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1、基因工程基本操作的四个步骤：基因工程基本操作的四个步骤：第一步：第一步：目的基因的获取目的基因的获取第二步：第二步：基因表达载体的构建基因表达载体的构建第三步：第三步：将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞第四步：第四步：目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定第1页/共60页一、目的基因的获取一、目的基因的获取1.1.什么是目的基因什么是目的基因？主要是指主要是指编码蛋白质编码蛋白质的结构基因。的结构基因。补充：补充：基因的结构基因的结构编码区编码区非编码区非编码区编码区上游编码区上游 非编码区非编码区编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子(1)(1)原核基因的结构原核基因的结
2、构：与与RNARNA聚合聚合酶结合位点酶结合位点转录转录起点起点转录转录终点终点终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终止能终止mRNAmRNA的转录的转录编码蛋白质编码蛋白质(编码序列编码序列)调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达(调控序列调控序列)启动子：启动子：位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNADNA片断，片断，它是它是RNARNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出驱动基因转录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质第2页/共60页一、目的基因的获取一
3、、目的基因的获取1.1.什么是目的基因什么是目的基因？主要是指主要是指编码蛋白质编码蛋白质的结构基因。的结构基因。补充：补充：基因的结构基因的结构(2)(2)真核基因的结构真核基因的结构：转录转录mRNAmRNA前体前体翻译翻译肽链肽链内含子内含子 外显子外显子 编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区启动子启动子终止子终止子加工加工成熟成熟mRNAmRNA第3页/共60页一、目的基因的获取一、目的基因的获取1.1.什么是目的基因什么是目的基因？主要是指主要是指编码蛋白质编码蛋白质的结构基因。的结构基因。2.2.获取方法：获取方法：(1)(1)从基因文库中获取从基因文库中获取：基因文库：基
4、因文库：将将含有某种生物不同基因的许多含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。有这种生物的不同基因。基因文库的分类：基因文库的分类：按外源按外源DNADNA片段的来源分类片段的来源分类基基 因因 组组 文文 库：库：部分基因文库：部分基因文库：含有一种生物的含有一种生物的全部基因全部基因含有一种生物的含有一种生物的部分基因部分基因第4页/共60页一、目的基因的获取一、目的基因的获取1.1.什么是目的基因什么是目的基因？主要是指主要是指编码蛋白质编码蛋白质的结构基因。的结构基因。2.2.
5、获取方法：获取方法：(1)(1)从基因文库中获取从基因文库中获取：获取目的基因的根据：获取目的基因的根据：根据目的基因的有关信息根据目的基因的有关信息，例如，根据，例如，根据基基因的核苷酸序列因的核苷酸序列、基因的功能基因的功能、基因在染色体基因在染色体上的位置上的位置、基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA，以及，以及基因基因的表达产物蛋白质的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。等特性来获取目的基因。建立基因文库的目的：建立基因文库的目的：为了在为了在不知目的基因序列的情况下不知目的基因序列的情况下，便于，便于获得所需的目的基因。获得所需的目的基因。第5页/共60页(1)(1)从基因文
6、库中获取从基因文库中获取：基因文库的构建：基因文库的构建：基因组文库的构建：基因组文库的构建：直接分离法直接分离法(鸟枪法鸟枪法)提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库注意：注意：基因文库的组建过程基因文库的组建过程就包含了基因工程的步骤。就包含了基因工程的步骤。目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞第6页/共60页(1)(1)从基因文库中获取从基因文库中获取
7、：基因文库的构建：基因文库的构建：cDNAcDNA文库的构建：文库的构建：反转录法反转录法某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNA文库反反(逆逆)转录酶转录酶DNADNA聚合酶聚合酶第7页/共60页(1)(1)从基因文库中获取从基因文库中获取：基因文库的构建：基因文库的构建：基因组文库和基因组文库和cDNAcDNA文库的区别：文库的区别：文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小小大大基因中启动子无无有有基因中内含子无无有有基因多少某种生物的部部分基因分基因某种生物的全部基
