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1、几种细胞实验步骤一EC原代的培养 实验前准备器械 消化酶 M199培养基 其他大号止血钳10把，肾形盘2个，圆头不锈钢针头若干，细胞培养瓶若干，50ml离心管若干，大号组织剪2把，弯镊1把，弯头组织剪1把，酒精棉球若干,巴氏吸管若干，胶头若干 二型胶原酶（1mg/ml）胰酶Try(2.5mg/ml)M199培养原液85mlFBS 15mlL-Glu 1ml浓度为200mmol/LECGS 1ml浓度为15-20ng/ml离心液细胞培养瓶NS.第1页/共40页人脐带纵剖面和直观图第2页/共40页实验操作步骤1将灭菌后的实验物品按操作顺序摆放在超净工作台内（超净工作台内事先UV灭菌）注意：紫外灭菌
2、时应关闭日光灯，送风机，人员要离开生化间，20分钟后返回关闭紫外灯，打开日光灯，风机。5分钟后进行实验 第3页/共40页2打开NS.，点燃酒精灯（不建议使用），将酒精棉铺开在操作台中央，方便将所有器械和瓶盖的摆放。第4页/共40页3 将半月盘内倒入少许无菌NS.,取出新鲜脐带轻轻放入半月盘内，用灭菌后的脱脂棉球将脐带外周的血迹擦干，将脐带两端血迹擦干以便暴露静脉血管。将圆头不锈钢针头轻缓的插入两端静脉血管内，并顺势用止血钳夹死固定。注意：本实验操作时要戴好橡胶手套，操作前进行医用酒精擦拭消毒，当脐带过短时，只要一端插入圆头针，另一端用止血钳夹死。第5页/共40页第6页/共40页4用无菌NS.,
3、将脐带静脉血管内的淤血冲洗干净，直到冲出的NS.无色为止，接着将血管内的空气抽空，两端固定。第7页/共40页第8页/共40页5 将型胶原酶注入脐带静脉血管内，此步骤操作时，注意两端的注射器要来回做活塞运动以便使血管内壁与型胶原酶充分接触，注入的型胶原酶比例为8ml/15cm。注意：一般本步消化时间为10分钟左右，型胶原酶的温度保证在37左右消化能力最好。特别提醒的是在消化过程中要用手来回揉搓脐带外壁，有助于内皮细胞的脱落，此细节至关重要，决定了实验成败第9页/共40页第10页/共40页此细节至关重要第11页/共40页6终止消化，将静脉内含有EC细胞的消化液注入含有小牛血清的离心液里终止消化，两
4、者比例为1:1，并用离心液冲洗静脉血管两次，并将收集的细胞悬液装入离心管，封口7 离心，将离心管放入离心机，设定离心速度和时间。一般1200r/min,8分钟。8 待离心机完全停稳后，打开，取出离心管。小心取放，避免震动幅度过大，倒去上清液，将贴壁细胞用新鲜的培养基全液吹打垂悬，放入细胞培养瓶（一般5ml/瓶）第12页/共40页9 37,5%，CO2孵箱培养，第二天换液，去除未贴壁细胞，继续培养。待细胞几乎铺满瓶底时传代约为3/4。一传二第13页/共40页二 SMC的原代培养实验前准备器械消化酶FD-12培养基其他大号止血钳：2把小号止血钳：2把小号培养皿：2个眼科剪（直）：2把眼科剪（弯）：
5、2把眼科镊（直）：2把眼科镊（弯）：2把 胰酶 Try(2.5mg/ml)FD-12培养原液85mlFBS 15mlL-Glu 1ml浓度为200mmol/L细胞培养瓶NS.6孔板第14页/共40页SMC 细胞来源采用方法：组织贴壁法采用方法：组织贴壁法第15页/共40页实验操作步骤1将灭菌后的实验物品按操作顺序摆放在超净工作台内（超净工作台内事先UV灭菌）注意：紫外灭菌时应关闭日光灯，送风机，人员要离开生化间，30分钟后返回关闭紫外灯，打开日光灯，风机。5分钟后进行实验 2将实验过程中需要的用到的器械依次摆放在酒精灯周围3取出脐带（5CM即可），放入半月盘内，用灭菌后脱脂棉擦去脐带周围血迹
