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1、细胞化学染色,沧州医专医学技术系 侯振江,细胞化学染色,是一种以形态为基础,结合运用化学或生物化学技术对血细胞内各种化学成分作定位、定性及半定量分析的方法。 用于研究血细胞生理、病理和化学结构; 临床上为某些血液病的诊断、鉴别诊断、疗效观察、预后监测和发病机制的探讨,提供重要依据。,血细胞化学染色的基本要求是在原位显示细胞成分和结构,反应产物应是有色沉淀物,具有一定的稳定性。 血细胞化学染色可显示糖原、脂类、酶、蛋白质等。,(一)固定 固定有物理法与化学法, 物理法为干燥和火焰固定, 化学法最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。,血细胞化学染色流程,(二)显示 1、偶氮偶联法:利用人工合成的酶底
2、物,在酶作用下,产生分解产物,再与重氮盐结合引起偶氮偶联,使其形成不溶性的偶氮色素,以此证明酶的存在。 2、联苯胺法:粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶作用于过氧化氢,释放新生态氧,使无色的联苯胺形成蓝色沉淀。,3、普鲁士蓝法:细胞内、外铁与酸性亚铁氰化钾作用,形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。 4、雪夫反应:过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙醛基,醛基与雪夫试剂作用,使无色品红形成红色沉淀。 5、金属沉着法 其他尚有物理学方法,如脂溶性染料染色(显示脂质)、荧光显示、放射自显影以及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学诊断。,(三)细胞化学定量 粗略估量,以染色反应的强弱,受色的深浅,人为地区别为阴性和各种
3、程度的阳性。 百分法,只能反映细胞阳性率,不能反映受色强弱。 积分法,是常用的半定量法,将等级估量与百分率相结合它既反映了细胞阳性率的高低,又反映了细胞受色的强弱。,下面介绍几种常用的细胞化学染色方法 这些方法学在白血病的鉴别诊断上具有重要意义。,一、过氧化物酶染色(POX),(一)四甲基联苯胺法(TMB) 【原理】 粒细胞和单核细胞的胞浆内的髓过氧化物酶(POX orMPO)分解过氧化氢,释放新生态氧,使无色联苯胺氧化成蓝色联苯胺,后者进一步变成棕色化合物沉着于细胞质内。,POX,新生态氧 O,过氧化氢 (基质中),四甲基联苯胺TMB (无色),联苯胺蓝(蓝色),亚硝基铁氰化钠,蓝色颗粒 (
4、浆内酶部位),粒、单核 细胞胞浆,【原理】,四甲基苯醌二胺,(棕色),自我脱氢氧化,【试剂】 1%TMB 亚硝基铁氰化钠饱和溶液 1%过氧化氢溶液 稀过氧化氢溶液 瑞氏染色液,【操作】 1. 取0.1%TMB乙醇溶液lml,加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10l,混合溶液呈淡棕黄色。 2. 在新鲜干燥的血片上,加混合溶液0.5ml, 放置lmin后,再加稀过氧化氢溶液0.7ml,染色6min 。 3. 瑞氏染液复染1520min 。 4. 油镜镜检。,【结果】 细胞质内有蓝黑色颗粒者为阳性。 () 无颗粒沉着; () 颗粒细小 ,分布稀疏; (+) 颗粒较粗,局灶分布; (+) 颗粒粗大,分布较密,占
