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1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序第1页/共55页一、获取目的基因一、获取目的基因(一一)、目的基因的概念及基因的结构、目的基因的概念及基因的结构1 1、目的基因、目的基因主要是指主要是指_，编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因也可以是一些起也可以是一些起调控作用的因子调控作用的因子第2页/共55页原核细胞基因原核细胞基因真核细胞基因真核细胞基因结构图结构图编码区连编码区连续性续性编码序列编码序列位置位置非编码序非编码序列位置列位置2 2、原核细胞基因与真核细胞基因的比较、原核细胞基因与真核细胞基因的比较连续连续不连续不连续非编码区非编码区非编码区和编码区中的内含子非编码区和编码
2、区中的内含子编码区编码区编码区中的外显子编码区中的外显子第3页/共55页(二二)、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法第4页/共55页1、从基因文库中获取目的基因(1）、基因文库概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库第5页/共55页基因组文库与部分基因文库的比较文库类型文库类型基因组文库基因组文库cDNAcDNA文库文库构建方法基因多少文库大小有无启动子有无内含子物种间基因交流大大某种生物的全部基因某种生物的全部基因某种生物的部分基因小有有无有有无部分基因可以部分基因可以可以（2）基因文库的类型（3
3、3）、从基因文库中筛选目的基因应考虑的因素：序列、功能、位置）、从基因文库中筛选目的基因应考虑的因素：序列、功能、位置转录产物、表过产物等转录产物、表过产物等第6页/共55页 (1(1）、）、PCR的原理：的原理：DNADNA双链复制双链复制 2 2、PCRPCR技术（多聚酶链式反应）技术（多聚酶链式反应）第8页/共55页5/3/GGTC3/5/GACC5/3/AG引物引物5/3/GG引物引物(2）、PCR过程变性变性（90-9590-95）：）：高温使高温使H H键断裂，形键断裂，形成单链成单链DNADNA复性（复性（55-6055-60）：）：引物与引物与DNADNA模板结合，模板结合，延
4、伸延伸（70-7570-75）在）在TaqTaq酶的作用下，以酶的作用下，以dATPdTTPdGTPdCTPdATPdTTPdGTPdCTP为原料合成与模板互为原料合成与模板互补的子链补的子链第9页/共55页（3)、特点：指数式扩增（约2n）第10页/共55页（4)、前提：模板：引物：原料：酶：一段已知目的基因的核苷酸序列（以便根据已知序列合成引物）目的基因2条（人工合成，2条引物不一定互补）dCTP、dGTP、dATP、dTTP耐高温DNA聚合酶（Taq酶）第11页/共55页PCR技术与生物体内DNA复制的比较项目项目PCR技术技术DNA复制复制不同不同点点解旋方式解旋方式相同点高温变性解旋
5、解旋酶催化场所体外主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶温度条件在较高温度下进行，不同过程温度不同常温原理DNA双链复制原料四种游离的脱氧核苷酸条件需模板、能量、酶等第12页/共55页用用DNADNA合成仪合成合成仪合成3 3、化学方法人工合成、化学方法人工合成适用于核苷酸序列已知且碱基数较少的基因适用于核苷酸序列已知且碱基数较少的基因第13页/共55页二二.基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因工程的核心：基因工程的核心：1 1、目的。、目的。使目的基因在使目的基因在_中稳定存在，并且可以遗传给下一代。中稳定存在，并且可以遗传给下一代。使目的基因能够使目的基因能够_和发挥
6、作用。和发挥作用。2 2、组成：、组成：_+_+目的基因目的基因+_+_+标记基因标记基因(如抗生素抗性基因如抗生素抗性基因)受体细胞受体细胞表达表达启动子启动子终止子终止子第14页/共55页3 3、基因表达载体的构建过程：、基因表达载体的构建过程：限制酶A识别：5-ATGATCAT 3-TACTAGTA，切割位点是T与G之间；限制酶B识别：5-CAGATCTG 3-GTCTAGAC，切割位点是A与G之间 但是它们产生的粘性末端都是：GATC 只能用同一种限制酶吗？第15页/共55页例1.(20分)(2014天津高考)嗜热土壤芽孢杆菌产生的-葡萄糖苷酶(BglB)是一种耐热纤维素酶。（1）PC
