光（日光、白炽灯光等）是一种平常所见的白光（日光、白炽灯光等）是一种复合光复合光复合光复合光，它是由各种颜色的光按一定比例混合而得的。利用它是由各种颜色的光按一定比例混合而得的。利用棱镜棱镜等分光器可将它分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等等分光器可将它分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等不同
14、颜色的单色光。不同颜色的单色光。白光除了可由所有波长的可见光复合得到外，还白光除了可由所有波长的可见光复合得到外，还可由可由适当的两种颜色的光按一定比例复合适当的两种颜色的光按一定比例复合得到。得到。能复能复合成白光的两种颜色的光叫合成白光的两种颜色的光叫互补色光互补色光。2、物质的颜色与吸收光的关系：当白光照射到、物质的颜色与吸收光的关系：当白光照射到物质上时，如果物质对白光中物质上时，如果物质对白光中某种颜色某种颜色的光产生了选的光产生了选择性的吸收，则物质就会显示出一定的颜色。物质所择性的吸收，则物质就会显示出一定的颜色。物质所显示的颜色是显示的颜色是吸收光的互补色吸收光的互补色。/nm
15、 颜色颜色互补光互补光400-450紫紫黄绿黄绿450-480蓝蓝黄黄480-490绿蓝绿蓝橙橙490-500蓝绿蓝绿红红500-560绿绿红紫红紫560-580黄绿黄绿紫紫580-610黄黄蓝蓝610-650橙橙绿蓝绿蓝650-760红红蓝绿蓝绿物质的颜色与光的关系物质的颜色与光的关系物质的颜色与光的关系物质的颜色与光的关系完全吸收完全吸收完全吸收完全吸收完全透过完全透过完全透过完全透过吸收黄色光吸收黄色光吸收黄色光吸收黄色光光谱示意光谱示意光谱示意光谱示意表观现象示意表观现象示意表观现象示意表观现象示意复合光复合光复合光复合光黑色黑色白色白色蓝色蓝色 单色光单色光单色光单色光(monoch
16、romatic light)(monochromatic light)只具有一种波长的光。只具有一种波长的光。混合光混合光混合光混合光 由两种以上波长组成的光。由两种以上波长组成的光。白白白白光光光光 是是由由红红、橙橙、黄黄、绿绿、青青、蓝蓝、紫紫等等各各种种色色光光按按一定比例混合而成的。一定比例混合而成的。物物物物质质质质的的的的颜颜颜颜色色色色 是是由由于于物物质质对对不不同同波波长长的的光光具具有有选选择择性性的的吸收作用而产生的。吸收作用而产生的。一、朗伯一、朗伯比尔定律比尔定律Lambertbeer law 透光率透光率 （透射比）（透射比）Transmittance透光率定义：
17、透光率定义：T 取值为取值为0.0%100.0%全部吸收全部吸收T=0.0%全部透射全部透射T=100.0%入射光入射光 I0透射光透射光 It透光度、吸光度与溶液浓度及液层宽度的关系透光度、吸光度与溶液浓度及液层宽度的关系（2-2）溶液浓度与宽度的乘积与吸光度成正比，以上溶液浓度与宽度的乘积与吸光度成正比，以上两式中两式中k是比例系数，与入射光波长、溶液的性质是比例系数，与入射光波长、溶液的性质及温度有关及温度有关。朗伯朗伯-比尔定律比尔定律(A=Kbc)中的系数中的系数(K)因浓度因浓度(c)所取的单位不同，有两种表示方式：所取的单位不同，有两种表示方式：当当c的单位为的单位为gL-1 b
18、的单位为的单位为cm时，时，k以以a表示，称为表示，称为吸光系数吸光系数(absorption coefficient)，其单位为，其单位为Lg-1cm-1，此时式（，此时式（2-2）变为）变为 c的单位为的单位为molL-1 b的单位为的单位为cm 这时这时k常用常用 表示。称为表示。称为摩尔吸光系数摩尔吸光系数(molar absorptivity)，其单位为，其单位为Lmol-1cm-1 A=bc例例 题：题：用邻二氮菲分光光度法测铁。已知溶液中用邻二氮菲分光光度法测铁。已知溶液中Fe2+的浓度为的浓度为500 g L-1，液层厚度为，液层厚度为2cm，在，在508nm处测得透射比为处测
