荧光光分析法测定维生素B全.pptx

《荧光光分析法测定维生素B全.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《荧光光分析法测定维生素B全.pptx（54页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。

1、一一 、概、概 述述 什么是荧光呢？什么是荧光呢？当某些物质被光照射后，当某些物质被光照射后，它会吸收一定频率的光，而发射出它会吸收一定频率的光，而发射出波长更长波长更长的的光，当光停止时，发射光也随即消失，这就是光，当光停止时，发射光也随即消失，这就是荧光现象荧光现象，它发出的光就叫，它发出的光就叫荧光荧光。第一次发现。第一次发现荧光现象的是荧光现象的是1616世纪西班牙的内科医生和植物世纪西班牙的内科医生和植物学家学家莫纳德斯莫纳德斯 （）（）,在一种木头在一种木头切片的水溶液中，看到了极为可爱的天蓝色，切片的水溶液中，看到了极为可爱的天蓝色，以此开始了荧光研究。以此开始了荧光研究。第1页

2、/共54页 直直到到18521852年年在在考考察察奎奎宁宁和和叶叶绿绿素素的的荧荧光光时时，用用分分光光计计观观察察到到其其荧荧光光的的波波长长比比入入射射光光的的波波长长稍稍长长些些，才才判判明明这这种种现现象象是是这这些些物物质质在在吸吸收收光光能能后后重重新新发发射射不不同同波波长长的的光光，而而不不是是由由光光的的漫漫射射作作用用所所引引起起的的，才才确确立立了了荧荧光光是是光光发发射射的的概概念念。到到1919世世纪纪末末人人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600600种以上的荧光物质。种以上的荧光物质。第2页/共54页 2020世世

3、纪纪以以来来，荧荧光光现现象象被被研研究究得得更更多多了了，发发现现了了共共振振荧荧光光、增增感感荧荧光光，能能够够进进行荧光产率得绝对测定，还进行了荧光寿命的直接测定等等。行荧光产率得绝对测定，还进行了荧光寿命的直接测定等等。第3页/共54页二、二、荧光发生荧光发生机理机理 当当一一些些物物质质被被光光照照射射后后，物物质质的的分分子子吸吸收收光光以以后后，便便以以基基态态跃跃迁迁到到激激发发态态，成成为为激激发发分分子子，然然后后通通过过相相互互碰碰撞撞或或和和其其它它溶溶剂剂分分子子碰碰撞撞等等去去活活化化的的过过程程而而消消耗耗了了能能量量，回回到到第第一一激激发发态态的的最最低低振振

4、动动能能级级，这这种种跃跃迁迁称称为为无无辐辐射射跃跃迁迁，它它不不会会发发光光。当当电电子子由由激发态的最低振动能级跃迁回基态的不同振动能级时，则以荧光的形态发出能量。激发态的最低振动能级跃迁回基态的不同振动能级时，则以荧光的形态发出能量。第4页/共54页1.1.激激 发发 通常在室温下物质分子通常在室温下物质分子大部分处于基态的最低振大部分处于基态的最低振动动能级（能级（=0=0）。当电子）。当电子吸吸收一定频率的电磁辐射发收一定频率的电磁辐射发生生能级跃迁时，可上升至不能级跃迁时，可上升至不同同激发态的各振动能级，其激发态的各振动能级，其中中大部分分子上升至第一激大部分分子上升至第一激发

5、发单重态（单重态（S S1 1 ），这一过），这一过程程称为激发。称为激发。第5页/共54页2.2.去活化过程去活化过程 处于激发态的分子是不稳定，它可以通过处于激发态的分子是不稳定，它可以通过不同的途径回到基态，这一过程称为去活化。不同的途径回到基态，这一过程称为去活化。去活化过程有以下几种：去活化过程有以下几种：（1 1）振动驰豫）振动驰豫 溶液中分子间碰撞机会很溶液中分子间碰撞机会很多，通过碰撞溶质分子将过剩的能量转移给溶多，通过碰撞溶质分子将过剩的能量转移给溶剂分子，通过非辐射跃迁而降至同一能态的最剂分子，通过非辐射跃迁而降至同一能态的最低振动能级，这一过程称为振动驰豫。低振动能级，这

