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1、第三章第三章紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法仪仪 器器 分分 析析学习目的学习目的通通过过本本章章学学习习，为为后后续续药药物物分分析析、中中药药分分析析课课程程中中有有关关药药品品的的定定性性鉴鉴别别、杂杂质质检检查查和和含含量量测测定定的的学学习习奠奠定基础。定基础。学习要点学习要点 紫外紫外-可见分光光度法的基本原理；可见分光光度法的基本原理；电子跃迁类型，吸收带的类型、特点及影响因素；电子跃迁类型，吸收带的类型、特点及影响因素；Lambert-BeerLambert-Beer定律；定律；紫外紫外-可见分光光光度计的基本构造；可见分光光光度计的基本构造；定性定量方法。定性定量方法。
2、目 录第一节第一节 紫外紫外-可见分光光度法的基本原理可见分光光度法的基本原理第二节第二节 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计第三节第三节 紫外紫外-可见分光光度法分析条件的选择可见分光光度法分析条件的选择第四节第四节 紫外紫外-可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用紫紫外外-可可见见分分光光光光度度法法(ultraviolet-visible spectrophotometry，UV-Vis)是是基基于于分分子子中中价价电电子子跃跃迁迁所所产产生生的的吸吸收收光光谱谱而而进进行行分分析的方法，又称析的方法，又称紫外紫外-可见吸收光谱法可见吸收光谱法。该法波长范围一般在该法波长范围一般在
3、190800nm。特点特点：灵敏度较高，一般为灵敏度较高，一般为10-7 10-4g/ml；准准确确度度较较好好，相相对对误误差差一一般般在在0.5%，精精度度高高的的可可达达0.2%；仪器设备简单，操作方便，分析速度较快。仪器设备简单，操作方便，分析速度较快。概述概述一、紫外一、紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱（一）（一）电电子子跃跃迁的迁的类类型型1、*跃迁跃迁2、*跃迁跃迁3、n *跃迁跃迁4、n *跃迁跃迁5、电荷迁移跃迁、电荷迁移跃迁6、配位场跃迁、配位场跃迁第一节第一节 紫外紫外-可见分光光度法的基本原理可见分光光度法的基本原理电子跃迁所需能量及所处波段示意图电子跃迁所需能量及所处波
4、段示意图*n*n*5、电荷迁移跃迁、电荷迁移跃迁用用电电磁磁辐辐射射照照射射化化合合物物时时，电电子子从从给给与与体体向向接接受受体体相相联联系系的的轨道轨道上跃迁称为电荷迁移跃迁。上跃迁称为电荷迁移跃迁。某某些些取取代代芳芳烃烃分分子子同同时时具具有有电电子子给给与与体体和和电电子子接接受受体体两两部部分分，可以产生电荷转移吸收光谱。可以产生电荷转移吸收光谱。某某些些过过渡渡金金属属离离子子与与含含生生色色团团的的试试剂剂反反应应所所产产生生的的配配合合物物，以及许多以及许多无机物离子无机物离子均可产生电荷迁移跃迁。均可产生电荷迁移跃迁。此类吸收带此类吸收带较宽较宽，吸收强度大吸收强度大，一
5、般，一般max 104。（一）电子跃迁的类型6、配位场跃迁、配位场跃迁第第4、5周周期期过过渡渡金金属属水水合合离离子子或或过过渡渡金金属属离离子子与与显显色色剂剂所所形形成成的的配配合合物物在在电电磁磁辐辐射射作作用用下下，吸吸收收适适当当波波长长的的紫紫外外光光或或可可见光，从而获得相应的吸收光谱。见光，从而获得相应的吸收光谱。配位场跃迁吸收强度较弱，一般配位场跃迁吸收强度较弱，一般max 102。如如Ti(H2O)63+水合离子的配位场跃迁吸收带水合离子的配位场跃迁吸收带max为为490nm。大大多多数数镧镧系系和和锕锕系系元元素素离离子子的的4f或或5f电电子子可可发发生生ff*跃跃迁
6、迁（配位场跃迁），因而在紫外（配位场跃迁），因而在紫外-可见光区都有吸收。可见光区都有吸收。（一）电子跃迁的类型8跃迁跃迁类型类型出现波段出现波段 吸收吸收强度强度化合物化合物结构结构特点特点*200nm 弱弱 单键单键CCCH饱和烃类，对紫外无贡献，但可作饱和烃类，对紫外无贡献，但可作溶剂溶剂*200nm强强不饱和键不饱和键CCCC有共轭双键存在时，有共轭双键存在时，*跃迁所跃迁所需能量降低，波长红移需能量降低，波长红移n*250 500nm弱弱COCN等等必须是杂原子直接连在双键上必须是杂原子直接连在双键上n*200nm弱弱COHCNH2 CSCX含有未共用电子对的基团连接在含有未共用电子
