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1、细胞化学染色，是一种以形态为基础，结合运用化学或生物化学技术对血细胞内各种化学成分作定位、定性及半定量分析的方法。用于研究血细胞生理、病理和化学结构；临床上为某些血液病的诊断、鉴别诊断、疗效观察、预后监测和发病机制的探讨，提供重要依据。第1页/共73页血细胞化学染色的基本要求是在原位显示细胞成分和结构，反应产物应是有色沉淀物，具有一定的稳定性。血细胞化学染色可显示糖原、脂类、酶、蛋白质等。第2页/共73页（一）固定固定有物理法与化学法，物理法为干燥和火焰固定，化学法最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。血细胞化学染色流程第3页/共73页（二）显示 1、偶氮偶联法：利用人工合成的酶底物，在酶作用下
2、，产生分解产物，再与重氮盐结合引起偶氮偶联，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的存在。2、联苯胺法：粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶作用于过氧化氢，释放新生态氧，使无色的联苯胺形成蓝色沉淀。第4页/共73页3、普鲁士蓝法：细胞内、外铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。4、雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀。5、金属沉着法其他尚有物理学方法，如脂溶性染料染色（显示脂质）、荧光显示、放射自显影以及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学诊断。第5页/共73页（三）细胞化学定量粗略估量，以染色反应的强弱，受色的深浅，人为地区别为阴性和
3、各种程度的阳性。百分法，只能反映细胞阳性率，不能反映受色强弱。积分法，是常用的半定量法，将等级估量与百分率相结合它既反映了细胞阳性率的高低，又反映了细胞受色的强弱。第6页/共73页下面介绍几种常用的细胞化学染色方法这些方法学在白血病的鉴别诊断上具有重要意义。第7页/共73页一、过氧化物酶染色（POX）（一）四甲基联苯胺法四甲基联苯胺法(TMB)(TMB)【原理】粒细胞和单核细胞的胞浆内的髓过氧化物酶（POX orMPO）分解过氧化氢，释放新生态氧，使无色联苯胺氧化成蓝色联苯胺，后者进一步变成棕色化合物沉着于细胞质内。第8页/共73页POX 新生态氧 OO过氧化氢（基质中）四甲基联苯胺TMBTM
4、B （无色）联苯胺蓝（蓝色）亚硝基铁氰化钠 蓝色颗粒蓝色颗粒（浆内酶部位）（浆内酶部位）粒、单核粒、单核细胞胞浆细胞胞浆【原理原理】四甲基苯醌二胺四甲基苯醌二胺(棕色棕色)自我脱氢氧化自我脱氢氧化第9页/共73页【试剂】1%TMB亚硝基铁氰化钠饱和溶液1%过氧化氢溶液稀过氧化氢溶液瑞氏染色液第10页/共73页【操作】1.取0.1%TMB乙醇溶液lml，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10ll，混合溶液呈淡棕黄色棕黄色。2.在新鲜干燥的血片上，加混合溶液0.5ml,放置lmin后，再加稀过氧化氢溶液0.7ml，染色6min。3.瑞氏染液复染1520min。4.油镜镜检。第11页/共73页【结果】细胞质内
5、有蓝黑色颗粒蓝黑色颗粒者为阳性。（）无颗粒沉着；（）颗粒细小，分布稀疏；（+）颗粒较粗，局灶分布；（+）颗粒粗大，分布较密，占胞质 1/22/3；（+）颗粒粗大，呈团块分布；（+）全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核。第12页/共73页第13页/共73页骨髓片骨髓片POXPOX染色染色第14页/共73页【临床意义】（1）粒系：POX主要分布在粒细胞和单核细胞内，随着粒细胞成熟的程度而逐渐增强，中性分叶核粒细胞为强阳性。嗜酸性粒细胞阳性程度最强，其阳性颗粒比中性粒细胞粗大，有折光。碱性粒细胞为阴性。第15页/共73页（2）单核细胞：原始单核细胞为阴性反应，幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性反应，颗粒细
6、小，弥散分布。第16页/共73页（3）其他细胞淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、组织细 胞、巨核细胞均呈阴性反应。（4）血小板过氧化物酶主要定位于幼稚型巨核细胞的核膜上，可作为原巨核细胞的一种标志物，有助于FAB M7 的识别。第17页/共73页（5）过氧化物酶染色主要用于鉴别急性白血病类型，急性髓细胞白血病多呈阳性反应，以M3和M2型反应最强，MI和M5型反应较弱，故有助于区别M3和M5型。急性淋巴细胞白血病呈POX阴性反应，故为急性髓细胞和淋巴细胞白血病鉴别的重要指标。第18页/共73页 注意事项注意事项 1.涂片应新鲜制作、厚薄适宜。2.TMB 配制在8588的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90
7、95乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而使显色反应减弱或消失。3.过氧化氢溶液需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示过氧化氢过浓。若过氧化氢加于血片上不产生气泡，则示无效。4.染色液适宜pH值应为5.5，若pH值 10个铁颗粒。正常范围：30%90%，平均60%，多见型，少见型，无、型。第65页/共73页细胞内铁第66页/共73页（3）环形铁粒幼红细胞：指含铁颗粒6个，其中2/3以上铁颗粒围绕核周排列成完整环形或不完整环形。正常或非铁粒幼细贫血无环形铁粒幼细胞，铁粒幼细贫血中环形铁粒幼细胞6%。第67页/共73页环形铁粒
8、幼细胞第68页/共73页【临床意义】1缺铁性贫血时，骨髓细胞外铁明显减少，为“一”“士”，细胞内铁平均5.9%，仅为I型。经有效铁剂治疗后，外铁增多。因此骨髓铁染色是诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的重要方法。第69页/共73页2铁粒幼细胞性贫血时，外铁“2”一“3”，内铁平均70%，其铁粒粗大，以 型为主，出现较多环形铁粒幼细胞。因此，本实验是诊断铁粒幼细胞贫血的有效方法。MDS也可出现环形铁粒幼细胞。第70页/共73页 3.非缺铁性贫血如巨幼细胞贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等骨髓铁正常或不同程度的增加。但再生障碍性贫血不会出现环形铁粒幼细胞，可作为与MDS鉴别的参考。4.继发性贫血的部分患者细胞内铁可减少，但细胞外铁不减少。第71页/共73页谢谢！谢谢！第72页/共73页感谢您的观看！第73页/共73页