7、R扩增bglB基因时，选用嗜热土壤芽孢杆菌基因组DNA作 。（2）、下图为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入和不同限制酶的识别序列。NdeBamH模板第16页/共55页例2.下图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌，制备“工程菌”的示意图据图回答：(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在 的作用下合成双链DNA；二是根据目标蛋白质的序列，推测出相应的mRNA序列，再按照碱基互补配对原则，推测其DNA的序列，再通过化学方法合成所需基因。(2)利用PCR技术
8、扩增DNA时，需添加的有机物质有4种脱氧核糖核苷酸耐热性的 和、。(3)由A和载体B拼接形成的C通常称为。(4)在基因工程中，常用Ca2+处理D，其目的是 逆转录DNA聚合酶氨基酸脱氧核苷酸引物模板(A基因)基因表达载体使其成为感受态细胞，有利于吸收重组DNA分子DNA聚合酶第17页/共55页例3、以下实例为体外处理“蛋白质-DNA复合体”获得DNA片段信息的过程图。据图回答：(1)过程酶作用的部位是，此过程只发生在非结合区DNA，过程酶作用的部位是。(2)两过程利用了酶的特性。(3)若将得到的DNA片段用于构建重组质粒，需要将过程的测序结果与酶的识别序列进行比对，以确定选用何种酶。(4)如果
9、复合体中的蛋白质为RNA聚合酶，则其识别、结合的DNA序列区为基因的。磷酸二酯键肽键专一性限制性核酸内切启动子(或转录起始区)第18页/共55页(5)以下研究利用了生物分子间特异性结合性质的有(多选)A.分离得到核糖体，用蛋白酶酶解后提取rRNAB.用无水乙醇处理菠菜叶片，提取叶绿体基粒膜上的光合色素C.通过分子杂交手段，用荧光物质标记的目的基因进行染色体基因定位D.将抑制成熟基因导入番茄，其mRNA与催化成熟酶基因的mRNA互补结合，终止后者翻译，延迟果实成熟A、C、D第19页/共55页例例4.(20144.(2014新课标全国卷新课标全国卷)植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与植物甲具有极强
10、的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关，若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性某个基因有关，若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。回答下列问题：低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。回答下列问题：(1)(1)理论上，基因组文库含有生物的理论上，基因组文库含有生物的基因；而基因；而cDNAcDNA文库含有文库含有生物的生物的基因。基因。(2)(2)若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中再从中出所需的耐旱基因。出所需的耐旱基因。全部部分筛选(4)(4)将耐旱基因导入农
11、杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物乙的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的是否得到提高第20页/共55页(4)(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3131时，则可推测该耐旱基因整合到了(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。第21页/共55页(三三)将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化:方法方法导入植物细胞导入植物细胞导入动物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪
12、法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞法感受态细胞法目的基因进入目的基因进入_ _ 内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达第22页/共55页1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1 1）农杆菌转化法农杆菌转化法(适合双子植物适合双子植物)第23页/共55页（2）基因枪法（3）花粉管通道法第24页/共55页2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞-显微注射法显微注射法第25页/共55页3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物特点：）原核