7、对的基团连接在键上键上杂原子极性杂原子极性，红移红移杂原子数目杂原子数目，红移红移电子跃迁类型及特点电子跃迁类型及特点1、吸收光、吸收光谱谱（吸收曲（吸收曲线线）2、生色、生色团团3、助色、助色团团4、蓝蓝移、移、红红移移5、增色效、增色效应应、减色效、减色效应应（二）紫外（二）紫外-可见吸收光谱中的常用术语可见吸收光谱中的常用术语1、吸收光谱（吸收曲线）、吸收光谱（吸收曲线）(1)最大吸收波长（最大吸收波长（max）吸收曲线上的吸收曲线上的最大吸收峰最大吸收峰所所对应的波长。对应的波长。(2)最小吸收波长（最小吸收波长（min）吸收曲线上的吸收曲线上的最低部位的最低部位的谷谷所对应的波长。所
8、对应的波长。(3)肩峰肩峰（sh）吸收吸收峰上峰上的的曲折处曲折处称为肩峰。称为肩峰。(4)末端吸收末端吸收在吸收曲线的在吸收曲线的最短波长处最短波长处呈呈现现强吸收强吸收而不成峰形的部分而不成峰形的部分称为末端吸收。称为末端吸收。有有机机化化合合物物分分子子结结构构中中含含有有n*、*跃跃迁迁的的基基团团，能能在在紫紫外外-可可见见光范光范围围内内产产生吸收的基生吸收的基团团。如如C=C、C=O、N=N等等简简单单的的双双键键或或叁叁键键，以以及及CO、CN、CS、NO、NO2等等有有杂杂原原子子渗渗入入的的双双键键或或共共轭轭双双键键。2、生色团、生色团含含有有非非成成键键电电子子的的杂杂
9、原原子子饱饱和和基基团团，本本身身不不能能吸吸收收波波长长大大于于200nm的的辐辐射射，但但与与发发色色团团或或饱饱和和烃烃相相连连时时，能能使使生生色色团团的的吸吸收峰向收峰向长长波波方向位移并方向位移并增增强强其其吸收吸收强强度度的基的基团团。如如NH2、OH、NR2、OR、SH、SR、Cl、Br等。等。这这些些基基团团中中的的 n电电子子能能与与生生色色团团中中的的电电子子相相互互作作用用（可可能能产产生生p-共共轭轭），使），使*跃跃迁迁能量降低能量降低，跃跃迁几率迁几率变变大。大。3、助色团、助色团(1)蓝移（紫移、短移）蓝移（紫移、短移）因化合物的因化合物的结构改变或溶剂效应结构
10、改变或溶剂效应等引起的吸收峰向等引起的吸收峰向短短波波方向移动的现象方向移动的现象(2)红移（长移）红移（长移）因化合物的因化合物的结构改变或溶剂效应结构改变或溶剂效应等引起的吸收峰向等引起的吸收峰向长长波波方向移动的现象方向移动的现象4、蓝移、红移、蓝移、红移(1)增色效增色效应应由于化合物的由于化合物的结结构构发发生某些生某些变变化或外界因素的影响，化或外界因素的影响，使化合物的使化合物的吸收吸收强强度增大度增大的的现现象象(2)减色效减色效应应由于化合物的由于化合物的结结构构发发生某些生某些变变化或外界因素的影响，化或外界因素的影响，使化合物的使化合物的吸收吸收强强度减小度减小的的现现象
11、象5、增色效应、减色效应、增色效应、减色效应（三）吸收带（三）吸收带依据电子跃迁和分子轨道类型，吸收带可分为：依据电子跃迁和分子轨道类型，吸收带可分为：1 1、R R带带Radikal(Radikal(基团基团)2 2、K K带带Konjugation(Konjugation(共轭作用共轭作用)3 3、B B带带benzenoid(benzenoid(苯苯)4 4、E E带带芳香族化合物特征吸收带芳香族化合物特征吸收带 1、R带Radikal(基团)由由含含杂杂原原子子不不饱饱和和基基团团（CO、NO、NO2、NN）的的n*跃迁引起。跃迁引起。吸吸收收峰峰处处于于较较长长波波长长范范围围（25
12、0500nm）内内，吸吸收收强强度度中中等等（100）。2、K带Konjugation(共轭作用)由共轭双键中由共轭双键中*跃迁引起。跃迁引起。吸收峰出现在吸收峰出现在200nm以上以上，吸收强度大吸收强度大（105）。）。随着共轭双键的增加，吸收峰红移，吸收强度有所增加。随着共轭双键的增加，吸收峰红移，吸收强度有所增加。如丁二烯如丁二烯max=217nm为为K带。带。3、B带benzenoid(苯)芳芳香香族族（包包括括杂杂芳芳香香族族）特征吸收带特征吸收带。由由苯苯等等芳芳香香族族化化合合物物的的*跃跃迁迁所所引引起起的的吸吸收收带带之一。之一。吸吸收收峰峰出出现现在在230270nm之间
