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1、3-1 高效液相色谱法的特点1.高效液相色谱法概述u1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易汽化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。u1960年代末科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。u1971年科克兰等人出版了液相色谱的现代实践一书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。第1页/共86页它是在它是在经典液相色谱经典液相色谱基础上，引入了基础上，引入了气相色谱的理论气相色谱的理论，在技术上，在技术上采用了高压泵、采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速
2、度快、效率高、灵敏度高、操作自动高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点化的特点 为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：一、概述第2页/共86页 1高效液相色谱法与经典液相色谱法 高效液相色谱法的最大优点在于高效液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化高速、高效、高灵敏度、高自动化液体的流动相高速通过时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对流动液体的流动相高速通过时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对流动相施加高压相施加高压1535 Mpa，因此，因此
3、高压、高速高压、高速是高效液相色谱的特点之一。是高效液相色谱的特点之一。第3页/共86页高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较 经典液相色谱法高效液相色谱法粒径(m)75-6003-50（常用5-10）柱前压力(atm)0.01-1.020-300分析时间(h)1-200.05-1.0色谱柱长度(cm)50-2002-30柱效(块/m)2-50104-105样品用量(g)1-1010-6-10-2第4页/共86页2高效液相色谱法与气相色谱法 （l l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的总数的
4、2020对于占有机物总数近对于占有机物总数近8080的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析 第5页/共86页(2)高效高效GC 1000塔板塔板/m(填充柱）填充柱）HPLC 3W 塔板塔板/m第6页/共86页(3)气气相相色色谱谱一一般般都都在在较较高高温温度度下下进进行行的的，而而高高效效液液相相色色谱谱法法则则经经常常可可在在室室温温条条件件下工作下工作 总总之之，高高效效液液相相色色谱谱法法是是吸吸取取了了气气相相色色谱谱与与经经典典液液相相色色谱谱优优点点
5、，并并用用现现代代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展化手段加以改进，因此得到迅猛的发展第7页/共86页高效液相色谱与气相色谱的比较GCHPLC应用范围热稳定、低沸点的物质热不稳定、高沸点、离子型的物质热力学理论较成熟正在发展中分析成本低高分离能力与柱的类型有关较高第8页/共86页液相色谱仪器 high performance liquid chromatograph第9页/共86页3.高效液相色谱法的应用 1.药物分析约约80%80%的药物都能用高效液相色谱进行分离和纯化。特别是手的药物都能用高效液相色谱进行分离和纯化。特别是手性药物的分离分析。性药物的分离分析。2.食品分析 食品本身组成食品
6、本身组成,特别是营养成分，如糖、有机酸、维生素、特别是营养成分，如糖、有机酸、维生素、蛋白质、氨基酸、脂肪的分析；蛋白质、氨基酸、脂肪的分析；食品添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、合成色素、甜味剂和保食品添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、合成色素、甜味剂和保鲜化学物质的分析；鲜化学物质的分析；食品污染物，如农药残余和黄曲霉素等的分析。食品污染物，如农药残余和黄曲霉素等的分析。3.制备分离应用要制备或提取一些高纯化合物，如新合成化合物的结构鉴定，要制备或提取一些高纯化合物，如新合成化合物的结构鉴定，药物的生物和毒理试验。药物的生物和毒理试验。第10页/共86页4.高效液相色谱法的特点高压（150105350
7、105 Pa）高速（in 1 hr）高效（3w/m)高灵敏度(UV-ng;FL-10pg;TAS)第11页/共86页人参、西洋参与三七的鉴别R1Rg1ReRb1RdABCRg1Rg1ReReRfRb1RcRb2RdRc三种药材的HPLC指纹图谱第12页/共86页3-2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素H=A+B/+C1.高效液相色谱中的速率方程第13页/共86页高效液相色谱中的速率方程涡流扩散项 纵向扩散 流动相传质 滞留区传质 固定相内传质第14页/共86页2.对速率方程的讨论选用细颗粒填料可获高柱效（5m）流动相流速低，有利于达到高柱效选用黏度小的流动相有利于提高柱效温度的影响(适当提高柱温