13、生物特点：单细胞、遗传物质少、单细胞、遗传物质少、繁殖快繁殖快（2）方法）方法步骤步骤：用用CaCa2+2+处理细胞得到感受态细胞处理细胞得到感受态细胞表达载体与感受态细胞混合表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子第26页/共55页四四.目的基因的检测与鉴定：目的基因的检测与鉴定：步骤步骤检测内容检测内容方法方法标记基标记基因筛选因筛选筛选出含目的基因的细胞筛选出含目的基因的细胞利用标记基因进行筛选利用标记基因进行筛选分分子子检检测测第一步第一步转基因生物的转基因生物的DNADNA上是否上是否插入了插入了_DNADNA分子杂交技术分子杂交技术(DNA(DNA
14、和和DNADNA之间之间)第二步第二步目的基因是否转录出了目的基因是否转录出了_分子杂交技术分子杂交技术(DNA(DNA和和mRNAmRNA之之间间)第三步第三步目的基因是否翻译成目的基因是否翻译成_抗原抗原抗体杂交技术抗体杂交技术个体生物学个体生物学水平鉴定水平鉴定抗虫或抗病接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度抗虫或抗病接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度目的基因目的基因mRNAmRNA蛋白质蛋白质第27页/共55页1、利用标志基因进行筛选的原理与方法 为了检测重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按
15、到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是_ _，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是_。能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素pBR322质粒第28页/共55页2、DNA分子杂交的原理与方法第29页/共55页变性第30页/共55页2.(20152.(2015威海模拟威海模拟)科学家将人的生长激素基因与某种细菌科学家将人的生长激素基因与某种细菌(不含抗不含抗生素抗性基因生素抗性基因)的的DNADNA分子进行重组，并成功地在该细菌中得以表达分子进行重组，并成功地在该细菌中得以表达(如下图如下
16、图)。请据图分析回答：。请据图分析回答：第31页/共55页(1)(1)过程过程所示获取目的基因的方法是所示获取目的基因的方法是。(2)(2)细菌是理想的受体细胞，这是因为它细菌是理想的受体细胞，这是因为它。(3)(3)质粒质粒A A与目的基因结合时，首先需要用与目的基因结合时，首先需要用酶将酶将质粒切开质粒切开“缺口缺口”，然后用，然后用酶将质粒与目的基酶将质粒与目的基因因“缝合缝合”起来。起来。逆转录法逆转录法(反转录法反转录法)繁殖快、单细胞、遗传物质较少繁殖快、单细胞、遗传物质较少限制性核酸内切限制性核酸内切DNADNA连接连接第32页/共55页(4)(4)若将细菌若将细菌B B先接种在
17、含有先接种在含有 的培养基上能生长，说明该的培养基上能生长，说明该细菌中已经导入外源质粒，但不能说明外源质粒是否成功插入目的基细菌中已经导入外源质粒，但不能说明外源质粒是否成功插入目的基因；若将细菌因；若将细菌B B再重新接种在含有再重新接种在含有 的培养基上不能生长，的培养基上不能生长，则说明细菌则说明细菌B B中已经导入了插入目的基因的重组质粒。中已经导入了插入目的基因的重组质粒。(5)(5)检测工程菌中的生长激素基因是否转录出检测工程菌中的生长激素基因是否转录出mRNAmRNA和是否翻译出生长和是否翻译出生长激素，可采用的技术分别是激素，可采用的技术分别是 、。氨苄青霉素氨苄青霉素四环素
18、四环素核酸分子杂交抗原核酸分子杂交抗原抗体杂交抗体杂交第33页/共55页4.(20154.(2015唐山模拟唐山模拟)基因工程是在现代生物学、化学和工程学基础上基因工程是在现代生物学、化学和工程学基础上建立和发展起来的，并有赖于微生物学理论和技术的发展运用。基因建立和发展起来的，并有赖于微生物学理论和技术的发展运用。基因工程基本操作流程如下图，请据图分析回答问题：工程基本操作流程如下图，请据图分析回答问题：第34页/共55页(1)(1)图中图中A A是是。(2)(2)在上述基因工程的操作过程中，可以遵循碱基互补配对原则的在上述基因工程的操作过程中，可以遵循碱基互补配对原则的步骤有步骤有(用图解
19、中序号表示用图解中序号表示)。(3)(3)不同种生物之间的基因移植成功，从分子水平分析，进行基因不同种生物之间的基因移植成功，从分子水平分析，进行基因工程的主要理论依据是不同生物的工程的主要理论依据是不同生物的DNADNA结构的基本形式结构的基本形式(填相填相同、不相同同、不相同)，也说明了生物共用一套，也说明了生物共用一套。载体相同遗传密码子第35页/共55页(4)(4)研究中发现，番茄体内的蛋白酶抑制剂对害虫的消化酶有抑制作研究中发现，番茄体内的蛋白酶抑制剂对害虫的消化酶有抑制作用，导致害虫无法消化食物而被杀死，人们成功地将番茄的蛋白酶用，导致害虫无法消化食物而被杀死，人们成功地将番茄的蛋