13、之间，中心波长，中心波长256nm。在在极极性性溶溶剂剂中中，B带带精精细细结构变得结构变得不明显或消失不明显或消失。苯的紫外吸收光谱（异辛烷溶剂中）苯的紫外吸收光谱（异辛烷溶剂中）4、E带芳香族化合物特征吸收带 由由苯苯环环结结构构中中3个个乙乙烯烯的的环环状状共共轭轭系系统统的的*跃跃迁迁所所引起。引起。分为分为E1和和E2两个吸收带。两个吸收带。E1吸吸 收收 带带 约约 在在 184nm，max=60000，强吸收带。，强吸收带。E2吸吸收收带带在在204nm以以上上，max=8000，强吸收带。，强吸收带。苯的紫外吸收光谱（异辛烷溶剂中）苯的紫外吸收光谱（异辛烷溶剂中）电子结构电子结
14、构化合物化合物跃迁跃迁maxmax（nmnm）maxmax吸收带吸收带乙烷乙烷*13513510 00010 000 乙烯乙烯*16516510 00010 000 乙炔乙炔*17317360006000 和和n n丙酮丙酮*约约16016016 00016 000 nn*19419490009000 nn*2792791515R R-CHCH2 2=CH-CH=CH=CH-CH=CH2 2*21721721 00021 000K K-和和n nCHCH2 2=CH-CHO=CH-CHO*21021011 50011 500K K nn*3153151414R R芳香族芳香族苯苯芳香族芳香族*
15、约约18018060 00060 000E E1 1 同上同上约约20020080008000E E2 2 同上同上255255215215B B一些化合物的电子结构、跃迁和吸收带211、有机化合物的紫外吸收光谱有机化合物的紫外吸收光谱2、影响紫外吸收光谱的主要因素、影响紫外吸收光谱的主要因素（四）紫外（四）紫外-可见吸收光谱与分子结构的关系可见吸收光谱与分子结构的关系22(1)饱和化合物饱和化合物饱饱和和碳碳氢氢化化合合物物只只有有电电子子，因因此此只只能能产产生生*跃跃迁迁，需需要要能能量较大，吸收的波长通常在量较大，吸收的波长通常在150nm左右的真空紫外光区。左右的真空紫外光区。含含有
16、有O、N、S、X等等杂杂原原子子的的饱饱和和化化合合物物，除除电电子子外外，还还有有n电电子子，可可发发生生n*跃跃迁迁，在在200nm附附近近有有弱弱吸吸收收，通通常常为为末末端吸收。端吸收。仅少数化合物（如烷基碘）的仅少数化合物（如烷基碘）的max为为259nm（max=400）。）。在在200400nm的近紫外区没有强吸收（常称为透明）。的近紫外区没有强吸收（常称为透明）。在紫外吸收光谱分析中在紫外吸收光谱分析中常作溶剂常作溶剂。1 1、有机化合物的紫外吸收光谱有机化合物的紫外吸收光谱23(2)不饱和烃不饱和烃及及共轭烯烃共轭烯烃含含孤孤立立双双键键或或叁叁键键的的简简单单不不饱饱和和脂
17、脂肪肪化化合合物物，可可以以产产生生*和和*两种跃迁。两种跃迁。最大吸收波长最大吸收波长max小于小于200nm。具具有有共共轭轭体体系系的的不不饱饱和和化化合合物物，共共轭轭体体系系越越长长，跃跃迁迁时时所所需需能能量越小，吸收峰量越小，吸收峰红移越显著红移越显著。如如1,3,5,7,9,11-十二烷基六烯十二烷基六烯max为为364nm，max为为138000。1 1、有机化合物的紫外吸收光谱有机化合物的紫外吸收光谱(3)羰羰基化合物基化合物羰羰基化合物含有基化合物含有C=O基基团团，可，可发发生生n*、n*和和*跃跃迁。迁。其其中中n*跃跃迁迁所所需需要要能能量量较较低低，吸吸收收波波长
18、长在在近近紫紫外外光光区区或或紫紫外外光区，光区，为为10100。醛醛、酮酮、羧羧酸酸及及其其衍衍生生物物(酯酯、酰酰胺胺、酰酰卤卤等等)，均均属属于于这这类类化化合物的吸收合物的吸收类类型。型。、-不不饱饱和和醛醛、酮酮，由由于于C=O和和C=C双双键键共共轭轭，使使*跃跃迁迁红红移移至至200nm以以上上，约约为为104；而而n*跃跃迁迁红红移移至至310350nm（100）。）。如如CH2=CH-CHO，共共轭轭*跃跃迁迁max为为210nm，n*跃跃迁迁max为为315nm。1 1、有机化合物的紫外吸收光谱有机化合物的紫外吸收光谱(4)芳香族化合物芳香族化合物苯苯具具有有环环状状共共轭
19、轭体体系系，在在紫紫外外光光区区，由由*跃跃迁迁产产生生E1带带、E2带带和和B带带3个吸收个吸收带带。B带带是芳香族化合物的特征。是芳香族化合物的特征。当当苯苯环环上上引引入入NH2、OH、CHO、NO2基基团团时时，苯苯的的B带带显显著著红红移移，吸收吸收强强度度增大增大。如如果果引引入入的的基基团团带带有有不不饱饱和和杂杂原原子子时时，则则产产生生了了n*跃跃迁迁的的新吸收新吸收带带。如如硝硝基基苯苯、苯苯甲甲醛醛的的n*跃跃迁迁的的吸吸收收波波长长分分别别为为330nm和和328nm。1 1、有机化合物的紫外吸收光谱有机化合物的紫外吸收光谱2 2、影响紫外吸收光谱的主要因素、影响紫外吸
