《选修专题基因工程基因工程基本操作程序.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《选修专题基因工程基因工程基本操作程序.pptx（22页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、1 1）从基因所在的生物体）从基因所在的生物体直接获取直接获取利用利用PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因3 3）人工合成）人工合成2 2）mRNAmRNA反转录成反转录成cDNAcDNA目的基因的获取目的基因的获取4)4)从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因第1页/共22页用用_切割目的基因，切割目的基因，使其产生使其产生 。用一定的用一定的 切割质粒，切割质粒，使其出现一个切口，产生使其出现一个切口，产生_。(基因工程的核心基因工程的核心)将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加处，再加入适量入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组DNAD
2、NA分子分子(重组质重组质粒粒)。限制酶限制酶黏性末端黏性末端同种限制酶同种限制酶同种同种黏性末端黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶基因表达载体的构建基因表达载体的构建第2页/共22页（一）构建目的（一）构建目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。（二）构建零件及其作用（二）构建零件及其作用目的基因目的基因启动子启动子基因表达载体的组成基因表达载体的组成 RNA RNA聚合酶识别和结合的聚合酶识别和结合的一段特殊结构的一段特殊结构的DNADNA片段
3、，位片段，位于基因的首端，于基因的首端，RNARNA聚合酶与聚合酶与之结合才能驱动基因转录出之结合才能驱动基因转录出mRNAmRNA，进而获得需要的蛋白质。，进而获得需要的蛋白质。第3页/共22页终止子终止子标记基因标记基因 一段特殊结构的一段特殊结构的DNADNA片片段，位于基因的尾端，作用段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停是使转录在所需要的地方停止。止。鉴别受体细胞中是否鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出有目的基因的细胞筛选出来。来。第4页/共22页常用的受体细胞：常用的受体细胞：动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。
4、动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。将目的基因导入受体细胞的原理：将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。转化转化目的基因进入目的基因进入_内，并且在受体内，并且在受体细胞内维持细胞内维持_和和_的过程。的过程。受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞第5页/共22页方法方法导入植物细胞导入植物细胞导入动物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子将目的基因导入受体细
5、胞将目的基因导入受体细胞第6页/共22页(检查是否成功检查是否成功)分子水平分子水平检测检测个体水平鉴定：个体水平鉴定：检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出检测目的基因是否转录出了了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成检测目的基因是否翻译成蛋白质蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等DNADNA分子杂交分子杂交DNADNA分子杂交分子杂交抗原抗原-抗体杂交抗体杂交目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定第7页/共22页目的基因主要是指目的基因主要是指_。编码蛋白质的结构基因编码蛋白质
6、的结构基因供体生物细胞供体生物细胞取出取出DNADNA用限制酶剪去用限制酶剪去多余部分多余部分目的基因目的基因即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来从基因所在的生物体直接获取从基因所在的生物体直接获取第8页/共22页mRNAmRNAmRNAmRNA互补互补互补互补DNA DNA DNA DNA(cDNAcDNA)双链双链双链双链DNADNADNADNA(即目的基因即目的基因即目的基因即目的基因)反转录反转录反转录反转录合成合成合成合成 以目的基因转录成的以目的基因转录成的以目的基因转录成的以目的基因转录成的mRNAmRNAmRNAmRNA为模板，反转录
7、成互为模板，反转录成互为模板，反转录成互为模板，反转录成互补的单链补的单链补的单链补的单链DNADNADNADNA，然后在，然后在，然后在，然后在DNADNADNADNA聚合酶的作用下合成双链聚合酶的作用下合成双链聚合酶的作用下合成双链聚合酶的作用下合成双链DNADNADNADNA，从而获得所需的基因。，从而获得所需的基因。，从而获得所需的基因。，从而获得所需的基因。逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶mRNAmRNA反转录成反转录成cDNAcDNA第9页/共22页蛋白质的蛋白质的 氨基酸序列氨基酸序列mRNAmRNA的的 核苷酸序列核苷酸序列目的基
8、因目的基因 核苷酸序列核苷酸序列目的目的基因基因化学化学合成合成根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA：人工合成目的基因人工合成目的基因推测推测推测推测第10页/共22页从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因1.1.1.1.基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库 将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。同的基因，称为基因文库。受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群受体菌包含了某种生物所有的基因，该受