8、以降低流动相黏度）液膜厚度的影响第15页/共86页3.柱外效应由于色谱柱之外的因素引起的色谱峰的展宽，例如进样系统、连接管路及检测器的死体积等。第16页/共86页3-3 3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理高效液相色谱的类型及其分离原理 液液液分配色谱及化学键合相色谱液分配色谱及化学键合相色谱 液液固吸附色谱固吸附色谱离子交换色谱离子交换色谱 离子色谱离子色谱 空间排阻色谱空间排阻色谱 第17页/共86页流动相和固定相都是液体分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异利用组分在两相中溶解度的差异固定相：载体载体+固定液固定液早期物理或机械法涂渍固定液，由于易流失已较少采用；早期物理或机械法涂渍固
9、定液，由于易流失已较少采用；现在应用最广的是现在应用最广的是化学键合固定相化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到担体：将各种不同基团通过化学反应键合到担体（硅胶）表面的游离羟基上。（硅胶）表面的游离羟基上。liquid-liquid partition chromatographyliquid-liquid partition chromatography1 1、液-液分配色谱第18页/共86页液液分配色谱固定液类型固定液类型：,氧二丙腈、聚乙二醇、角鲨烷等。氧二丙腈、聚乙二醇、角鲨烷等。液液液色谱流动相应尽可能不与固定液互溶，两者的极性差别液色谱流动相应尽可能不与固定液互溶，两者的
10、极性差别应很大。应很大。固定液为极性、流动相为非极性的液固定液为极性、流动相为非极性的液液色谱称为液色谱称为正相色谱正相色谱，反之，则称为反之，则称为反相色谱反相色谱。第19页/共86页 正相色谱固定液极性 流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分适于分离极性组分 反相色谱固定液极性 10%）可对相对分子质量在可对相对分子质量在可对相对分子质量在可对相对分子质量在100-8*10100-8*10100-8*10100-8*105 5 5 5范围内的化合物按质量分离范围内的化合物按质量分离范围内的化合物按质量分离范围内的
11、化合物按质量分离第31页/共86页液相色谱分离类型的选择（1）根据相对分子质量选择）根据相对分子质量选择 相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱 标准液相色谱类型（液标准液相色谱类型（液-固、液固、液-液、及离子交换色谱）最适合的相对分子液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是质量范围是2002000 对于相对分子质量大于对于相对分子质量大于2000的样品，则用尺寸排阻法为最佳的样品，则用尺寸排阻法为最佳第32页/共86页（2）根据溶解度选择）根据溶解度选择 如如：样样品品可可溶溶于于水水并并属属于于能能离离解解物物质，以
12、采用离子交换色谱为佳；质，以采用离子交换色谱为佳；如：样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用液如：样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用液-固吸附色谱固吸附色谱 第33页/共86页（3 3）根据分子结构选择）根据分子结构选择 例如，酸、碱化合物宜用离子交换色谱；例如，酸、碱化合物宜用离子交换色谱；脂肪族或芳香族宜用液脂肪族或芳香族宜用液-液分配色谱或液液分配色谱或液-固吸附色谱；固吸附色谱；异构体用液异构体用液-固吸附色谱；固吸附色谱；同系物用液同系物用液-液分配色谱液分配色谱 等等。等等。第34页/共86页分离类型选择总结，P93第35页/共86页3-4 3-4 液相色谱法固定相液相色谱
13、法固定相 高效液相色谱柱是HPLC的心脏。左右心房分别是：固定相和其填装技术（）固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.O1081.O109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒第36页/共86页（2 2）全多孔型）全多孔型）全多孔型）全多孔型 由由氧氧化化硅硅、氧氧化化铝铝、硅硅藻藻土土等等制制成成的的多多孔孔球球体体；早早期期采采用用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用现采用510m的小颗粒，比表面积和柱容量都很大。的小颗粒，比表面积和柱容量都很
14、大。（1 1）表面多孔型）表面多孔型）表面多孔型）表面多孔型 基基体体是是3040m实实心心玻玻璃璃微微球球，表表面面附附着着一一层层厚厚度度为为12m的的多多孔孔活活性性材材料料，如如硅胶、氧化铝等。硅胶、氧化铝等。表面积小，柱容量低。表面积小，柱容量低。固定相按照空隙深度分类：固定相按照空隙深度分类：第37页/共86页1、液液色谱法、键合相色谱法及离子对色谱法固定相1）全多孔型单体（porous micro beads support）2）表层多孔型担体（pellicular microbeads support）第38页/共86页化学键合固定相化学键合固定相（1960后）后）在硅胶表面利
15、用硅烷化反应制得Si-O-Si-C型的反应该化学键稳定，是广泛使用的固定相（C-18）。第39页/共86页类型类型类型类型分离方式分离方式分离方式分离方式 应用特点应用特点应用特点应用特点C-18C-18C-18C-18反相、离子对反相、离子对反相、离子对反相、离子对普适性好，保留值大。溶于水的高极性化合普适性好，保留值大。溶于水的高极性化合普适性好，保留值大。溶于水的高极性化合普适性好，保留值大。溶于水的高极性化合物、中等极性化合物物、中等极性化合物物、中等极性化合物物、中等极性化合物C-8C-8C-8C-8反相、离子对反相、离子对反相、离子对反相、离子对与与与与C-18C-18C-18C-