20、收光谱的主要因素分子的内部结构和外部环境等各种因素对吸收谱带分子的内部结构和外部环境等各种因素对吸收谱带也有一些，主要表现为也有一些，主要表现为谱带位移谱带位移、谱带强度的变化谱带强度的变化、谱带精细结构的改变谱带精细结构的改变等。等。(1)位阻影响位阻影响(2)跨环效应跨环效应(3)溶剂效应溶剂效应(4)体系体系pH值的影响值的影响(1)位阻影响位阻影响化合物中若有两个生色化合物中若有两个生色团产团产生生共共轭轭效效应应，可使，可使吸收吸收带带长长移移。但如果两个生色但如果两个生色团团由于由于立体阻碍妨碍它立体阻碍妨碍它们处们处于同一平于同一平面上面上，就会影响共，就会影响共轭轭效效应应。二
21、苯乙二苯乙烯烯由于由于顺顺式式结结构有立体阻碍构有立体阻碍，苯，苯环环不能与乙不能与乙烯烯双双键键在同一平面上，不易在同一平面上，不易产产生共生共轭轭，因此，因此反式反式结结构的构的K带带max比比顺顺式明式明显红显红移移，且，且吸收系数吸收系数也也增加。增加。2 2、影响紫外吸收光谱的主要因素、影响紫外吸收光谱的主要因素 二苯乙烯顺式反式异构体的紫外吸收光谱二苯乙烯顺式反式异构体的紫外吸收光谱2 2、影响紫外吸收光谱的主要因素、影响紫外吸收光谱的主要因素(2)跨跨环环效效应应跨跨环环效效应应指指非共非共轭轭基基团团之之间间的的相互作用相互作用。如如对对亚亚甲甲基基环环丁丁酮酮在在214nm处
22、处出出现现一一中中等等强强度度的的吸收吸收带带，同，同时时284nm处处出出现现R带带。这这是是由由于于结结构构中中虽虽然然双双键键与与酮酮基基不不产产生生共共轭轭体体系系，但但适适当当的的立立体体排排列列，使使羰羰基基氧氧的的孤孤电电子子对对与与双双键键的的电电子子发发生作用生作用，相当于，相当于n*跃跃迁的迁的R带带向向长长波移波移动动。对亚甲基环丁酮对亚甲基环丁酮2 2、影响紫外吸收光谱的主要因素、影响紫外吸收光谱的主要因素(3)溶剂效应溶剂效应n*随溶剂随溶剂极性极性的的增大增大，吸收峰向，吸收峰向短波短波移动。移动。*随溶剂随溶剂极性极性的的增大，增大，吸收峰向吸收峰向长波长波移动。
23、移动。极性溶剂对两种跃迁能级差的影响示意图极性溶剂对两种跃迁能级差的影响示意图2 2、影响紫外吸收光谱的主要因素、影响紫外吸收光谱的主要因素溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁吸收峰的影响溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁吸收峰的影响跃迁类型跃迁类型正己烷正己烷三氯甲烷三氯甲烷甲醇甲醇水水*230nm230nm238nm238nm237nm 237nm 243nm243nmn*n*329nm329nm315nm315nm309nm309nm305nm305nm 对称四嗪的吸收光谱对称四嗪的吸收光谱a.a.蒸气态中蒸气态中 b.b.环己烷中环己烷中 c.c.水中水中极性溶剂极性溶剂往往使吸收峰的往往使吸收
24、峰的精细结构消失精细结构消失2 2、影响紫外吸收光谱的主要因素、影响紫外吸收光谱的主要因素(4)体系体系pH值值的影响的影响体系酸碱度体系酸碱度对对酸碱性有机化合物酸碱性有机化合物吸收光吸收光谱谱的影响的影响普遍存在。普遍存在。如如酚酚类类化合物由于体系化合物由于体系pH值值不同，其不同，其解离情况不解离情况不同同，而，而产产生不同的吸收光生不同的吸收光谱谱。max 210.5nm（max 6200）236nm（max 9400）270nm （max 1450）287nm（max 2600）2 2、影响紫外吸收光谱的主要因素、影响紫外吸收光谱的主要因素二、朗伯二、朗伯-比尔定律比尔定律朗伯朗伯
25、-比比尔尔定律定律(Lambert-Beer)是光吸收的基本定律，是分光光度法定量是光吸收的基本定律，是分光光度法定量分析的依据和基分析的依据和基础础。如果如果浓浓度度c以以物物质质的量的量浓浓度度（mol/L）表示，）表示，则则公式可以写成公式可以写成 其中其中称称为为摩摩尔尔吸收系数吸收系数，单单位位为为L/（molcm）。）。如果如果浓浓度度c以以质质量百分量百分浓浓度度（g/100ml）表示，）表示，则则公式可以写成公式可以写成 其中称其中称为为百分吸收系数百分吸收系数，单单位位为为100ml/（gcm）。）。吸收系数两种表示方式之吸收系数两种表示方式之间间的关系是：的关系是：（一）（