5、胞质 1/22/3; (+) 颗粒粗大,呈团块分布; (+) 全部胞质均部满颗粒,可覆盖胞核。,骨髓片POX染色,【临床意义】 (1)粒系: POX主要分布在粒细胞和单核细胞内,随着粒细胞成熟的程度而逐渐增强,中性分叶核粒细胞为强阳性。 嗜酸性粒细胞阳性程度最强,其阳性颗粒比中性粒细胞粗大,有折光。 碱性粒细胞为阴性。,(2)单核细胞: 原始单核细胞为阴性反应, 幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性反应,颗粒细小,弥散分布。,(3)其他细胞 淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、组织细 胞、巨核细胞均呈阴性反应。 (4)血小板过氧化物酶 主要定位于幼稚型巨核细胞的核膜上,可作为原巨核细胞的一种标志物,有助
6、于FAB M7的识别。,(5)过氧化物酶染色 主要用于鉴别急性白血病类型, 急性髓细胞白血病多呈阳性反应,以M3和M2型反应最强,MI和M5型反应较弱, 故有助于区别M3和M5型。 急性淋巴细胞白血病呈POX阴性反应,故为急性髓细胞和淋巴细胞白血病鉴别的重要指标。,注意事项,涂片应新鲜制作、厚薄适宜。 TMB 配制在8588的乙醇溶液中染色效果较好,勿用9095乙醇,否则细胞表面蛋白质很快凝固,妨碍试剂向胞内渗入而使显色反应减弱或消失。 过氧化氢溶液需新鲜配制,其浓度与加入量不能随意更改。涂片中粒细胞看不见阳性颗粒,红细胞呈棕色或绿色,即表示过氧化氢过浓。若过氧化氢加于血片上不产生气泡,则示无
7、效。 染色液适宜pH值应为5.5,若pH值 5.0会出现假阳性结果。 试剂应置于低温暗处,防止光线照射失效。 染色时加稀过氧化氢溶液之后必须与染色液充分混匀,否则同一片子上细胞染色情况不一致。,AML-M1,M1 - POX(+),二、苏丹黑B染色,【原理】 苏丹黑B (sudan black B , SB )是一种能溶解于脂肪中的色素染料,可使细胞内的中性脂肪、磷脂和类固醇着色,即使细胞内微细结构的脂类物质也能显示出来。,【试剂】 1. 10%甲醛液。 2. 苏丹黑B乙醇溶液,【操作】 1干燥血片或骨髓片在甲醛蒸气中固定。 2自来水冲洗。 3放人染色液中,37 染色3060min。 4用70
8、%乙醇脱色12min,水洗lmin。. 5瑞氏染液复染2030min。,【结果】 脂类呈黑色或棕黑色颗粒,定位于细胞浆中 (+) 颗粒很小,细小、稀疏,或胞质局部面积的1/4有致密的颗粒。 (+)颗粒较少,或胞质面积的1/2出现黑色颗粒。 (+)颗粒较密,或胞质面积的3/4出现黑色颗粒。 (+) 颗粒极密,颗粒间无间隙。,【临床意义】 1. 粒细胞系 早幼粒及以下阶段随着细胞成熟,阳性颗粒逐渐增加。 早期原粒细胞一般为阴性,少数细小点状颗粒代表线粒体被染色 晚期原粒细胞可出现阳性颗粒,其颗粒限于胞浆的某一区域。,2. 单核细胞系 阳性,颗粒细小,分布弥散,形状不规则。原单核细胞为阴性。 3红细
9、胞系、淋巴细胞系均呈阴性反应 4尼曼一匹克细胞和戈谢细胞均为阳性反应。,5苏丹黑B和过氧化物酶染色临床意义相似,主要用于急性白血病类型的鉴别。 苏丹黑B染色较过氧化物酶染色更敏感,但特异性不如过氧化物酶染色(极少数急性淋巴细胞白血病可为阳性)。,M1-SBB(+),M2-SBB(+),三、过碘酸一雪夫(PAS)染色,【原理】 胞浆内存在糖原或多糖类物质(如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等)中的乙二醇基(CHOH-CHOH)经过碘酸(periodic acid)氧化,转变为二醛基(CHO-CHO),与雪夫(Schiff )试剂中的无色品红结合,形成紫红色染料而沉积于胞浆中。该反应称为过碘酸一雪夫(
