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1、荧光光度分析法测定维生素第1页，共13页，编辑于2022年，星期二OBJECTIVE1 1 学习和掌握荧光光度分析法测定学习和掌握荧光光度分析法测定VBVB2 2的基本原理和方法。的基本原理和方法。2 2 学习荧光分光光度计的使用方法。学习荧光分光光度计的使用方法。第2页，共13页，编辑于2022年，星期二PRINCIPLE荧光：物质的分子经紫外光照射后，发射出的较原来吸收荧光：物质的分子经紫外光照射后，发射出的较原来吸收 光的频率低、波长长的光。不同的荧光物质有各自光的频率低、波长长的光。不同的荧光物质有各自 的特征激发光波长和荧光波长，利用物质的荧光现的特征激发光波长和荧光波长，利用物质的
2、荧光现 象进行定性、定量分析的方法称为荧光分析法。象进行定性、定量分析的方法称为荧光分析法。第3页，共13页，编辑于2022年，星期二对同一物质而言，若对同一物质而言，若bC 1（0.05），即溶液的组），即溶液的组 成量度极稀时，成量度极稀时，荧光强度荧光强度F与溶液的组成量度与溶液的组成量度C有以下关系：有以下关系：F=2.303I0bC：荧光效率：荧光效率 I0：入射光强度：入射光强度:荧光物质的摩尔吸光系数荧光物质的摩尔吸光系数 b：样品池的厚度：样品池的厚度 I0 和和 b当当 固定时，固定时，F=KC第4页，共13页，编辑于2022年，星期二0FCC样品样品 F=KC F样品样品第
3、5页，共13页，编辑于2022年，星期二VB2的的C（HAc）=0.1mol/L溶液在紫外光照射下，发出黄溶液在紫外光照射下，发出黄绿色荧光，可直接进行荧光测定。绿色荧光，可直接进行荧光测定。pH=2.9,激发激发 370nm，467nm 发射发射 527nmVB2，核黄素，核黄素第6页，共13页，编辑于2022年，星期二PROCEDURE1 维生素维生素B2系列标准溶液的配制系列标准溶液的配制0.1mol/L HAc 准确吸取准确吸取VB2贮备液贮备液(125 g/ml)0.50ml定容定容 50.0ml摇匀摇匀 1.25 g/ml VB2 操作液操作液 第7页，共13页，编辑于2022年，
4、星期二 编号编号 1 2 3 4 5 6 VB2 操作液操作液(ml)0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00用用0.1mol/L Hac稀释至稀释至(ml)25.00荧光强度荧光强度F相对荧光强度相对荧光强度F第8页，共13页，编辑于2022年，星期二2 待测溶液的配制待测溶液的配制 取样品溶液取样品溶液 5.00ml 0.1mol/L HAc定容定容25.0ml摇匀摇匀 待测溶液待测溶液 第9页，共13页，编辑于2022年，星期二3 标准曲线绘制标准曲线绘制 1）仪器预热（激发光波长）仪器预热（激发光波长360nm，荧光波长，荧光波长510nm）。）。2）以系列标准液）
5、以系列标准液6号液为标准，调节荧光强度号液为标准，调节荧光强度F为为90左右左右。3）固定荧光测定条件不变。分别测定下列标准液）固定荧光测定条件不变。分别测定下列标准液16号液（由稀倒浓）的荧光强度号液（由稀倒浓）的荧光强度F，并记录。并记录。4）以溶液组成量度）以溶液组成量度C为横坐标，相对荧光强度为横坐标，相对荧光强度F，为纵坐标，绘制标准曲线。，为纵坐标，绘制标准曲线。0FC(g/ml)第10页，共13页，编辑于2022年，星期二4 样品测定样品测定1）在相同的荧光测定条件下，测定样品液的荧光强度）在相同的荧光测定条件下，测定样品液的荧光强度F。2）从标准曲线上查出对应的组成量度，再乘以
6、）从标准曲线上查出对应的组成量度，再乘以5，得试样，得试样 中维生素中维生素B2的组成量度。的组成量度。C待测待测0FC(g/ml)第11页，共13页，编辑于2022年，星期二DATA 编号编号 1 2 3 4 5 6 7 VB2 操作液操作液(ml)0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 5.00样品样品用用0.1mol/L Hac稀释至稀释至(ml)25.00VB2标准溶液组成量度标准溶液组成量度(g/ml)荧光强度荧光强度 F相对荧光强度相对荧光强度 F实验结果：实验结果：CVB2=第12页，共13页，编辑于2022年，星期二QUESTION&DISCUSSION为何要以为何要以5号液来调节荧光强度为号液来调节荧光强度为90左右左右?第13页，共13页，编辑于2022年，星期二