8、因全部基因物种间的基因交流可以可以部分基因可部分基因可以以第8页/共60页一、目的基因的获取一、目的基因的获取1.1.什么是目的基因什么是目的基因？主要是指主要是指编码蛋白质编码蛋白质的结构基因。的结构基因。2.2.获取方法：获取方法：(1)(1)从基因文库中获取从基因文库中获取：从基因文库中获取目的基因的优点：从基因文库中获取目的基因的优点：操作简便操作简便。从基因文库中获取目的基因的缺点：从基因文库中获取目的基因的缺点：工作量大，具有一定的盲目性工作量大，具有一定的盲目性。第9页/共60页一、目的基因的获取一、目的基因的获取2.2.获取方法：获取方法：(2)(2)利用利用PCRPCR技术扩
9、增目的基因技术扩增目的基因：什么是什么是PCRPCR？PCRPCR全称为全称为聚合酶链式反应聚合酶链式反应，是一项在生物，是一项在生物体外复制体外复制特定特定DNADNA片段片段的核酸合成技术。的核酸合成技术。PCRPCR的原理：的原理：利用利用DNADNA双链复制双链复制的原理。的原理。条件：条件：要有一段要有一段已知目的基因的核苷酸序列已知目的基因的核苷酸序列【前提条件】、四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸、引物引物、热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(TaqTaq酶酶)等。等。第10页/共60页(2)(2)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因：过程：过程：脱氧脱氧胞苷胞苷三磷
10、酸三磷酸 脱氧脱氧腺苷腺苷三磷酸三磷酸 脱氧脱氧鸟苷鸟苷三磷酸三磷酸 脱氧脱氧胸苷胸苷三磷酸三磷酸 第11页/共60页(2)(2)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因：过程：过程：A.A.变性变性(90-95)(90-95)：双链双链DNADNA模板在模板在热作用热作用下，下，氢键断裂氢键断裂，形成，形成单链单链DNADNA。B.B.退火退火(55-65)(55-65)：系统温度降低，引物与系统温度降低，引物与DNADNA模板结合，形成模板结合，形成局部双链局部双链。C.C.延伸延伸(70-75)(70-75)：在在TaqTaq酶的作用下，从引物的酶的作用下，从引物的55端端3
11、3端延伸，端延伸，合成与模板互补的合成与模板互补的DNADNA链。链。D.D.多次重复：多次重复：第12页/共60页一、目的基因的获取一、目的基因的获取2.2.获取方法：获取方法：(2)(2)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因：方式：方式：以以指数方式扩增指数方式扩增，即，即2 2n n(n(n为扩增循环的次数为扩增循环的次数)。第13页/共60页PCRPCR技术扩增与技术扩增与DNADNA复制的比较：复制的比较：PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸
12、模板、能量、酶模板、能量、酶DNADNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定的热稳定的DNADNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNADNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子2.2.获取方法：获取方法：(2)(2)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因：第14页/共60页一、目的基因的获取一、目的基因的获取2.2.获取方法：获取方法：(3)(3)化学方法人工合成化学方法人工合成：如果如果基因比较小基因比较小，核苷酸序列又已知核苷酸序列又已知，也可以通过也可以通过DNADNA合成仪合成
13、仪用用化学方法直接人化学方法直接人工合成工合成。第15页/共60页一、目的基因的获取一、目的基因的获取练一练：练一练：1.多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95下使模板DNA变性、解链55下复性(引物与DNA模板链结合)72下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是()A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸DPCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高C
14、第16页/共60页一、目的基因的获取一、目的基因的获取练一练：练一练：2.获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是()A从基因组文库中获取B从cDNA文库中获取 C从含目的基因生物细胞中获取D利用PCR技术获取C3.PCR技术扩增DNA，需要的条件是()目的基因 引物 四种脱氧核苷酸DNA聚合酶等 mRNA 核糖体A BC DA第17页/共60页一、目的基因的获取一、目的基因的获取练一练：练一练：4.有关基因工程的叙述正确的是()A限制酶只在获取目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可以作为运载体D蛋白质的氨基酸排列顺序可以为合成目的基因提供线索D5.在基因工程