10、PAS)阳性反应。,【结果】 (1)粒细胞系: 原粒细胞多呈阴性反应,也可弱阳性。 自早幼粒细胞以后随着细胞的成熟程度,阳性反应逐渐增强。 嗜酸粒细胞颗粒本身不着色,但颗粒间的胞质呈弥漫性阳性反应; 嗜碱粒细胞为阳性反应,颗粒紫红色,大小不一。,中性粒细胞糖原含量参考标准 (-) 胞质无颗粒 (+) 胞质呈淡红色,无颗粒 (+) 胞质呈红色,有少量颗粒 (+) 胞质呈暗红色 ,颗粒较密 (+)胞质呈紫红色,颗粒极密,过碘酸-Schiff反应(PAS),(2)淋巴细胞系: 大多数淋巴细胞呈阴 性反应, 少数为(+)的阳性反应。 淋巴细胞糖原含量程度参考标准 (-) 胞质内无颗粒 (+) 胞质内有
11、颗粒 (+) 有较粗红色颗粒 (+) 有粗大红色颗粒 (+) 颗粒粗大并有红色块状,(3)红细胞系: 幼红细胞和红细胞呈阴性反应 红细胞系列糖原含量程度参考标准 (-) 胞质无颗粒 (+) 有少数红色颗粒 (+) 有较粗红色颗粒或弥漫红色 (+) 有粗大红色颗粒或深红色 (+)有粗大红色块状或紫红色,(4)巨核细胞: 巨核细胞和血小板染色反应均为阳性 巨核细胞糖原含量程度参考标准 (-) 胞质无颗粒 (+) 少量糖原包涵体 (+) 中等量糖原包涵体,定位于核膜 出或分散胞质中,占胞质1/3 (+)大量糖原包涵体分散于胞质的1/2 (+)糖原包涵体充满整个胞质,PAS 巨核细胞,巨核细胞包涵体,
12、(5)单核细胞呈阴性或阳性,颗粒细小,往往位于胞质边缘; 浆细胞大多呈阴性,少数为红色颗粒阳性; 组织细胞为阴性反应; 巨噬细胞可呈阳性,为红色颗粒反应。,【临床意义】 (1)M6与巨幼贫的鉴别 M6的幼红细胞PAS可呈强阳性,积分明显增高,巨贫、再障、溶贫时PAS反应为阴性。 (2)急性白血病的类型鉴别 ALL,PAS呈大块状阳性,也可是阴性,AML为阴性,急性单核细胞白血病时原单核细胞及幼单核细胞PAS阳性,积分增高,阳性颗粒小而多,呈弥散分布。,ALL-L1,L1 PAS(+),AML-M5,M5 PAS(+),AML-M6,AML-M6 PAS(+),AML-M7,M7 PAS(+),
13、(3)巨核细胞和Sternberg细胞鉴别 巨核细胞PAS强阳性,Sternberg细胞为阴性或弱阳性。 (4)戈谢氏细胞强阳性,尼曼-皮克细胞阴性或弱阳性。 (5)淋巴肉瘤、霍奇金病等,淋巴细胞的糖原积分增高;一般的病毒感染,糖原积分在正常范围内。,四、中性粒细胞碱性磷酸酶染色,偶氮偶联法(Kaplow法) 【原理】中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶在pH 9.29.8缓冲液中,能水解磷酸萘酚钠,并释放出磷酸与萘酚。再以重氮盐与萘酚偶联成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞浆中。,【结果】 坚牢蓝RR阳性为紫黑色颗粒, 坚牢紫酱GBC阳性为棕红色沉淀。 “一”阴性反应,胞浆中无阳性染色颗粒。 “”胞浆中含有
14、少量颗粒或呈弥散浅红色(或弥散紫色)。 “2”胞浆中含有中等量颗粒或弥散受色。 “3”胞浆中有丰富的颗粒或弥散深色,胞核清晰。 “4”有极丰富的粗大颗粒,充满胞浆,或弥散深色,胞核不清晰。,中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP),偶氮偶联法,NAP积分法 计数100个成熟中性粒细胞,按其反应强度分级,各级百分率与其级数乘积的总和,即为积分。 例如: NAP反应结果(%) (-) (+) (+) (+) (+) 20 40 20 15 5 积分=(020)+(220)+(315)+(45)=145 参考值:正常人血细胞碱性磷酸酶除成熟中性粒细胞(杆状核及分叶核)可见阳性外,其他血细胞均为阴性。 中性粒细