6、注意：个体差异性大，选取脐带时无明显水肿，淤血，无结节现象第16页/共40页4观察脐带纵面，找到脐带内两根动脉，从中间小心剪一豁口。用组织剪牵拉两部分，直至分离出动脉血管。5 将剖离的动脉转移到一干净的6孔板内,孔内加入少许NS.第17页/共40页6剥离血管外膜，小心用一眼科直镊夹住血管一端，用另一把弯镊轻轻向下牵拉血管外壁，直到明显可见一层状组织与内层组织分离。此时应夹紧该层组织，迅速向下剥离。注意：此步骤最为关键，直接决定细胞组织的增殖活力7 将剩下的血管组织再次转移到另一孔内，孔内加入少许NS.,用弯镊夹住血管一端轻轻地套在眼科剪前端，渐次将组织依次剪开，用一灭菌脱脂棉轻轻擦拭血管内壁，
7、除去血管内皮细胞第18页/共40页8 将血管中层再次转移到一孔内,孔内加入少许培养基，用眼科剪（直）将组织尽数剪成1mm1mm的小组织块第19页/共40页9将剪好的组织块用一弯头吸管吸出来放进细胞培养瓶内，小心将培养基吸出来，将组织块轻轻地均匀的贴在细胞瓶底。10 加入新鲜的培养基，小心不要将瓶底的组织块冲刷掉。11 将细胞培养瓶放入37,5%，CO2孵箱培养 注意：此时的细胞培养瓶是倒置的，第二天翻转培养瓶时才使得组织块浸入培养基里12 培养到第六天时可见组织块周围有细胞攀爬出来，此后两天便可进行初次传代第20页/共40页三 MSC的原代培养实验前准备器械消化酶FD-12培养基其他大号止血钳
8、：2把小号止血钳：2把小号培养皿：2个大号组织剪：2把眼科剪（直）：1把眼科镊（直）：2把 胰酶 Try(2.5mg/ml)-MEM培养原液85mlFBS 15mlL-Glu 1ml浓度为200mmol/LSD 大鼠一只细胞培养瓶NS.5ml注射器第21页/共40页培养方法全骨髓培养法和密度梯度离心法实验步骤1 将灭菌后的实验物品按操作顺序摆放在超净工作台内（超净工作台内事先UV灭菌）注意：紫外灭菌时应关闭日光灯，送风机，人员要离开生化间，30分钟后返回关闭紫外灯，打开日光灯，风机。5分钟后进行实验 2将实验过程中需要的用到的器械依次摆放在酒精灯周围第22页/共40页3将老鼠引颈处死，放入事先
9、配好的医用酒精内浸泡15分钟后，转移到超净室内。4用大号止血钳夹住鼠尾，用无菌NS.将大鼠身上的酒精冲洗干净后，放入无菌半月盘内，转移至超净台内。剪去鼠尾。5用第一套器械，小心剥离老鼠四肢表皮，露出肌肉层。6 用第二套器械，小心剥离老鼠四肢上的肌肉层，露出股骨和胫骨第23页/共40页7用第三套器械，小心剥离老鼠的胫骨和股骨 注意：此步骤很关键，在分离四肢股骨、胫骨时要格外小心，最好用眼科剪，不可暴露骨髓腔8将股骨和胫骨转移到小培养皿内，里面倒入少许NS.，用眼科剪和眼科镊将骨头周围的肌肉组织剥离9 将剥离后的股骨和胫骨转移到一新的培养皿内，小心并迅速用大号组织剪剪断骨头两端，暴露骨髓腔。不建议
10、使用酒精，此步骤以前各步在保证无菌操作情况下可避免染菌第24页/共40页10 将剪断的骨髓，用5ml的注射器吸取无血 清培养基反复冲洗骨髓腔。收集骨髓悬液的培养基。11 在50ml离心管内加入Ficoll人淋巴细胞分离液，将细胞悬液小心的铺在分离液上层 注意：在操作此步骤时，要戴好手套，口罩，在Ficoll液面上铺细胞时眼睛要与页面平齐12小心封口离心管，离心机内离心，设定为2000r/min,30分钟13 离心后 取出离心管，小心吸取离心管内中间白色云雾层，用无血清培养基混匀后再次离心，设定为1500r/min,10分钟第25页/共40页14 将离心后的上清液弃除，用新鲜的全培养 基垂悬细胞