15、技术中，下列方法与目的基因获得无关的是()A辐射诱变法 B从基因文库中获取 C反转录法 D人工合成法A第18页/共60页一、目的基因的获取一、目的基因的获取练一练：练一练：6.下列关于基因工程的说法中，正确的是()A基因工程的设计和施工都是在细胞水平上进行的B目前基因工程所有的目的基因都是从供体细胞中直接分离得到的C只要检测出受体细胞中含有目的基因，那么目的基因一定能成功进行表达D基因工程能使科学家打破物种界限，定向改造生物性状D第19页/共60页一、目的基因的获取一、目的基因的获取练一练：练一练：7.下列获取目的基因的方法中需要模板链的是()从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基
16、因反转录法通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A B C DD第20页/共60页二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建1.1.构建目的：构建目的：使使目的基因在受体细胞中稳定存在目的基因在受体细胞中稳定存在，并且并且可以遗传给下一代可以遗传给下一代，同时，使，同时，使目的基目的基因能够表达和发挥作用因能够表达和发挥作用。2.2.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：目的基因目的基因启动子启动子终止子终止子标记基因标记基因第21页/共60页二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建1.1.构建目的：构建目的：使使目的基因在受体细胞中稳定存在目的基因在受体细胞中稳定存在，并且并且可以遗传
17、给下一代可以遗传给下一代，同时，使，同时，使目的基目的基因能够表达和发挥作用因能够表达和发挥作用。2.2.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：想一想：想一想：启动子、终止子和标记基因分别有什么作用？启动子、终止子和标记基因分别有什么作用？启动子：启动子：位于基因的首端基因的首端的一段特殊的DNA片断，是RNARNA聚合酶识别和结合的部位聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质，但启动子本身不被转录。终止子：终止子：位于基因的尾端基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终终止止mRNAmRNA的转录的转录。标记基因：标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因鉴别受体
18、细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。第22页/共60页二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建3.3.构建表达载体：构建表达载体：同一种同一种 限制酶限制酶载体载体(如质粒如质粒)DNADNA分子分子(含目的基因含目的基因)一个一个切口切口两个两个黏性末端黏性末端两个两个切口切口(两个黏性两个黏性末端末端)的目的基因的目的基因基因表达载体基因表达载体(如重组质粒如重组质粒)DNA DNA 连接酶连接酶第23页/共60页二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建3.3.构建表达载体：构建表达载体：(1)用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。(2)用_切断目的基因
19、，使其产生_。(3)将切下的目的基因片段插入质粒的_处，黏性末端因_而相连，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子(重组质粒)。限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶切口切口碱基互补配对原则碱基互补配对原则相同的黏性末端相同的黏性末端DNADNA连接酶连接酶第24页/共60页二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建3.3.构建表达载体：构建表达载体：特别提醒：特别提醒：(1)(1)用限制酶切割载体和含目的基因的用限制酶切割载体和含目的基因的DNADNA分子分子时，时，可以使用不同的限制性核酸内切酶可以使用不同的限制性核酸内切酶,但是但是必须切出必须切出相同黏性末端相同黏性末端