19、得透射比为0.645。计算：吸光系数计算：吸光系数 a、摩尔吸收系数摩尔吸收系数 (MFe=55.85 g mol-1)解：解：A=-lgT=-lg0.645=0.190（三位有效数字）（三位有效数字）c=500 g L-1=5.0010-4 g L-1 b=2cm 定定量量分分析析时时，通通常常液液层层厚厚度度是是相相同同的的，按按照照比比尔尔定定律律，浓浓度度与与吸吸光光度度之之间间的的关关系系应应该该是是一一条条通通过过直直角角坐坐标标原原点点的的直直线线。但但在在实实际际工工作作中中，往往往往会会偏偏离离线线性性而而发发生生弯弯曲曲。若若在在弯弯曲曲部部分分进进行行定定量量，将将产产生
20、生较较大大的测定误差的测定误差二二 偏离朗伯一比尔定律的因素偏离朗伯一比尔定律的因素 朗朗伯伯一一比比尔尔定定律律只只对对一一定定波波长长的的单单色色光光才才能能成成立立，但但在在实实际际工工作作中中，即即使使质质量量较较好好的的分分光光光光度度计计所所得得的的入入射射光光，仍仍然然具具有有一一定定波波长长范范围围的的波波带带宽宽度度。在在这这种种情情况况下下，吸吸光光度度与与浓浓度度并并不不完完全全成成直直线线关关系系，因因而而导导致致了了对对朗朗伯伯一一比比尔尔定定律律的的偏偏离离。所所所所得得得得入入入入射射射射光光光光的的的的波波波波长长长长范范范范围越窄，即围越窄，即围越窄，即围越窄
21、，即“单色光单色光单色光单色光”越纯，则偏离越小。越纯，则偏离越小。越纯，则偏离越小。越纯，则偏离越小。（一）非单色光所引起的偏离（一）非单色光所引起的偏离 （二）非吸收作用引起的偏离（二）非吸收作用引起的偏离 非吸收作用引起的对非吸收作用引起的对朗伯一比尔定律的偏离，主要有朗伯一比尔定律的偏离，主要有散射效应和荧光效应，一般情况下荧光效应对分光光度法散射效应和荧光效应，一般情况下荧光效应对分光光度法产生的影响较小。产生的影响较小。散射效应：朗伯一比尔定律散射效应：朗伯一比尔定律只适用于十分均匀的吸收只适用于十分均匀的吸收体系。体系。当待测液的体系不是很均匀时，入射光通过待测液当待测液的体系不
22、是很均匀时，入射光通过待测液后将产生光的散射而损失，导致吸收体系的透过率减小，后将产生光的散射而损失，导致吸收体系的透过率减小，造成实测吸光值增加造成实测吸光值增加 朗朗伯伯比比尔尔定定律律是是建建立立在在均均匀匀、非非散散射射的的溶溶液液这这个个基基础础上上的的。如如果果介介质质不不均均匀匀，呈呈胶胶体体、乳乳浊浊、悬悬浮浮状状态态，则则入入射射光光除除了了被被吸吸收收外外，还还会会有有反反射射、散散射射的的损损失失，因因而而实实际际测测得得的的吸吸光光度度增增大大，导导致致对对朗伯朗伯比尔定律的偏离比尔定律的偏离荧光效应荧光效应:当入射光通过待测液，若吸光物质分子吸收辐射能当入射光通过待测
23、液，若吸光物质分子吸收辐射能后所产生的激发态分子以发射辐射能的方式回到基态而后所产生的激发态分子以发射辐射能的方式回到基态而发射荧光，结果必然使待测液的透光率相对增大，造成发射荧光，结果必然使待测液的透光率相对增大，造成实测吸光值减小。实测吸光值减小。溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化也会溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化也会引起偏离。其中有色化合物的离解是偏离朗伯引起偏离。其中有色化合物的离解是偏离朗伯比比尔定律的主要化学因素。例如，显色剂尔定律的主要化学因素。例如，显色剂KSCN与与Fe3+形成红色配合物形成红色配合物Fe(SCN)3，存在下列平衡：，存在下列平衡：Fe(SCN)3 F
24、e3+3SCN （三）化学反应引起的偏离（三）化学反应引起的偏离 溶液稀释时，上述平衡向右，离解度增大。所以当溶液稀释时，上述平衡向右，离解度增大。所以当溶液体积增大一倍时，溶液体积增大一倍时，Fe(SCN)3的浓度不止降低一半，的浓度不止降低一半，故吸光度降低一半以上，导致偏离朗伯故吸光度降低一半以上，导致偏离朗伯比尔定律。比尔定律。2.3 紫外紫外可见分光光度计可见分光光度计 UV-Vis Spectrophotometers 一、基本组成一、基本组成 general process 1.光源光源 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有