6、一过程称为振动驰豫。第6页/共54页（2）内部转换）内部转换 同一多重态的不同同一多重态的不同电子能级间可能发生内电子能级间可能发生内部转换。部转换。S2 S1或或T2 T1 条件：当条件：当S2较低振较低振动能级与动能级与S1较高振动能较高振动能级的能量相当，且发生级的能量相当，且发生重叠时分子才有可能重叠时分子才有可能S2 S1或或T2 T1第7页/共54页 （3 3）荧光发射）荧光发射 处于第一激发的处于第一激发的最低振动能级的分最低振动能级的分子，跃迁回基态的子，跃迁回基态的各振动能级，这一各振动能级，这一过程称为荧光发射。过程称为荧光发射。第8页/共54页 （4 4）体系间跨越跃迁）

7、体系间跨越跃迁 分子从激发单重态转至能量较低的激发三重态的过程，称体系间跨越跃迁。分子从激发单重态转至能量较低的激发三重态的过程，称体系间跨越跃迁。三重态：电子自旋方向相同三重态：电子自旋方向相同 单重态单重态:电子自旋方向相反电子自旋方向相反 这些分子从第一激发三重态的最低振动能级下降至第一基态的各振动能级，所发出这些分子从第一激发三重态的最低振动能级下降至第一基态的各振动能级，所发出的辐射即为磷光。的辐射即为磷光。第9页/共54页第10页/共54页1.激发光谱和发射光谱 任何荧光化合物都有两个特征性光谱：激任何荧光化合物都有两个特征性光谱：激发光谱和发射光谱发光谱和发射光谱（1 1）激发光

8、谱）激发光谱 绘制激发光谱时，固定荧光的最大发射波绘制激发光谱时，固定荧光的最大发射波长，然后改变激发光的波长，所测得的荧光强长，然后改变激发光的波长，所测得的荧光强度与激发波长的谱线关系即为激发光谱。度与激发波长的谱线关系即为激发光谱。三、荧光的特性第11页/共54页 （2 2）发射光谱）发射光谱 发射光谱简称荧光光谱。发射光谱简称荧光光谱。绘制发射光谱绘制发射光谱时，固定荧光的最大激发波长，然后改变发射时，固定荧光的最大激发波长，然后改变发射光的波长，所测得的荧光强度与发射波长的谱光的波长，所测得的荧光强度与发射波长的谱线关系即为发射光谱。线关系即为发射光谱。第12页/共54页2.2.荧光

9、光谱形状与激发波长无关荧光光谱形状与激发波长无关 由于分子无论被激发到高于由于分子无论被激发到高于S S1 1哪一个激发哪一个激发态，都经过无辐射的振动驰豫或内部转换等过态，都经过无辐射的振动驰豫或内部转换等过程，最终回到程，最终回到S S1 1态的最低振动能级，然后跃迁态的最低振动能级，然后跃迁回基态产生荧光。回基态产生荧光。第13页/共54页3.3.吸收光谱和荧光光谱有很好的镜像关系吸收光谱和荧光光谱有很好的镜像关系 由于分子的由于分子的S S0 0态和态和S S1 1态中各振动能级的能量态中各振动能级的能量分分布情况相似决定的。因此吸收光谱和发射光谱的布情况相似决定的。因此吸收光谱和发射

10、光谱的形形状相似。状相似。蒽的吸收光谱和发射光谱 吸收光谱 发射光谱第14页/共54页四、荧光与分子结构的关系四、荧光与分子结构的关系（）发光分子中要具有共轭（）发光分子中要具有共轭键体系键体系 共轭的程度越大，共轭的程度越大，电子越容易激发，分子电子越容易激发，分子放光越容易产生。放光越容易产生。（2）具有刚性平面结构分子有利于荧光发射 分子的共平面越大，其电子的共轭程度越大。如荧光素和酚酞结构十分相似，荧光素有很强的荧光，而酚酞没有，这是由于荧光素有刚性平面结构，减少了分子振动，减少了去活化的概率。第15页/共54页（3）取代基的作用 给电子基增强荧光:OH,NH2,NHR,NR2,CN

11、吸电子基减弱荧光：Br,Cl,NO2,NN,COOH 第16页/共54页五、影响荧光强度的因素五、影响荧光强度的因素 1.1.荧光的减退荧光的减退 荧光物质经紫外线长时间照射及空气的氧化荧光物质经紫外线长时间照射及空气的氧化作用，会使荧光逐渐减退作用，会使荧光逐渐减退。2.荧光强度与溶液浓度的关系 在稀溶液中：FKc F 为荧光强度 K检测效率（由仪器决定）c 为液体的浓度第17页/共54页Fc 高浓度时，荧光物质发生熄灭和自吸收现象，使F与c不呈线性关系第18页/共54页3.3.温度的影响温度的影响 温度对荧光强度的影响较敏感。溶液温度温度对荧光强度的影响较敏感。溶液温度下降时，介质的粘度增