20、白酶抑制剂基因导入玉米体内，玉米获得了与番茄相似的抗虫性状，玉抑制剂基因导入玉米体内，玉米获得了与番茄相似的抗虫性状，玉米这种变异的来源是米这种变异的来源是。基因重组第36页/共55页(5)科学家在某种植物中找到了抗枯萎病的基因，并用基因工程的方法将该基因导入金茶花叶片细胞的染色体DNA上，经培养长成的植株具备了抗病性，这说明目的基因(抗枯萎病的基因)已。如果把该基因导入叶绿体DNA中，将来产生的配子中_(填“一定”或“不一定”)含有抗病基因。表达不一定第37页/共55页【解析解析】(1)(1)图中图中A A是运载目的基因的载体。是运载目的基因的载体。(2)(2)基因工程的操作步骤包括获取目的
21、基因，基因表达载体的构建，基因工程的操作步骤包括获取目的基因，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。只有将目的基因将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。只有将目的基因导入受体细胞过程不遵循碱基互补配对原则。导入受体细胞过程不遵循碱基互补配对原则。(3)(3)基因工程的操作基础是不同生物的基因工程的操作基础是不同生物的DNADNA结构基本形式相同，且共用结构基本形式相同，且共用一套遗传密码子。一套遗传密码子。(4)(4)基因工程又称基因工程又称DNADNA重组技术，其变异原理为基因重组。重组技术，其变异原理为基因重组。(5)(5)如果把抗枯萎病的基因导入叶绿体
22、如果把抗枯萎病的基因导入叶绿体DNADNA中，将来产生的雌配子中可中，将来产生的雌配子中可能含有抗病基因，雄配子中不含抗病基因。能含有抗病基因，雄配子中不含抗病基因。第38页/共55页第39页/共55页第40页/共55页第41页/共55页第42页/共55页第43页/共55页第44页/共55页第45页/共55页第46页/共55页第47页/共55页第48页/共55页【考题回访考题回访】1.(20151.(2015石家庄模拟石家庄模拟)据图表回答问题：据图表回答问题：第49页/共55页(1)(1)假设所用的限制酶均能将所识别的位点完全切开，采用假设所用的限制酶均能将所识别的位点完全切开，采用EcoR
23、EcoR和和PstPst酶切含有目的基因的酶切含有目的基因的DNADNA，能得到，能得到种种DNADNA片段。如果将质粒载体和含目的基因的片段。如果将质粒载体和含目的基因的DNADNA片段只用片段只用EcoREcoR酶切，酶切，酶切产物再加入酶切产物再加入DNADNA连接酶，其中由两个连接酶，其中由两个DNADNA片段之间连接形成片段之间连接形成的产物有的产物有 、4质粒质粒连接物目的基因目的基因连接物质粒目的基因连接物第50页/共55页(2)为了防止目的基因和质粒表达载体酶切后的末端任意连接，酶切时应该选用的酶是、。EcoRSma第51页/共55页（3 3）若启动子位于图中质粒）若启动子位于
24、图中质粒SmaSma和和EcoREcoR酶切位点之间酶切位点之间(左侧左侧)，能，能否用否用EcoREcoR和和SmaSma进行切割，进而连接？为什么？进行切割，进而连接？为什么？不能。这样会使质粒中的启动子丢失，使形成的基因表达载体无法转录。第52页/共55页不能转录出信使不能转录出信使RNARNA，不能编码蛋白质。，不能编码蛋白质。有调控序列，如启动子和终止子有调控序列，如启动子和终止子：能转录出信使：能转录出信使RNARNA，能编码蛋白质，能编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核细原核细胞胞 基因基因结构结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下
25、游编码区下游 启动子启动子终止子终止子2、原核细胞的基因结构注意：启动子注意：启动子起始密码子，终止子起始密码子，终止子终止密码子：启动子和终止子终止密码子：启动子和终止子位于位于DNADNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于止密码子位于mRNAmRNA上，分别控制翻译的起始和终止。上，分别控制翻译的起始和终止。第53页/共55页3 3：真核细胞的基因结构：真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子（不编内含子（不编码蛋白质）码蛋白质）外显子（编码外显子（编码蛋白质）蛋白质）启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 第54页/共55页感谢您的观看！第55页/共55页