11、，装入细胞培养瓶 15 将细胞培养瓶放入37,5%，CO2孵箱培养16 24小时后将细胞瓶内的培养基吸出放入新的培养瓶内，让尚未贴壁的细胞继续贴壁17 一般在24h后细胞便可见梭型形，一周后传代第26页/共40页四 EPC的原代培养 方法同MSC，培养基内加入VEGF诱导因子即可五 SPC的原代培养 方法同上，培养基内加入PDGF-BB诱导因子即可六 外周血来源的EPC的培养同MSC的操作步骤（1117）七 人脐带间充质干细胞的培养同SMC组织贴壁法。去除动脉血管和静脉血管后组织贴壁即可第27页/共40页八 细胞试验中注意的要点1关于传代问题 a try配置时PH=7.4时效果较好 b try
12、使用时的温度 37度时效果较好，过低不易消化，导致细胞死亡 c try消化后离心重新垂悬细胞活性高第28页/共40页d 细胞传代时要充分混匀上图为传代时没有充分混匀导致细胞团聚严重第29页/共40页2关于血清问题 a EC 培养时血清含量不要高于20%。否则老化速度过快 b smc培养时原代血清含量控制在15%，传代后控制10%左右，可有效控制其老化速度 c 干细胞培养时同SMC，在细胞旺盛期血清含量可进一步下调至5%第30页/共40页3关于染菌问题 a 常见的多为真菌感染，细胞瓶内可见白色菌丝。一旦出现此种情况，需要立刻丢弃细胞瓶。孵箱内重新进行灭菌处理 b 常见细菌感染 如杆菌 球菌 支原
13、体等 c 最近实验室出现黑胶虫染菌现象第31页/共40页 对于“黑胶虫”的处理方法：首先，血清买回来灭活前冻融应逐级冻融，即按照-204完全融化后，再置入水浴中，与室温一起升高到56度，这样的目的是避免温度骤变，导致血清中的营养物质丧失活性。第二，血清灭活后分装保存。按照每次用血清的量分装，尽量减少血清冻融的次数。分装时注意无_ 第三，细胞培养时血清浓度稍大一些。通常细胞培养血清浓度为10%-15%，但如果血清冻融次数过多，那营养物质丧失活性，按15%的浓度配制事实上达不到15%的营养成分，故培养基配置时一般用18%-20%的血清。第32页/共40页4 关于细胞冻存 a 10%的DMSO、40
14、%胎牛血清、50%培养基 b 4,40分钟;-20,30分钟;-80 ,24h后液氮罐保存 c 如果冻存细胞多要先把冻存液配好放四度冰箱(因为DMSO放热，刚加进去和容易损伤细胞，常温DMSO对细胞毒性也大。)d 冻存的原则是慢冻快苏第33页/共40页关于荧光染色实验步骤1 细胞取出固定2h后，也可4保存多日后一起染色 2 将孔板内固定液（2.5%戊二醛或者4%多聚甲醛）吸出，用PBS清洗3次，每次5分钟 3 用triton脱细胞液（0.1%浓度）包被样品5分钟，目的是增加细胞通透性，后用PBS清洗3次第34页/共40页4BSA 封闭液封闭（具体看抗体的种属来选择包被液)37 4h,也可以4过
15、夜5 抗 30um/well即可，37 30分钟6 取出样品清洗3次，每次5分钟，加一次封闭30分钟7 加荧光抗（需避光）30um/well 37 30分钟 注意：此步骤不用清洗8 上清液吸干，加DAPI（40ng/ml）浓度较好 4分钟即可 清洗5次9 荧光拍照第35页/共40页注：细胞染色有多重方法，本实验仅是抗-actin染色实验。其他染色方法有很多相近之处 本总结有许多不足之处，需要不断完善，制 定统一实验方法第36页/共40页第37页/共40页做流式检测，一般阳性指标可以检测CD73,29,105，阴性指标可以检测34,45等。阳性细胞活力取决于很多因素，例如大鼠的年龄，体外分离的时间，是否有酒精的污染，胎牛血清的浓度，换液技巧等。推荐用1520FBS，头24小时后换液指标大于95%,阴性指标小于5%,比较纯第38页/共40页细胞如果低密度长期培养，容易出现老化，分化第39页/共40页感谢您的观看！第40页/共40页