25、足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。命。可见光区：可见光区：钨灯钨灯钨灯钨灯作为光源，作为光源，其辐射波长范围在其辐射波长范围在3202500 nm。紫外区：氢、氘灯。发射紫外区：氢、氘灯。发射180375 nm的连续光谱。的连续光谱。2.2.单色器色器 将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。长单色光的光学系统。入射狭缝：光源的光由此进入单色器；入射狭缝：光源的光由此进入单色器；准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束
26、 色散元件：将复合光分解成单色光；色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅棱镜或光栅聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；至出射狭缝；出射狭缝。出射狭缝。3.样品室样品室 样品室放置各种类型的吸收池样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有收池主要有石英池石英池和和玻璃池玻璃池两种。两种。在紫外区须采用石英池，可见区一在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。般用玻璃池。4.检测器检测器 利用光电效应将透过吸收池的光利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，
27、常用的有信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。光电池、光电管或光电倍增管。5.5.结果果显示示记录系系统 检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理二、分光光度计的类型二、分光光度计的类型 types of spectrometer 1.单光束单光束 简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。很高的稳定性。0.575光源单色器吸收池检测器显示 2.双光束双光束 自
28、动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。器复杂，价格较高。三、仪器的主要性能指标三、仪器的主要性能指标 1、光度的准确度光度的准确度：是指样品在最大吸收波长处吸光：是指样品在最大吸收波长处吸光度的测量值与真实值间的偏差，该偏差越小，说明仪器的度的测量值与真实值间的偏差，该偏差越小，说明仪器的准确度越高。准确度越高。国际上通常采用吸光度的准确度来表示仪器的光度准国际上通常采用吸光度的准确度来表示仪器的光度准确度，常用酸性重铬酸钾法
29、进行检测。确度，常用酸性重铬酸钾法进行检测。2、波长准确度波长准确度：是指仪器指示器上所指示的波长与：是指仪器指示器上所指示的波长与实际所输入的波长值之间的符合程度，常用波长误差来表实际所输入的波长值之间的符合程度，常用波长误差来表示。示。波长准确度常用稀土玻璃进行检测。波长准确度常用稀土玻璃进行检测。3、杂散光：是分光光度法测量中的主要误差来源。、杂散光：是分光光度法测量中的主要误差来源。4、分辨率：指仪器对相邻两吸收带可分辨的最小波长的、分辨率：指仪器对相邻两吸收带可分辨的最小波长的间隔能力。间隔能力。5、光谱带宽：是指从单色器射出的单色光最大强度的、光谱带宽：是指从单色器射出的单色光最大
30、强度的1/2处的谱带宽度。处的谱带宽度。6、基线稳定度与平直度：指仪器在不放置样品时扫描、基线稳定度与平直度：指仪器在不放置样品时扫描100%T线和线和0%T线时读数偏离的程度或基线弯曲的程度。线时读数偏离的程度或基线弯曲的程度。2.4 紫外紫外可见分光光度法分析条件的选择可见分光光度法分析条件的选择一、溶剂选择的原则：一、溶剂选择的原则：1、不与被测组分发生化学反应、不与被测组分发生化学反应 2、所选溶剂在测定波长范围内无明显吸收、所选溶剂在测定波长范围内无明显吸收 3、对被测组分有较好的溶解能力、对被测组分有较好的溶解能力 4、被测组分在所选的溶剂中有较好的峰形、被测组分在所选的溶剂中有较