15、胞NAP活性积分值一般为1050分,但有时可高达162分。,【临床意义】 (1)生理变化: 新生儿NAP增高,成人较儿童减低,老人更低;激烈运动增高; 月经期经前增高,行经后降低,经后期恢复正常; 妊娠期2-3月轻度增高,以后逐渐增高,分娩时达到高峰,产后恢复正常。,(2)、病理变化 增高:严重化脓性感染、类白血病反应、AA、CML加速期、ALL、CLL、恶性淋巴瘤、癌转移、MM、真红、骨髓纤维化等。 减低:PNH、CML、恶性组织细胞病、MDS。,(3)疾病鉴别诊断 慢粒与类白的鉴别:CML减低,类白增高。 急性白血病的鉴别:AML减低,ALL增高。 PNH与AA鉴别:PNH减低,AA增高。
16、 病原微生物的鉴别:病毒感染减低,细菌感染增高。,NAP (+),CML-NAP(-),五、骨髓铁染色,【原理】正常人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中,骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用,形成普鲁士蓝反应,形成蓝色的亚铁氰化铁沉淀,定位于含铁的部位,从而反映骨髓中铁的储存量。化学反应过程为: 4 Fe3+ 3 K4Fe(CN)6 Fe4Fe(CN)6312 K+ (含铁物质) (亚铁氰化钾) (亚铁氰化铁),【结果】 (1)细胞外铁的观察 : 细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小株状或团块状。 以油镜观察定级标准 (-) 无铁粒可见。 (+) 少数铁粒或铁小珠。 (+) 较多铁粒和铁小珠
17、。 (+) 很多铁粒、铁小珠和少数小块。 (+)极多铁粒、铁小珠并有很多小块,密集成堆。 正常范围:+,“+”占2/3,“+”占1/3。,细胞外铁,(2)细胞内铁观察: 细胞内铁指有核红细胞胞质内出现蓝色颗粒,以油镜计100个中、晚幼红细胞,记录胞质中含有蓝色小颗粒(即铁粒红细胞)的比值。并根据细胞铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布情况,将铁粒幼红细胞分为如下四型:,型:仅含1-2个铁颗粒。 型:含3-4个铁颗粒。 型:含6-9个以上铁颗粒。 型:10个铁颗粒。 正常范围:30% 90% ,平均60%, 多见型,少见型,无、型。,细胞内铁,(3)环形铁粒幼红细胞: 指含铁颗粒6个,其中2/
18、3以上铁颗粒围绕核周排列成完整环形或不完整环形。 正常或非铁粒幼细贫血无环形铁粒幼细胞,铁粒幼细贫血中环形铁粒幼细胞6% 。,环形铁粒幼细胞,【临床意义】 1缺铁性贫血时, 骨髓细胞外铁明显减少,为“一”“士”,细胞内铁平均5.9%,仅为I型。 经有效铁剂治疗后,外铁增多。 因此骨髓铁染色是诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的重要方法。,2铁粒幼细胞性贫血时, 外铁“2”一“3”,内铁平均70%,其铁粒粗大,以 型为主,出现较多环形铁粒幼细胞。 因此,本实验是诊断铁粒幼细胞贫血的有效方法。 MDS也可出现环形铁粒幼细胞。,3. 非缺铁性贫血 如巨幼细胞贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等骨髓铁正常或不同程度的增加。 但再生障碍性贫血不会出现环形铁粒幼细胞,可作为与MDS鉴别的参考。 4. 继发性贫血的部分患者细胞内铁可减少,但细胞外铁不减少。,谢谢!,