26、一）数学表达式及物理意义数学表达式及物理意义例例 某某种种从从中中药药提提取取物物分分离离纯纯化化制制得得的的有有效效成成分分，浓浓度度为为12.6g/ml，用用1cm吸吸收收池池，在在最最大大吸吸收收波波长长238nm处处测测得得其其吸吸光光度度为为0.437，试试计计算算其其 （max）；若若该该组组分分的的分分子子量量是是264，计计算其算其（max）。）。解：已知解：已知c=12.6g/ml=12.610-6100=1.2610-3(g/100ml)朗伯朗伯-比尔定律公式运用比尔定律公式运用1 1、化学、化学因素因素2 2、光学、光学因素（非单色光，杂散光，散射光和反射光，因素（非单色
27、光，杂散光，散射光和反射光，非平行光）非平行光）（二）偏离朗伯（二）偏离朗伯-比尔定律的因素比尔定律的因素吸吸光光物物质质可可因因浓浓度度的的改改变变而而发发生生离离解解、缔缔合合、溶溶剂剂化化以以及及配配合合物物生生成成等等变变化化，使使吸吸光光物物质质的的存存在在形形式式发发生生变变化化，从从而而偏偏离离朗朗伯伯-比尔定律。比尔定律。C6H5COOHH2O=C6H5COOH3O max（nm)273 268max L/(molcm)970 560稀释稀释溶液或溶液或改变改变溶液溶液pH值时，吸收波长及吸收系数都会改变。值时，吸收波长及吸收系数都会改变。1 1、化学因素、化学因素2 2、光学
28、因素、光学因素(1)非非单单色光色光(2)杂散光杂散光(3)散射光和反射光散射光和反射光(4)非平行光非平行光(1)非单色光非单色光比比尔尔定定律律只只适适用用于于单单色色光光，实实际际用用于于测测量量的的都都是是具具有有一一定定谱谱带带宽度宽度的复合光，谱带宽度的复合光，谱带宽度越小越小，单色性越好。，单色性越好。谱带宽度谱带宽度应选择曲线较为平坦应选择曲线较为平坦的最大吸收波长的最大吸收波长a a处测定处测定2 2、光学因素、光学因素2 2、光学因素、光学因素(2)杂散光杂散光 从从单单色色器器得得到到的的单单色色光光中中，还还有有一一些些不不在在谱谱带带范范围围内内的的、与所需波与所需波
29、长长相隔甚相隔甚远远的光，称的光，称为杂为杂散光。散光。它它是是由由于于仪仪器器光光学学系系统统的的缺缺陷陷或或光光学学元元件件受受灰灰尘尘、霉霉蚀蚀的影响而引起的。的影响而引起的。在透光率很弱在透光率很弱时时，杂杂散光会散光会产产生明生明显显的作用。的作用。在在接接近近紫紫外外末末端端吸吸收收处处，杂杂散散光光的的比比例例相相对对增增大大，从从而而干干扰测扰测定，有定，有时还时还会出会出现现假峰假峰。2 2、光学因素、光学因素(3)散射光和反射光散射光和反射光吸吸光光质质点点对对入入射射光光有有散散射射作作用用，吸吸收收池池内内外外界界面面之之间间入射光通入射光通过时过时会有反射作用。会有反
30、射作用。散射和反射作用致使透射光散射和反射作用致使透射光强强度减弱。度减弱。真溶液真溶液散射作用散射作用较较弱，可用空白弱，可用空白进进行行补偿补偿。混混浊浊溶溶液液散散射射作作用用较较强强，影影响响结结果果测测定定，故故要要求求被被测测溶液溶液为为澄清溶液澄清溶液。2 2、光学因素、光学因素(4)非平行光非平行光倾倾斜斜光光通通过过吸吸收收池池的的实实际际光光程程将将比比垂垂直直照照射射的的平平行行光的光程光的光程长长，使，使吸光度增加吸光度增加，影响，影响测测量量值值。透透光光率率测测量量误误差差（T）来来自自仪仪器器的的噪声。噪声。浓浓度度测测量量结结果果的的相相对对误误差差（c/c）与
31、与透透光光率率测测量量误误差差关关系系可可由由朗朗伯伯-比比尔定律导出：尔定律导出：浓浓度度测测量量的的相相对对误误差差取取决决于于透透光光率率T和和透光率测量误差透光率测量误差T的大小。的大小。相对误差与透光率的关系相对误差与透光率的关系（三）透光率测量误差（三）透光率测量误差一、主要部件一、主要部件光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器信号显示系统信号显示系统第二节第二节 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计（一）光源光源的作用是提供激发能，使待测分子产生吸收。光源的作用是提供激发能，使待测分子产生吸收。1 1、光源的要求光源的要求 发射发射连续辐射连续辐射光；光；有足够的有足够的