31、好的峰形二、测量条件的选择二、测量条件的选择 1、入射波长的选择：、入射波长的选择：通常是根据被测组分的吸收光谱，通常是根据被测组分的吸收光谱，选择最强吸收带选择最强吸收带选择最强吸收带选择最强吸收带的最大吸收波长为入射波长。当最强的最大吸收波长为入射波长。当最强吸收峰的峰形比较尖锐时，往往选用吸收稍低，峰形吸收峰的峰形比较尖锐时，往往选用吸收稍低，峰形稍平坦的次强峰进行测定。稍平坦的次强峰进行测定。2、狭缝宽度的选择：为了选择合适的狭缝宽度，应以、狭缝宽度的选择：为了选择合适的狭缝宽度，应以减少狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准。一般来减少狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准。一般来说，狭缝宽
32、度大约是试样吸收峰半宽度的十分之一。说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的十分之一。3、吸光度测量范围的选择：、吸光度测量范围的选择：由朗伯由朗伯-比尔定律可知：比尔定律可知：A=lg1/T=cl 微分后得：微分后得：dlgT=0.4343dT/T=-ldc 或或 0.4343T/T=-lc 代入朗伯代入朗伯-比尔定律有：比尔定律有：c/c=0.4343T/TlgT 要使测定的相对误差要使测定的相对误差c/c最小，最小，求导取极小得出：求导取极小得出：lgT=-0.4343=A 即当即当A=0.4343时，吸光度测量时，吸光度测量误差最小。误差最小。最适宜的测量范围为最适宜的测量范围为最适宜的测
33、量范围为最适宜的测量范围为0.20.80.20.8之之之之间。间。间。间。4、参比溶液的选择：参比溶液的选择：测定试样溶液的吸光度，测定试样溶液的吸光度，需先用参比溶液调节透光度需先用参比溶液调节透光度（吸光度为（吸光度为0）为）为100%，以消除其它成分及吸光池和溶剂等，以消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差。对光的反射和吸收带来的测定误差。参比溶液的选择视分析体系而定，具体有：参比溶液的选择视分析体系而定，具体有：（1）溶剂参比溶剂参比 试样简单、试样简单、共存其它成分对测定波长吸共存其它成分对测定波长吸收弱收弱，只考虑消除溶剂与吸收池等因素；，只考虑消除溶剂与吸收池
34、等因素；（2）试样参比试样参比 如果如果试样基体试样基体溶液在测定波长有吸收，溶液在测定波长有吸收，而显色剂不与试样基体显色时，可按与显色反应相同的条件而显色剂不与试样基体显色时，可按与显色反应相同的条件处理试样，只是不加入显色剂。处理试样，只是不加入显色剂。（3）试剂参比试剂参比 如果显色剂或其它试剂在测定波长有如果显色剂或其它试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，不加入试样，同样加入试吸收，按显色反应相同的条件，不加入试样，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。剂和溶剂作为参比溶液。（4）平行操作参比平行操作参比 用不含被测组分的试样，在相同用不含被测组分的试样，在相同的条件下与被测试样同
35、时进行处理，由此得到平行操作参的条件下与被测试样同时进行处理，由此得到平行操作参比溶液。比溶液。三、反应条件的选择：三、反应条件的选择：对多种物质进行测定，常利用显色反应将被测组分转对多种物质进行测定，常利用显色反应将被测组分转变为变为在一定波长范围有吸收的物质在一定波长范围有吸收的物质在一定波长范围有吸收的物质在一定波长范围有吸收的物质。常见的显色反应有配。常见的显色反应有配位反应、氧化还原反应等。位反应、氧化还原反应等。显色剂显色剂 这种被测元素在某种试剂的作用下，转变成有色化合物这种被测元素在某种试剂的作用下，转变成有色化合物的反应叫显色反应（的反应叫显色反应（color reactio