9、体菌群体称为这种生物的基因组文库。体称为这种生物的基因组文库。2.2.2.2.部分基因文库部分基因文库部分基因文库部分基因文库 受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如称为这种生物的部分基因文库，如cDNAcDNA文库。文库。第11页/共22页用适当用适当限制酶切割限制酶切割与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群基因文库的构建基因文库的构建（1 1）基因组文库的构建）基因组文库的构建提取某生物提取某生物全部全部DNADNA许许 多多DNADNA片段片段该生物基该生物基因组
10、文库因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）（2 2）cDNAcDNA文库的构建文库的构建mRNAmRNA反转录形成反转录形成该生物该生物cDNAcDNA文库文库mRNAmRNAmRNAmRNA互补互补互补互补DNA DNA DNA DNA(cDNA)cDNA)双链双链双链双链DNADNADNADNA(即目的基因即目的基因即目的基因即目的基因)逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶第12页/共22页（PCR，polymerase chain reaction）PCRPCR扩增仪扩增仪DNADNA双链复制的基本原理双链复制的基本原理一段已知目的基因
11、的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）DNADNA的两条链为模板的两条链为模板温度控制温度控制原理：原理：前提：前提：条件：条件：聚合酶链式反应聚合酶链式反应第13页/共22页PCRPCR扩增过程扩增过程DNADNA变性变性(90-95)(90-95)：双链：双链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，断裂，形成断裂，形成 。复性复性(55-60)55-60)：系统温度降低，引物与：系统温度降低，引物与DNADNA模模板结合，形成局部板结合，形成局部 。延伸延伸(70-75)(70-7
12、5)：在：在TaqTaq酶的作用下，从引物的酶的作用下，从引物的55端端33端延伸，合成与模板链互补的端延伸，合成与模板链互补的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNADNADNA链链第14页/共22页易感染双子叶植物和裸子植物。易感染双子叶植物和裸子植物。TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA可转移至受体细胞的染色体上可转移至受体细胞的染色体上农杆菌特点：农杆菌特点：农杆菌转化法农杆菌转化法第15页/共22页显微注射法显微注射法含目的基因含目的基因的表达载体的表达载体动物的动物的受精卵受精卵含目的基因含目的基因的受精卵的受精卵早期胚胎早期胚胎雌性动物输雌性动物输卵管或子宫卵管或
13、子宫转基因转基因动物动物为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？显微显微注射注射分裂分裂分化分化移移 植植发育发育第16页/共22页2.2.微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞3.3.转化方法：转化方法：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 处理细胞处理细胞 细胞细胞表达载体与感表达载体与感受态细胞混合受态细胞混合_细胞吸收细胞吸收DNADNA分子。分子。CaCa2+2+感受态感受态感受态感受态1.1.常用菌：常用菌：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农
14、杆菌等。大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌等。第17页/共22页 该方法是根据碱基互补配对原则，把该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链互补的双链DNADNA解开，把单链的解开，把单链的DNADNA小片段小片段用同位素、荧光分子或化学发光剂等进行用同位素、荧光分子或化学发光剂等进行标记，之后同被检测的标记，之后同被检测的DNADNA中的同源互补序中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的列杂交，从而检出所要查明的DNADNA或基因。或基因。分子杂交技术分子杂交技术第18页/共22页1.1.检测转基因生物的检测转基因生物的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因 提取受体生提取受体生物
15、全部物全部DNADNA适当限制适当限制酶切割酶切割DNADNA片段片段用同位素标记的用同位素标记的目的基因片段杂交目的基因片段杂交（表明目的基因已插入）（表明目的基因已插入）分子杂交技术分子杂交技术显出杂交带显出杂交带第19页/共22页2.2.检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA mRNA 用同位素标记的用同位素标记的目的基因片段杂交目的基因片段杂交显出杂交带显出杂交带（表明目的基因已转录出了（表明目的基因已转录出了mRNAmRNA）检测检测DNADNA利用的是利用的是DNADNA与与DNADNA杂交，检测杂交，检测mRNAmRNA利利用的是用的是DNADNA与与mRNAmRNA杂交。杂交。提取受体生物提取受体生物的的mRNAmRNA第20页/共22页检测目的基因是否翻译出蛋白质检测目的基因是否翻译出蛋白质 抗原抗原抗体杂交抗体杂交提取受体生物的提取受体生物的蛋白质蛋白质与相应抗体杂交与相应抗体杂交显出杂交带显出杂交带（表明目的基因已形成蛋白质产品）（表明目的基因已形成蛋白质产品）第21页/共22页感谢您的观看！第22页/共22页