32、辐射强度辐射强度及良好的及良好的稳定性稳定性；辐射强度随波长的辐射强度随波长的变化变化应尽可能应尽可能小小；光源的使用光源的使用寿命长寿命长，操作方便。，操作方便。（一）光源2、光源的种光源的种类类 常常用用的的光光源源有有热热辐辐射射光光源源（如如钨钨灯灯、卤卤钨钨灯灯）和和气气体体放放电电光光源源（如如氢氢灯灯和和氘氘灯灯）两两类类。(1)钨钨灯灯和和碘碘钨钨灯灯：3402500nm，可可见见光光区区内内辐辐射射强强度度与与工工作作电压电压的的4次方成正比。次方成正比。(2)氢氢灯灯和和氘氘灯灯：160375nm，氘氘灯灯比比同同功功率率的的氢氢灯灯光光强强度度大大35倍。倍。(3)激激光
33、光紫紫外外光光源源：高高强强度度、高高单单色色性性，氩氩离离子子激激光光器器、可可调调谐谐染料激光器。染料激光器。单单色色器器是是从从光光源源的的复复合合光光中中分分出出单单色色光光的的光光学学装装置置，其其主主要要特特点是产生点是产生光谱纯度高光谱纯度高、色散率高且波长可调节。、色散率高且波长可调节。由由进进光光狭狭缝缝、准准直直镜镜、色色散散元元件件、聚聚焦焦元元件件和和出出光光狭狭缝缝等等几几个个部分组成，核心部件是色散元件。部分组成，核心部件是色散元件。（二）单色器（二）单色器 单色器光路示意图单色器光路示意图棱镜色散与光栅色散棱镜色散与光栅色散（二）单色器（二）单色器1、色散元件、色
34、散元件(1)棱镜：利用折射率差别制成。棱镜：利用折射率差别制成。(2)光光栅栅：利利用用光光的的衍衍射射与与干干涉涉作作用用制制成成。每每1mm玻璃上刻玻璃上刻6001200条槽。条槽。每每条条刻刻线线相相当当于于1条条狭狭缝缝，光光在在未未刻刻部部分分发发生反射，各反射光束间的干涉引起色散。生反射，各反射光束间的干涉引起色散。（二）单色器（二）单色器2、准直、准直镜镜以以狭狭缝缝为为焦点焦点的的聚光聚光镜镜。将将进进入入单单色器的色器的发发射光射光变变成成平行光平行光；将色散后的平行将色散后的平行单单色光色光聚集聚集于于出光狭出光狭缝缝。（二）单色器（二）单色器3、狭、狭缝缝狭狭缝缝宽宽度直
35、接影响度直接影响单单色光的色光的纯纯度。度。狭狭缝缝过宽过宽，单单色光色光不不纯纯；狭；狭缝缝过过窄窄，光通量光通量过过小小，灵敏度降低。，灵敏度降低。定性定性分析宜采用分析宜采用较小较小的狭缝宽度。的狭缝宽度。定量定量分析宜采用分析宜采用较大较大的狭缝宽度。的狭缝宽度。（二）单色器（二）单色器4、杂杂散光及其消除散光及其消除杂杂散散光光：指指出出射射光光束束中中混混有有的的与与仪仪器器所所指指示示的的波波长长相相差差较较大大的的光光波。波。杂杂散光会散光会严严重影响吸光度重影响吸光度测测定。定。杂杂散散光光产产生生的的原原因因：各各光光学学部部件件和和单单色色器器的的外外壳壳内内壁壁的的反反
36、射射；大大气或化学部件表面气或化学部件表面尘尘埃的埃的散射散射；光学元件；光学元件霉霉变变、腐、腐蚀蚀。可将可将单单色器用罩壳色器用罩壳封封闭闭起来，罩壳内起来，罩壳内涂涂有有黑体黑体以吸收以吸收杂杂散光。散光。即比色皿，用于盛放待测溶液的容器。即比色皿，用于盛放待测溶液的容器。1 1、光学玻璃吸收池、光学玻璃吸收池 可见光区可见光区2 2、熔融石英吸收池、熔融石英吸收池 可见光区、紫外光区可见光区、紫外光区用于盛放供试液和参比液的比色皿，应用于盛放供试液和参比液的比色皿，应厚度相同厚度相同，两只比色，两只比色皿的皿的透光率之差小于透光率之差小于0.5%0.5%。（三）吸收池将将光光信信号号转
37、转变变成成电电信信号号的的光光电电转转换换元元件件，其其产产生生的的电信号与照射光强度电信号与照射光强度成成正比正比。要求：要求：在测量范围内具有在测量范围内具有高灵敏度高灵敏度；对辐射能量的对辐射能量的响应快响应快、线性关系好线性关系好、线性范围、线性范围宽宽；对不同波长的辐射影响性能对不同波长的辐射影响性能相同且可靠相同且可靠；稳定性好稳定性好，噪声噪声水平水平低低。（四）检测器1 1、光电池、光电池2 2、光电管、光电管3 3、光电倍增管、光电倍增管4 4、光二极管阵列检测器、光二极管阵列检测器（四）检测器1 1、光电池、光电池硒硒光电池：敏感光区光电池：敏感光区300800nm3008