36、n），所加入试剂称为显色），所加入试剂称为显色剂剂(color reagent)。（一）、选择显色剂的一般原则：（一）、选择显色剂的一般原则：选选选选择择择择性性性性好好好好 所所用用的的显显色色剂剂仅仅与与被被测测组组分分显显色色而而与与其其它它共共存存组组分不显色，或其它组分干扰少。分不显色，或其它组分干扰少。灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度要要要要足足足足够够够够高高高高 有有色色化化合合物物有有有有大大大大的的的的摩摩摩摩尔尔尔尔吸吸吸吸光光光光系系系系数数数数，一一般般应应有有104105数量级。数量级。有有有有色色色色配配配配合合合合物物物物的的的的组组组组成成成成要要要要恒恒恒恒定定定定
37、 显显色色剂剂与与被被测测物物质质的的反反应应要要定定量量进行，生成有色配合物的组成要恒定。进行，生成有色配合物的组成要恒定。v生成的有色配合物稳定性好生成的有色配合物稳定性好生成的有色配合物稳定性好生成的有色配合物稳定性好 即要求配合物有较大的稳定即要求配合物有较大的稳定常数，有色配合物不易受外界环境条件的影响，亦不受溶常数，有色配合物不易受外界环境条件的影响，亦不受溶液中其它化学因素的影响。有较好的重现性，结果才准确液中其它化学因素的影响。有较好的重现性，结果才准确 v色差大色差大色差大色差大 有色配合物与显色剂之间的颜色差别要大，这样有色配合物与显色剂之间的颜色差别要大，这样试剂空白小，
38、显色时颜色变化才明显。试剂空白小，显色时颜色变化才明显。（二）、显色反应条件的选择（二）、显色反应条件的选择 溶液的酸度溶液的酸度溶液的酸度溶液的酸度 许许多多显显色色剂剂都都是是有有机机弱弱酸酸或或有有机机弱弱碱碱，溶溶液液的的酸酸度度会会直接影响显色剂的解离程度。（例如二甲酚橙）直接影响显色剂的解离程度。（例如二甲酚橙）对对某某些些能能形形成成逐逐级级配配合合物物的的显显色色反反应应，产产物物的的组组成成会会随介质酸度的改变而改变，从而影响溶液的颜色。随介质酸度的改变而改变，从而影响溶液的颜色。另另外外，某某些些金金属属离离子子会会随随着着溶溶液液酸酸度度的的降降低低而而发发生生水水解，甚
39、至产生沉淀，使稳定性较低的有色配合物的解离。解，甚至产生沉淀，使稳定性较低的有色配合物的解离。显色温度显色温度显色温度显色温度 有有些些反反应应需需要要加加热热。有有些些显显色色剂剂或或有有色色配配合合物物在在较较高高温温度度下下易易分分解解褪褪色色。此此外外温温度度对对光光的的吸吸收收及及颜颜色色深深浅浅也也有有影影响响，要求标准溶液和被测溶液在测定过程中温度一致。要求标准溶液和被测溶液在测定过程中温度一致。显色时间显色时间显色时间显色时间 显显色色反反应应有有快快慢慢，有有的的有有色色配配合合物物容容易易褪褪色色，因因此此不不同同的的显显色色反反应应需需放放置置不不同同的的时时间间，并并在
40、在一一定定的的时时间间范范围围内内进进行行比色测定。比色测定。四、干扰及消除方法四、干扰及消除方法 常用的消除干扰的方法：常用的消除干扰的方法：1、控制酸度：提高反应的选择性、控制酸度：提高反应的选择性 2、加入掩蔽剂：使其只与干扰离子反应生成不、加入掩蔽剂：使其只与干扰离子反应生成不干扰测定的配合物。干扰测定的配合物。3、改变干扰离子的价态：消除共存组分的干扰、改变干扰离子的价态：消除共存组分的干扰 4、改变测定波长、改变测定波长 5、分离干扰离子、分离干扰离子2.5 测定方法及其应用测定方法及其应用 一、一般定性分析及应用一、一般定性分析及应用 （一）、有机化合物的鉴定（一）、有机化合物的
41、鉴定 先扫描未知化合物的吸收光谱，然后根据其吸收光谱先扫描未知化合物的吸收光谱，然后根据其吸收光谱的特征（吸收峰的数目、形状、位置、相对强度）与相同的特征（吸收峰的数目、形状、位置、相对强度）与相同条件下扫描得到的已知纯化合物的吸收光谱进行比较而定条件下扫描得到的已知纯化合物的吸收光谱进行比较而定性。性。（二）、有机化合物结构的分析（二）、有机化合物结构的分析 先将化合物的紫外先将化合物的紫外可见吸收光谱扫描出来，然后根可见吸收光谱扫描出来，然后根据其吸收谱带及最大吸收波长处吸收值的大小，可推断出据其吸收谱带及最大吸收波长处吸收值的大小，可推断出该化合物的主要基团及其所在位置。该化合物的主要基