12、大，荧光物质与分子的下降时，介质的粘度增大，荧光物质与分子的碰撞也随之减少，去活化过程也减少，则荧光碰撞也随之减少，去活化过程也减少，则荧光强度增加。相反，随着温度上升，荧光物质与强度增加。相反，随着温度上升，荧光物质与分子的碰撞频率增加，使去活化几率增加，则分子的碰撞频率增加，使去活化几率增加，则荧光强度下降。荧光强度下降。第19页/共54页 带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光一般都与溶液合物的荧光一般都与溶液PHPH值有关，例如：在值有关，例如：在pH=712pH=712的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出蓝色

13、荧光；而在蓝色荧光；而在pH2pH13pH13的溶液中苯胺以离的溶液中苯胺以离子形式存在，都不会发出荧光。同时所用酸的种子形式存在，都不会发出荧光。同时所用酸的种类也影响荧光的强度，例如：奎宁在硫酸溶液中类也影响荧光的强度，例如：奎宁在硫酸溶液中的荧光比在盐酸中的要强。的荧光比在盐酸中的要强。4.pH的影响第20页/共54页 许多有机物及金属的有机络合物，在乙醇许多有机物及金属的有机络合物，在乙醇溶液中的荧光比在水溶液中强。乙醇、甘油、溶液中的荧光比在水溶液中强。乙醇、甘油、丙酮、氯仿及苯都是常用的有机溶剂，其中大丙酮、氯仿及苯都是常用的有机溶剂，其中大多有荧光，应设法避免；一般避免的办法是稀

14、多有荧光，应设法避免；一般避免的办法是稀释，或加入一部分水。释，或加入一部分水。5.溶 剂第21页/共54页 6.荧光强度达到最高点所需要的时间不同，有，有的反应加入试剂后荧光强度立即达到最高峰。有的反应加入试剂后荧光强度立即达到最高峰。有的反应需要经过的反应需要经过15301530分钟才能达到最高峰。分钟才能达到最高峰。7.有机溶剂中常有产生荧光的杂质，可用蒸馏法提纯。橡皮塞、软木塞及滤纸中也常有能溶于溶剂的一些带荧光的物质。第22页/共54页 包括有光源、单色器、样品池、检测器和记录显示装置五个部分。包括有光源、单色器、样品池、检测器和记录显示装置五个部分。六、荧光分析仪器的基本组成部件第

15、23页/共54页 激发光源应具有足够的强度、适用波长范围激发光源应具有足够的强度、适用波长范围宽、稳定等特点。常用的光源有高压汞灯和氙弧宽、稳定等特点。常用的光源有高压汞灯和氙弧灯。灯。氙弧灯氙弧灯又称又称氙灯，是目前荧光分光分度计中氙灯，是目前荧光分光分度计中 应用最广泛的一种光源。它是一种短弧气体放电应用最广泛的一种光源。它是一种短弧气体放电灯，外套为石英，内充氙气，光强度大氙灯的灯灯，外套为石英，内充氙气，光强度大氙灯的灯内气压高，启动时的电压高（内气压高，启动时的电压高（2040KV2040KV）,因此使因此使用时一定要注意安全。用时一定要注意安全。1.激发光源第24页/共54页 荧光

16、分析仪中应用最多的单色器为光栅单色器荧光分析仪中应用最多的单色器为光栅单色器 单色器有两块单色器有两块：第一块为第一块为激发单色器激发单色器，用于，用于选择激发光的波长选择激发光的波长；第二块为第二块为发射单色器发射单色器，用于选择，用于选择荧光发射波长荧光发射波长。一般后者的光栅闪耀波长比前者来得长一些。一般后者的光栅闪耀波长比前者来得长一些。第第一一滤滤光光片片用用以以分分离离出出所所需需用用的的激激发发光光，第第二二滤滤光片光片用以滤去杂散光、拉曼光和杂质所发射的荧光。用以滤去杂散光、拉曼光和杂质所发射的荧光。2.单色器 第25页/共54页 荧光分析的比色皿通常用石英材料做成，荧光比色皿

17、四面均为磨光透明面，同荧光分析的比色皿通常用石英材料做成，荧光比色皿四面均为磨光透明面，同时一般仅有一种厚度为时一般仅有一种厚度为1cm1cm的液池。的液池。3.样品池第26页/共54页4.4.检检 测测 器器 荧光计多采用光电倍增管进行检测。荧光计多采用光电倍增管进行检测。检测器的方向应与激发光的方向成直角，以消检测器的方向应与激发光的方向成直角，以消除样品池中透射光和杂散光的干扰。除样品池中透射光和杂散光的干扰。第27页/共54页5.5.记录、显示装记录、显示装置置荧荧光光仪仪的的读读出出装装置置有有数数字字电电压压表表或或记记录录仪仪。现现代代仪仪器器都都配配上上计计算算机机，进进行行自