38、00nm，易疲劳，寿命短。，易疲劳，寿命短。硅硅光电池：紫外光区及可见光区。光电池：紫外光区及可见光区。（四）检测器2 2、光电管、光电管以以一一弯弯成成半半圆圆柱柱形形的的金金属属片片为为阴阴极极，阴阴极极内内表表面面镀镀有有碱碱金金属属或或碱金属碱金属氧化物氧化物等等光敏层光敏层；在圆柱形的中心置一在圆柱形的中心置一金属丝金属丝为为阳极阳极，可接受阴极释放的电子。，可接受阴极释放的电子。两电极密封于玻璃管或石英管内并抽两电极密封于玻璃管或石英管内并抽真空真空。红敏红敏光电管光电管(镀有镀有银和氧化铯银和氧化铯)可用于可用于6251000nm6251000nm波长。波长。蓝敏蓝敏光电管光电管
39、(镀有镀有锑和铯锑和铯)可用于可用于200625nm200625nm波长。波长。光电管灵敏度高，光敏范围宽，不易疲劳。光电管灵敏度高，光敏范围宽，不易疲劳。（四）检测器 光电管检测器示意图光电管检测器示意图3 3、光电倍增管、光电倍增管一种加上多级一种加上多级倍增电极倍增电极的的光电管光电管。外外壳壳由由玻玻璃璃或或石石英英制制成成，阴阴极极表表面面涂涂有有光光敏敏物物质质，在在阴阴极极与与阳阳极极之之间间装装有有一一系系列列次次级级电电子子发发射射极极，即即电电子子倍倍增增极。极。辐辐射射光光子子撞撞击击阴阴极极时时发发射射光光电电子子，该该电电子子被被电电场场加加速速并并撞撞击击第第一一倍
40、倍增增极极，撞撞出出更更多多电电子子，依依次次进进行行，最最后后阳阳极极收收集集到到的的电电子子数数是是阴阴极极发发射射电电子子的的10105 510106 6倍倍。（四）检测器 光电倍增管示意图光电倍增管示意图光电管输出的电信号很弱，需经过光电管输出的电信号很弱，需经过放大放大才能以某种方式将测量才能以某种方式将测量结果显示出来，一般的分光光度计多具有结果显示出来，一般的分光光度计多具有荧屏荧屏显示、显示、结果打印结果打印及及吸收曲线扫描吸收曲线扫描等功能。等功能。现代的分光光度计装备有现代的分光光度计装备有计算机光谱工作站计算机光谱工作站，可对数字信号进，可对数字信号进行采集、处理与显示，
41、并对各系统进行自动控制。行采集、处理与显示，并对各系统进行自动控制。（五）信号处理和显示系统1 1、单光束分光光度计、单光束分光光度计2 2、双光束分光光度计、双光束分光光度计3 3、双波长分光光度计、双波长分光光度计4 4、全波长分光光度计、全波长分光光度计二、分光光度计的类型在在单单光光束束光光学学系系统统中中，单单色色器器色色散散后后的的单单色色光光进进入入吸吸收收池池。经经单单色色器器分分光光后后形形成成一一束束平平行行光光，轮轮流流通通过过参参比比溶溶液液和和样品溶液，以进行吸光度的测定。样品溶液，以进行吸光度的测定。这这种种简简易易型型分分光光光光度度计计结结构构简简单单，操操作作
42、方方便便，维维修修容容易易，适用于适用于常规分析常规分析。（一）单光束分光光度计光光源源发发出出光光经经单单色色器器分分光光后后，经经旋旋转转扇扇面面镜镜（切切光光器器）分分为为强强度度相相等等的的两两束束光光，一一束束通通过过参参比比池池，另另一一束束通通过过样样品品池池，光光度度计计能能自自动动比比较较两两束束光光的的强强度度，此此比比值值即即为为试试样样的的透透射射比比，经经对对数数变变换换将它转换成将它转换成吸光度吸光度，并作为波长函数记录下来。，并作为波长函数记录下来。双光束分光光度计一般都能双光束分光光度计一般都能自动记录自动记录吸收光谱曲线。吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参
43、比池和样品池，因而能由于两束光同时分别通过参比池和样品池，因而能自动消除光源自动消除光源强度变化强度变化所所引起引起的的误差误差。（二）双光束分光光度计由由同一光源同一光源发出的光被发出的光被分为两束分为两束，分别经过两个，分别经过两个单色器单色器，得，得到两束到两束不同波长不同波长的的单色光单色光。利用切光器使两束光以一定频率利用切光器使两束光以一定频率交替照射同一吸收池交替照射同一吸收池，然后，然后测定两个波长处的测定两个波长处的吸光度差值吸光度差值A A。A=A1 A2=(1 2)lc（三）双波长分光光度计优点：优点：双双波波长长分分光光光光度度计计只只利利用用1个个吸吸收收池池，消消除
44、除了了吸吸收收池池及及参参比比池池所引起的所引起的测测量量误误差；差；用用同一光源同一光源得到两束光，可减小因光源得到两束光，可减小因光源电压变电压变化化产产生的影响。生的影响。（三）双波长分光光度计光光电电二二极极管管阵阵列列（PDAPDA）是是在在晶晶体体硅硅上上紧紧密密排排列列一一系系列列光光电电二二极极管管检检测测管管，光光经经全全息息光光栅栅表表面面色色散散并并透透射射到到二二极极管管阵阵列列检检测测器器上上，被其中的光二极管接受。被其中的光二极管接受。二二极极管管输输出出的的电电信信号号强强度度与与光光强强度成正比。度成正比。两两个个二二极极管管中中心心距距离离的的波波长长单单位位