42、团及其所在位置。（三）、化合物纯度的检验（三）、化合物纯度的检验 将纯化合物的吸收光谱与含杂质化合物的吸收光谱进将纯化合物的吸收光谱与含杂质化合物的吸收光谱进行比较，根据两者吸收光谱的差异进行纯度检验。对杂质检行比较，根据两者吸收光谱的差异进行纯度检验。对杂质检验的灵敏度取决于化合物与杂质间吸收系数的差异。验的灵敏度取决于化合物与杂质间吸收系数的差异。标准曲线法标准曲线法 其方法是先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选其方法是先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度光度A。以。以A为纵坐标，浓度为纵坐
43、标，浓度c为横坐标，绘制为横坐标，绘制A-c曲线，曲线，若符合朗伯若符合朗伯比尔定律，则得到一条比尔定律，则得到一条通过原点通过原点的直线，的直线，称为标准曲线。称为标准曲线。然后用完全相同的方法和步骤测定被测然后用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量，这就是标准曲线法。浓度或含量，这就是标准曲线法。在仪器、方法和条件都固定的情况下，标准曲线可以多在仪器、方法和条件都固定的情况下，标准曲线可以多次使用而不必重新制作，因而标准曲线法适用于大量的次使用而不必重新制作，因而标准曲线法适用于大量的经常性的
44、工作。经常性的工作。二、单组分的定量测定方法及应用二、单组分的定量测定方法及应用Blank Standard Sample Sample 标准对照法标准对照法(直接比较法直接比较法)将将试试样样溶溶液液和和一一个个标标准准溶溶液液在在相相同同条条件件进进行行显显色色、定定容容，分分别别测测出出它它们们的的吸吸光光度度，按按下下式式计计算算被被测测溶溶液液的的浓度。浓度。k标=k测 b标=b测 所以所以 要要求求A与与c线线性性关关系系良良好好，被被测测样样品品溶溶液液与与标标准准溶溶液液浓浓度度接接近近，以以减减少少测测定定误误差差。用用一一份份标标准准溶溶液液即即可可计计算算出被测溶液的含量
45、或浓度，方便，操作简单。出被测溶液的含量或浓度，方便，操作简单。三、多组分的定量测定方法及应用三、多组分的定量测定方法及应用 溶液的总吸光度等于溶液的总吸光度等于各组分的吸光度之和：各组分的吸光度之和：A=A1+A2+A3+An 吸收峰互不重叠吸收峰互不重叠 A、B两组分的吸收峰两组分的吸收峰相互不重叠，则可分别在相互不重叠，则可分别在各处用单组分含量测定法各处用单组分含量测定法测定组分测定组分A和和B。吸收峰相互重叠吸收峰相互重叠 A、B两组分的吸收峰相互重叠，两组分的吸收峰相互重叠，可分别在和处测出可分别在和处测出A、B两组分的总两组分的总吸光度吸光度A1和和A2，然后根据吸光度的加，然后
46、根据吸光度的加和性列联立方程：和性列联立方程：在在 处，处，在在 处，处，式中式中 分别为分别为A和和B在波长在波长 处的摩尔吸光系数处的摩尔吸光系数 分别为分别为A和和B在波长在波长 处的摩尔吸光系数处的摩尔吸光系数 练习练习 1、已知维生素、已知维生素B12的最大吸收波长为的最大吸收波长为361nm。精确。精确称取样品称取样品30mg，加水溶解稀释至，加水溶解稀释至100mL，在波长，在波长361nm下测得溶液的吸光度为下测得溶液的吸光度为0.618，另有一未知浓度的样品在，另有一未知浓度的样品在同样条件下测得吸光度为同样条件下测得吸光度为0.475，计算样品维生素，计算样品维生素B12的的浓度。浓度。2、NO2-在波长在波长355nm处的处的355=23.3Lmol-1cm-1，355/302=2.5，NO3-在波长在波长355nm处的吸收可忽略，在波处的吸收可忽略，在波长长302nm处处302=7.24Lmol-1cm-1。今有一含有。今有一含有NO2-和和NO3-的试液，用的试液，用1cm的吸收池测得的吸收池测得A302=1.010，A355=0.730。计算试液中。计算试液中NO2-和和NO3-的浓度。的浓度。L/O/G/OThank You!Thank You!