18、自动动控控制制和和显示荧光光谱及各种参数。显示荧光光谱及各种参数。第28页/共54页荧光分析仪 光源样本池第一（激发）单色器第二（发射）单色器检验器显示、记录装置第29页/共54页七、荧光测定方法七、荧光测定方法1.1.标准曲线法标准曲线法 将已知量的标准物经过与试样相同的处理将已知量的标准物经过与试样相同的处理后，配成一定浓度的标准溶液，并测定他们的后，配成一定浓度的标准溶液，并测定他们的荧光强度，绘制一条以荧光强度和标准溶液浓荧光强度，绘制一条以荧光强度和标准溶液浓度的标准曲线，然后测定未知样的浓度。度的标准曲线，然后测定未知样的浓度。第30页/共54页（2 2）荧光猝灭法 在一般荧光分析

19、中，荧光的猝灭现象是不可避免的，但是我们可以利用猝灭现象，进行荧光分析。例如一物质本身不会发光，也不会与其它物质形成荧光物质，但它会使另外一种会发射荧光的物质荧光强度降低，荧光强度的下降程度与该物质的浓度成比例，此法成为荧光猝灭法。第31页/共54页 1.1.特特 点点 灵敏度高灵敏度高：测定下限0.001 gmL-1,比分光光度法高2 24 4个数量级.仪器设备相对简单、仪器设备相对简单、体积小体积小 操作较简便操作较简便 反应时间也较快反应时间也较快 八、荧光分析法的特点及应用第32页/共54页 生物化学分析、生理医学研究、临床检测生物化学分析、生理医学研究、临床检测（1)1)直接测定能产

20、生荧光的物质直接测定能产生荧光的物质 带苯环带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸 (2)(2)测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质物质 荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构；致癌物同核酸结合常引起显著的荧光的结构；致癌物同核酸结合常引起显著的荧光 (3)(3)荧光熄灭法测定猝灭剂荧光熄灭法测定猝灭剂2.荧光光度法的应用第33页/共54页实验一 荧光法测定医用维生素B2B2中核黄素的含量1.1.学习和掌握荧光光度分析法的基本原理和方法2 2.学会使用荧光分光度计一、实验目的：第34

21、页/共54页 核黄素易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，核黄素易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。核黄素在碱性溶液中经光线照射会热稳定。核黄素在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测核黄素时溶液要核黄素的荧光强的多，故测核黄素时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。二、实验原理第35页/共54页 化学名：7,8-7,8-二甲基1010(2S,3S,4R)-(2S,3S,4R)-2,3,4,5-

22、2,3,4,5-四羟基戊基苯并蝶啶-2,4-2,4（3H3H，10H10H）-二酮 分子式：C C1717H H2020N N4 4O O6 6 分子量：376.36 376.36 第36页/共54页三、实验仪器三、实验仪器RF-5301PC荧光光度计 日本岛津公司 第37页/共54页1.仪器介绍 拥有世界最高水平的S/N，可达到150以上。最适合高灵敏度、高分辨率测定。其主要参数和特点 测定范围：220900nm 带 宽：、3、5、10、20nm 灵敏度：S/N150 测定方式：定性分析、同步光谱分析、定量分析、时间过程测定。第38页/共54页打开电脑和RF-5301RF-5301系统的开关

23、，点击桌面的RF-5301RF-5301的快捷图标，启动仪器的控制程序从“Acquire ModeAcquire Mode”菜单中选SpectrumSpectrum光谱，进入光谱模式。2.操作规程第39页/共54页从“Configure设置”菜单中选择Parameters参数第40页/共54页 若样品激发光谱的发射波长或发射光谱的激若样品激发光谱的发射波长或发射光谱的激发波长未知，则在上述对话框中设置合适的激发波长未知，则在上述对话框中设置合适的激发发发射狭缝宽度，灵敏度，放置标样，在光度计发射狭缝宽度，灵敏度，放置标样，在光度计按按键中点击键中点击 ，在弹出的对话框中选择激发光，在弹出的对话