45、称为称为采样间隔采样间隔。二极管数目越多，分辨率越高。二极管数目越多，分辨率越高。（四）全波长分光光度计全全波波长长分分光光光光度度计计同同时时检检测测透透过过样品样品复色光复色光。它它具具有有灵灵敏敏度度高高、噪噪音音低低、线线性性范范围围宽宽等等优优点点，可可用用作作高高效效液液相相色谱检测器。色谱检测器。（四）全波长分光光度计（一）光学性能（一）光学性能1 1、辐射波长、辐射波长2 2、仪器的测量范围、仪器的测量范围3 3、仪器的重复性及准确度、仪器的重复性及准确度4 4、杂散光、杂散光三、光学性能与仪器校正1、辐辐射波射波长长(1)波波长长范范围围：指：指仪仪器所器所能能测测量量的波的
46、波长长范范围围，通常，通常为为200800nm。(2)光光谱带宽谱带宽：指在：指在最大透光最大透光强强度一半度一半处处曲曲线线的的宽宽度，度，通常通常为为6nm以下。以下。(3)波波长长准确度准确度：仪仪器所器所显显示示的的波波长长数数值值与与单单色光的色光的实际实际波波长长值值之之间间的的误误差差，规规定定紫外紫外光区光区1nm，500nm附近附近2nm。(4)波波长长重复性：重复使用同一波重复性：重复使用同一波长长，单单色光色光实际实际波波长长的的变动值变动值，通常通常1nm。三、光学性能与仪器校正2、仪仪器的器的测测量范量范围围透光率表示：透光率表示：-1.0%200.0%吸光度表示：吸
47、光度表示：-0.5A3.000A3、仪仪器的重复性及准确度器的重复性及准确度光度重复性：指光度重复性：指同同样样情况情况下重复下重复测测量透光率的量透光率的变动变动，通常，通常0.5%。光度准确度：指以透光率光度准确度：指以透光率测测量量值值的的误误差表示。透光率差表示。透光率满满量程量程误误差差为为0.5%（铬铬酸酸钾钾溶液）溶液）三、光学性能与仪器校正4、杂杂散光散光通常以通常以测测光信号光信号较较弱弱的波的波长处长处所含所含杂杂散光的散光的强强度百分比度百分比为为指指标标。药药典典规规定：定：220nm处处NaI（1g/100ml）透光率）透光率0.8%，340nm处处Na2NO2（5g
48、/100ml）透光率）透光率0.8%。三、光学性能与仪器校正1、波长的校正、波长的校正 常用常用汞灯汞灯（237.83nm、253.65 nm等）或等）或氘灯氘灯（486.02 nm、656.10nm）中的较强谱线进行校正。中的较强谱线进行校正。高氯酸钬溶液高氯酸钬溶液校正双光束仪器。校正双光束仪器。2、吸光度的校正、吸光度的校正 使用使用重铬酸钾的硫酸溶液重铬酸钾的硫酸溶液，在规定的波长处测定并，在规定的波长处测定并计算计算其其吸吸收系数收系数，并与规定的吸收系数比较，来检定分光光度计吸光，并与规定的吸收系数比较，来检定分光光度计吸光度的度的准确度准确度。3、杂散光的检查、杂散光的检查 测定
49、规定浓度的测定规定浓度的碘化钠碘化钠或或亚硝酸钠亚硝酸钠溶液在规定波长处的透光溶液在规定波长处的透光率来进行检查。率来进行检查。（二）仪器校正一、检测波长的选择一、检测波长的选择1 1、定量分析中，测定波长一般选择在被测组分、定量分析中，测定波长一般选择在被测组分最大吸收波长最大吸收波长处。处。2 2、如果被测组分有几个最大吸收波长时，可选择、如果被测组分有几个最大吸收波长时，可选择不易出现干不易出现干扰吸收扰吸收、吸光度较大吸光度较大而且而且峰顶比较平坦峰顶比较平坦的最大吸收波长。的最大吸收波长。3 3、若、若干扰物质干扰物质在最大吸收波长处在最大吸收波长处有较强的吸收有较强的吸收，可选用非
50、最可选用非最大吸收大吸收处的波长。处的波长。第三节第三节 紫外紫外-可见分光光度法分析条件的选择可见分光光度法分析条件的选择所选择的溶剂应所选择的溶剂应易于溶解样品易于溶解样品而而不不与样品与样品发生作用发生作用，且，且在测定波长区间内在测定波长区间内吸收小吸收小，不易挥发不易挥发。常用溶剂的截止波长常用溶剂的截止波长二、溶剂的选择溶溶 剂剂截止波长（截止波长（nm）溶溶 剂剂截止波长（截止波长（nm）水水200 环己烷环己烷200 乙乙 腈腈210 正己烷正己烷220 95%乙醇乙醇210 二氯甲烷二氯甲烷235 乙乙 醚醚210 三氯甲烷三氯甲烷245 异丙醇异丙醇210 四氯化碳四氯化碳