20、。(2)(2)不同基因可以拼接的原因：不同基因可以拼接的原因：不同生物的基不同生物的基因具有相同的结构和化学组成因具有相同的结构和化学组成，都是双螺旋结，都是双螺旋结构，都由四种脱氧核糖核苷酸组成，都遵循相构，都由四种脱氧核糖核苷酸组成，都遵循相同的碱基互补配对原则：同的碱基互补配对原则：ATAT，GCGC。(3)(3)目的基因与载体的结合过程，实际上是目的基因与载体的结合过程，实际上是不不同来源的基因重组的过程同来源的基因重组的过程。第25页/共60页二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建练一练：练一练：1.如图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法错误的是()A基因工程
21、的核心步骤是基因表达载体构建B任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别C图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位D抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因B第26页/共60页二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建练一练：练一练：2.下列操作中不属于基因表达载体构建过程的是()A.用一定的限制酶切割质粒露出黏性末端B.用同一种限制酶切割目的基因露出黏性末端C.将切下的目的基因片段插入质粒切口处D.将重组DNA导入受体细胞中D D3.下列哪项不是基因表达载体的组成部分()A.启动子 B.终止子C.标记基因 D.复制原点D D第27页/共60页
22、二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建练一练：练一练：4.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是()A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别A第28页/共60页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1.1.什么是转化？什么是转化？目的基因进入受体细胞目的基因进入受体细胞内，并且内，并且在在 受体细胞内维持稳定和表达受体细胞内维持稳定和表达的过程。的过程。2.2.常用的受体细胞：常用的受体
23、细胞：大肠杆菌大肠杆菌、枯草杆菌、枯草杆菌、农杆菌农杆菌、酵母酵母菌菌和和动植物细胞动植物细胞等。等。3.3.将目的基因导入受体细胞的原理：将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。第29页/共60页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞4.4.将目的基因导入植物细胞：将目的基因导入植物细胞：适用范围：适用范围：(1)(1)农杆菌转化法农杆菌转化法：双子叶植物双子叶植物和和裸子植物裸子植物。小知识：小知识：植物的分类植物的分类依据是否依据是否形成种子形成种子种子种子植物植物裸子植物：裸子植物：松、杉、柏、银杏松、杉、柏、银杏被子植物被
24、子植物双子叶植物：双子叶植物：花生、大豆花生、大豆单子叶植物：单子叶植物：水稻、玉米水稻、玉米孢子孢子植物植物藻类植物：藻类植物：衣藻、水绵、海带衣藻、水绵、海带苔藓植物：苔藓植物：葫芦藓、地钱葫芦藓、地钱蕨类植物：蕨类植物：肾厥、满江红肾厥、满江红第30页/共60页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞4.4.将目的基因导入植物细胞：将目的基因导入植物细胞：农杆菌特点：农杆菌特点：(1)(1)农杆菌转化法农杆菌转化法：在自然条件下在自然条件下感染双子叶植物和裸子感染双子叶植物和裸子植物植物，而对大多数单子叶植物没有感染能，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物力。当植物受到损
25、伤时受到损伤时，伤口处的细胞会伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞这些细胞，这时农杆菌的，这时农杆菌的TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体色体DNADNA上。上。第31页/共60页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞4.4.将目的基因导入植物细胞：将目的基因导入植物细胞：转化过程：转化过程：(1)(1)农杆菌转化法农杆菌转化法：第32页/共60页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞4.4.将目的基因导入植物细胞：将目的基因
26、导入植物细胞：(2)(2)基因枪法基因枪法：适用范围：适用范围：适用于适用于单子单子叶植物叶植物，但，但成本成本较高较高。第33页/共60页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞4.4.将目的基因导入植物细胞：将目的基因导入植物细胞：(3)(3)花粉管通道法花粉管通道法：适用范围：适用范围：适用于适用于被子植物被子植物，且十分简便经济。，且十分简便经济。胚珠胚珠花药花药花丝花丝柱头柱头花柱花柱子房壁子房壁子房子房雄雄蕊蕊雌雌蕊蕊第34页/共60页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞5.5.将目的基因导入动物细胞：将目的基因导入动物细胞：(1)(1)导入方法导入方法