24、框中选择激发光和发射光的范围以及激发光的波长的间隔，点和发射光的范围以及激发光的波长的间隔，点“SearchSearch”键，等待一段时间，由仪器给键，等待一段时间，由仪器给出出最优波长。最优波长。第41页/共54页扫描完成后出现的谱扫描完成后出现的谱图图第42页/共54页定量分析的参数设置定量分析的参数设置 设置激发发射光波长，激发发射狭缝宽度，灵敏度，反应时间，单位，浓度以及强度范围。第43页/共54页将装有蒸馏水的样品池放入池槽中，点将装有蒸馏水的样品池放入池槽中，点击击“”自动回零。自动回零。将第一个标准样品装入池槽中，点击 弹出如下对话框，输入标准样品的浓度第44页/共54页 以此测

25、完以此测完5 5个标准样品后，屏幕上个标准样品后，屏幕上会会出现工作曲线，也会出现标准曲线方程。出现工作曲线，也会出现标准曲线方程。第45页/共54页 在在工工作作曲曲线线绘绘制制完完成成后后，可可以以定定量量测测定定未未知知样样的的浓浓度度，点点击击 。然然后后将将未未知知样样品品放放入入池槽中，点击池槽中，点击 开始浓度的测定。开始浓度的测定。第46页/共54页最后，在File菜单中选择Save，储存获得的数据第47页/共54页 1.1.10.0 gmL-1核黄素标准溶液的配制：核黄素标准溶液的配制：称取核黄素置于称取核黄素置于50mL50mL烧杯中，以烧杯中，以蒸馏水溶解后，定溶于蒸馏水

26、溶解后，定溶于1000mL1000mL容量瓶中，摇容量瓶中，摇匀，备用。匀，备用。四、实验试剂第48页/共54页1.1.配制系列标准溶液配制系列标准溶液取取4 4个个 50 ml50 ml容量瓶，分别加入容量瓶，分别加入 ，4.00 ml4.00 ml核黄素标准溶液，用水稀释至刻度，核黄素标准溶液，用水稀释至刻度，摇匀。摇匀。2.2.扫描扫描核黄素的最大核黄素的最大激发波长和发射波长激发波长和发射波长 对对核核黄黄素素标标准准溶溶液液进进行行荧荧光光扫扫描描，根根据据激激发发光光谱谱曲曲线线和和发发射射光光谱谱曲曲线线，确确定定最最大大激激发发波波长长和和最最大大发发射射波长。波长。五、实验步

27、骤第49页/共54页 3.3.标准曲线的绘制标准曲线的绘制 根据上述核黄素标准溶液的荧光强度，绘制标准根据上述核黄素标准溶液的荧光强度，绘制标准曲线。曲线。4.4.未知试样的测定未知试样的测定 取医用取医用维生素维生素B B2 2片剂片剂1 1片，置于片，置于5050mLmL烧杯中，加烧杯中，加少量蒸馏水溶解，定溶于少量蒸馏水溶解，定溶于1000ml1000ml容量瓶中，摇匀、备容量瓶中，摇匀、备用。用。第50页/共54页六、数据处理2）核黄素标准溶液浓度及其荧光强度1234未知样品未知样品c c F F 4）计算药片中核黄素的含量，用mg/片表示3)绘制核黄素的标准曲线1）记录核黄素的最大激

28、发波长和最大发射波长EX EM第51页/共54页 在实验中，拿比色杯要拿在实验中，拿比色杯要拿4 4个棱角，切勿个棱角，切勿拿光滑的透光面，以免影响检测效果拿光滑的透光面，以免影响检测效果 比色杯用后，应用醇或其它有机溶剂浸比色杯用后，应用醇或其它有机溶剂浸泡。泡。氙灯长时间使用（氙灯长时间使用（1000h1000h以上）后可能以上）后可能会发生爆炸，所以保证期（会发生爆炸，所以保证期（500h500h）以后，应及）以后，应及时更换。时更换。在安装或更换氙灯时，应确认电源开关在安装或更换氙灯时，应确认电源开关为为OFFOFF，并切断电源。，并切断电源。七.使用注意事项第52页/共54页八、思考题八、思考题1.1.荧光分光光度计与紫外分光光度计的两点主要荧光分光光度计与紫外分光光度计的两点主要区别是什么？区别是什么？2.2.荧光产生的机理？荧光产生的机理？3.3.荧光分光光度计的比色皿为什么四面透光？荧光分光光度计的比色皿为什么四面透光？4.4.为什么荧光分光光度计入射光源和检测器的方向为什么荧光分光光度计入射光源和检测器的方向是垂直的？是垂直的？5.5.为什么不能在碱性环境下检测核黄素？为什么不能在碱性环境下检测核黄素？第53页/共54页感谢您的观看！第54页/共54页