27、：显微注射法显微注射法。(2)(2)过程过程：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯从雌性动物内从雌性动物内取出卵取出卵(卵在体内或体外受精卵在体内或体外受精)并进行并进行显微注射显微注射 含目的基因的受精卵含目的基因的受精卵胚胎早期培养胚胎早期培养至囊至囊胚期再胚期再移植移植到雌性动物到雌性动物输卵管或子宫输卵管或子宫，使其，使其发育发育成具有成具有新性状的动物新性状的动物。第35页/共60页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞6.6.将目的基因导入微生物：将目的基因导入微生物：(1)(1)原核生物特点原核生物特点：繁殖快繁殖快、单细胞单细胞、遗传物质少遗传物质少。(2)(
28、2)方法方法：用用CaCa2+2+处理细胞处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸感受态细胞吸收收DNADNA分子分子。第36页/共60页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞知识拓展：知识拓展：(1)不不同同生生物物的的受受体体细细胞胞不不同同：植植物物一一般般为为体体细细胞胞(也可以受精卵)，动动物物一一般般为为受受精精卵卵，微生物一般为大肠杆菌微生物一般为大肠杆菌。(2)上图中发生与发生相比，会会使使目目的的基基因因的的遗遗传传特特性性得得以以稳稳定定维维持持和和表表达达，原因是在进行细胞分裂时，细胞核上的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传
29、性状的稳定性，而细细胞胞分分裂裂时时，细细胞胞质质是是不不均均分分的的，子子细细胞不一定含有目的基因胞不一定含有目的基因。第37页/共60页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞练一练：练一练：1.基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，主要原因是()A结构简单，操作方便B繁殖速度快C遗传物质含量少、简单D性状稳定,变异少B2.在培育下列作物的转基因品种时，适合用农杆菌转化法导入目的基因的是()A小麦 B玉米 C大豆 D水稻C第38页/共60页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞练一练：练一练：3.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做
30、法正确的是()将毒素蛋白注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导人细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵A.B.C.D.C第39页/共60页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞练一练：练一练：4.回答有关基因工程的问题：(1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生_末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生_(相同、不同)黏性末端的限制酶。(2)利用大肠杆菌生产人
31、胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是_。在表达载体转化大肠杆菌时，常用_处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为_。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成_，常用_杂交技术。平相同RNA聚合酶识别和结合的位点，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质人胰岛素Ca2DNA分子杂交技术抗原抗体第40页/共60页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞练一练：练一练：4.回答有关基因工程的问题：(3)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植
32、物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的_中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的_上。TDNA染色体的DNA第41页/共60页四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1.1.分子水平的检测：分子水平的检测：(1)(1)导入检测：即检测导入检测：即检测转基因生物的转基因生物的DNADNA上上是否插入了目的基因是否插入了目的基因。这是这是目的基因能够在受体细胞中稳定遗目的基因能够在受体细胞中稳定遗传的关键传的关键。方法：方法：DNADNA分子杂交技术分子杂交技术。过程：过程：将转基因生物的将转基因生物的DNADNA提取出来提取出来，在，在含有目含有目的基因
33、的的基因的DNADNA片段片段上用上用放射性同位素等作标记放射性同位素等作标记，以此作为以此作为探针，使探针与基因组使探针与基因组DNADNA杂交杂交，如，如果果显示出杂交带显示出杂交带，就表明目的基因已插入染色，就表明目的基因已插入染色体体DNADNA中。中。第42页/共60页过程：过程：放射性同放射性同 位素标记位素标记目的基因的目的基因的DNADNA片段片段TACGGTCATGTCGCATGCTAGTACGGTCATGTCGCATGCTAGATGCCAGTACAGCGTACGATCATGCCAGTACAGCGTACGATCGTACAGCGTAGTACAGCGTA基因探针基因探针待测转基因
34、生物待测转基因生物1 1染色体染色体DNADNA单链单链TACGGTCATGTCGCATGCTAGTACGGTCATGTCGCATGCTAG待测转基因生物待测转基因生物2 2染色体染色体DNADNA单链单链ATCCGGTGTAGGTCATGCTCGATCCGGTGTAGGTCATGCTCGGTACAGCGTAGTACAGCGTA基因探针基因探针GTACAGCGTAGTACAGCGTA基因探针基因探针显示出杂交带不能显示出杂交带第43页/共60页四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1.1.分子水平的检测：分子水平的检测：(1)(1)导入检测：即检测导入检测：即检测转基因生物的转基因生
35、物的DNADNA上上是否插入了目的基因是否插入了目的基因。方法：方法：DNADNA分子杂交技术分子杂交技术。过程：过程：检测受体细胞检测受体细胞是否具有标记基因所控制的是否具有标记基因所控制的性状性状，如果具有标记基因所控制的性状，就表，如果具有标记基因所控制的性状，就表明受体细胞中含有目的基因，从而可以明受体细胞中含有目的基因，从而可以筛选筛选出出含有目的基因的受体细胞。含有目的基因的受体细胞。想一想：想一想：欲检测受体细胞中是否含有目的基因，欲检测受体细胞中是否含有目的基因，除了除了DNADNA分子杂交法外，可以如何检测？分子杂交法外，可以如何检测？第44页/共60页四、目的基因的检测与鉴
36、定四、目的基因的检测与鉴定1.1.分子水平的检测：分子水平的检测：(2)(2)转录检测：即检测转录检测：即检测目的基因是否转录出目的基因是否转录出了了mRNAmRNA。这是这是检测目的基因是否发挥功能作用的检测目的基因是否发挥功能作用的第一步第一步。方法：方法：(DNA-RNA)(DNA-RNA)分子杂交技术分子杂交技术。过程：过程：从转基因生物中从转基因生物中提取出提取出mRNAmRNA，在，在含有目含有目的基因的的基因的DNADNA片段片段上用上用放射性同位素等作标记放射性同位素等作标记，以此作为以此作为探针，使探针与使探针与mRNAmRNA杂交杂交，如果，如果显显示出杂交带示出杂交带，就
37、表明目的基因在转基因生物中，就表明目的基因在转基因生物中已经转录出了已经转录出了mRNAmRNA。第45页/共60页过程：过程：放射性同放射性同 位素标记位素标记目的基因的目的基因的DNADNA片段片段TACGGTCATGTCGCATGCTAGTACGGTCATGTCGCATGCTAGATGCCAGTACAGCGTACGATCATGCCAGTACAGCGTACGATCGTACAGCGTAGTACAGCGTA基因探针基因探针待测转基因生物待测转基因生物1 1中的中的mRNAmRNAUACGGUCAUGUCGCAUGCUAGUACGGUCAUGUCGCAUGCUAG待测转基因生物待测转基因生物2
38、2中的中的mRNAmRNAAUCCGGUGUAGGUCAUGCUCGAUCCGGUGUAGGUCAUGCUCGGTACAGCGTAGTACAGCGTA基因探针基因探针GTACAGCGTAGTACAGCGTA基因探针基因探针显示出杂交带不能显示出杂交带第46页/共60页四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1.1.分子水平的检测：分子水平的检测：(3)(3)翻译检测：即检测翻译检测：即检测目的基因是否翻译成目的基因是否翻译成相应的蛋白质相应的蛋白质。这是这是检测目的基因是否发挥功能作用的检测目的基因是否发挥功能作用的第二步第二步。方法：方法：抗原抗原抗体杂交技术抗体杂交技术。过程：过程
39、：从转基因生物中从转基因生物中提取出蛋白质提取出蛋白质，用，用相应的相应的抗体进行抗原抗体进行抗原抗体杂交抗体杂交，如果，如果显示出杂交带显示出杂交带，就表明目的基因已形成蛋白质产品。就表明目的基因已形成蛋白质产品。第47页/共60页过程：过程：目的基因目的基因动物动物(如小鼠如小鼠)体内体内抗体抗体转基因生物转基因生物中蛋白质中蛋白质抗原抗原蛋白质蛋白质表达表达显示出杂交带目的基因已形成蛋白质第48页/共60页四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定2.2.个体生物学水平的鉴定：个体生物学水平的鉴定：(1)(1)实例实例1 1：一个抗虫或抗病的基因导入植物一个抗虫或抗病的基因导入植物
40、细胞后，是否赋予了抗虫或抗病的特性，需细胞后，是否赋予了抗虫或抗病的特性，需要做要做抗虫或抗病的接种实验抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。有抗性以及抗性的程度。(2)(2)实例实例2 2：有的基因工程产品需要与天然产有的基因工程产品需要与天然产品品进行功能活性比较进行功能活性比较，以确定转基因产品的，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。功能活性是否与天然产品相同。第49页/共60页四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定练一练：练一练：1.1976年,美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌,并获得了表达，此文中的表达是
41、指该基因在大肠杆菌()A.能进行DNA复制B.能传递给细菌后代C.能合成生长抑制素释放因子D.能合成人的生长素C C第50页/共60页四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定练一练：练一练：2利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是()A棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白D D第51页/共60页五、课堂练习五、课堂练习1.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的,在基因操作的基本步骤中,不进行减基互补配对
42、的步骤是()A.人工合成目的基因B.目的基因与载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达C C第52页/共60页五、课堂练习五、课堂练习2.下列关于基因工程的叙述，错误的是()A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达D D第53页/共60页五、课堂练习五、课堂练习3.为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应洲等盐碱地的开发利用备
43、受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。(1)获得耐盐基因后，构建重组获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的分子所用的限制性内切酶作用于图中的限制性内切酶作用于图中的_处，处，DNA连接连接酶作用于酶作用于_处。处。(填填“a”或或“b”)a aa a第54页/共60页五、课堂练习五、课堂练习3.为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。(2)将重组将重组D
44、NA分子导入水稻受体细胞的常用方分子导入水稻受体细胞的常用方法有法有_、基因枪法、花粉管通道法。、基因枪法、花粉管通道法。(3)由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用利用_技术，该技术的核心是技术，该技术的核心是_和和_。(4)为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的要用放射性同位素标记的_作探针进行作探针进行分子杂交检测，又要用分子杂交检测，又要用_方法方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。农杆菌转化法农杆菌转化法植物组织培养植物组织培养脱分化脱分化再分化再分化耐
45、盐基因耐盐基因一定浓度盐水浇灌一定浓度盐水浇灌第55页/共60页五、课堂练习五、课堂练习4.水稻种子中70的磷以植酸形式存在。植酸易同铁、钙等金属离子或蛋白质结合排出体外，易引起水华。为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。第56页/共60页五、课堂练习五、课堂练习图中基因组文库_(小于/等于/大于)cDNA文库。B过程需要的酶是_；A、C过程中_(可以不可以)使用同一种探针筛选含目的基因的菌株。目的基因和除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中_和_为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是_。大于大于反转录
46、酶反转录酶可以可以DNADNAcDNAcDNA耐高温耐高温第57页/共60页五、课堂练习五、课堂练习 5.1970年，特明和巴尔的摩证实了RNA病毒能依赖RNA合成DNA的过程，并发现了催化此过程的酶。下面为形成cDNA的过程和PCR扩增过程示意图。请根据图解回答下列问题：第58页/共60页五、课堂练习五、课堂练习(1)催化过程的酶是_；核酸酶H的作用是_。(2)过程也称为DNA的变性，此过程在温度高达9095 时才能完成，说明DNA分子具有_性。(3)由图中信息分析可知，催化过程的酶都是_，两者在作用特性上的区别是_。(4)如果RNA单链中有碱基100个，其中A占25%，U占15%，则通过该过程合成的一个双链DNA片段中有胞嘧啶_个。逆转录酶逆转录酶分解分解RNARNA稳定稳定DNADNA聚合酶聚合酶催化催化过程的酶耐高温过程的酶耐高温6060第59页/共60页感谢您的观看。第60页/共60页