16、18类似，保留值略小类似，保留值略小类似，保留值略小类似，保留值略小C-3,C-4C-3,C-4C-3,C-4C-3,C-4反相反相反相反相保留值小，适合肽类和蛋白质保留值小，适合肽类和蛋白质保留值小，适合肽类和蛋白质保留值小，适合肽类和蛋白质苯基苯基苯基苯基反相反相反相反相保留适中，选择性不同。非极性、中等极性保留适中，选择性不同。非极性、中等极性保留适中，选择性不同。非极性、中等极性保留适中，选择性不同。非极性、中等极性化合物化合物化合物化合物-CN-CN-CN-CN反相、正相反相、正相反相、正相反相、正相选择性与硅胶类似，保留小，用途广选择性与硅胶类似，保留小，用途广选择性与硅胶类似，保
17、留小，用途广选择性与硅胶类似，保留小，用途广-NH-NH-NH-NH2 2 2 2反相、正相反相、正相反相、正相反相、正相分离糖类、核苷酸、固醇等分离糖类、核苷酸、固醇等分离糖类、核苷酸、固醇等分离糖类、核苷酸、固醇等二醇基二醇基二醇基二醇基正相正相正相正相分离有机酸、排阻分蛋白质等分离有机酸、排阻分蛋白质等分离有机酸、排阻分蛋白质等分离有机酸、排阻分蛋白质等醚基醚基醚基醚基反相、正相反相、正相反相、正相反相、正相分离酚类、芳硝基化合物，保留比分离酚类、芳硝基化合物，保留比分离酚类、芳硝基化合物，保留比分离酚类、芳硝基化合物，保留比C-18C-18C-18C-18强强强强聚苯乙烯基聚苯乙烯基聚
18、苯乙烯基聚苯乙烯基反相反相反相反相pHpHpHpH使用范围广，对部分分离峰形好，寿命长使用范围广，对部分分离峰形好，寿命长使用范围广，对部分分离峰形好，寿命长使用范围广，对部分分离峰形好，寿命长常用固定相表3-2第40页/共86页化学键合固定相特点表面没有液坑，传质快无固定液流失可以改变选择性（通过键合不同官能团）有利于梯度洗提，及配用灵敏的检测器第41页/共86页2液固吸附色谱法固定相（2 2）高分子多孔小球高分子多孔小球：YSGYSG原理：吸附原理：吸附+分配分配蒹小孔凝胶作用蒹小孔凝胶作用特点：柱选择性好，峰形好，柱效低特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物适用：分离弱极
19、性化合物（1 1）硅胶硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶）表孔硅胶（薄壳硅胶）全多孔硅胶全多孔硅胶无定形无定形 YWG56YWG56m510m5104 4球形球形YQG34YQG34m810m8108 8 堆积硅珠堆积硅珠YQG34YQG34m810m8108 8 理想理想原理：吸附原理：吸附特点：峰易拖尾特点：峰易拖尾适用：分离极性化合物适用：分离极性化合物第42页/共86页在气相色谱中，载气是惰性的，常用的只有三在气相色谱中，载气是惰性的，常用的只有三四种，他们的性质差异也不大，所以要提高柱四种，他们的性质差异也不大，所以要提高柱子的选择性，只要选择合适的固定相即可。子的选择性，只要选择合适的固定相
20、即可。但在液相色谱中，当固定相选定后，流动相的但在液相色谱中，当固定相选定后，流动相的种类、配比能显著的影响分离效果，因此，流种类、配比能显著的影响分离效果，因此，流动相的选择也非常重要。动相的选择也非常重要。液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。3-5 液相色谱法流动相第43页/共86页流动相的选择原则流动相纯度要高（色谱纯）且价格便宜应避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样要有适宜的溶解度溶剂的粘度要小些为好应与检测器相匹配第44页/共86页常用溶剂的极性顺序：水水(最大最大)甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮
21、 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环己烷环己烷 己烷己烷 煤油煤油(最小最小)在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。例如，采用正相液在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。例如，采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保
22、留时间缩短。极性溶剂，使保留时间缩短。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据第45页/共86页高效液相色谱仪3-6 高效液相色谱仪第46页/共86页 高效液相色谱仪：贮液器、高压泵、梯度洗提装置、进样器、色谱柱、检测器、恒温器和色谱工作站等。主要工作部件第47页/共86页1.高压泵色谱柱很细色谱柱很细 1-6mm1-6mm，填充剂粒度小，填充剂粒度小 5-10m5-10m，阻力，阻力很大很大要求：流量稳定，压力平稳无脉动要求：流量稳定，压力平稳无脉动（1）往复式柱塞泵（2）
23、气动放大泵恒流泵和恒压泵两类第48页/共86页2.梯度洗提梯度洗提 即即程序控制流动相的组成程序控制流动相的组成，使在整个分离过，使在整个分离过程中，程中，溶剂强度溶剂强度按照特定的变化按照特定的变化规律增加规律增加。优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值范围内。缺点：检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。第49页/共86页应用举例第50页/共86页3.进样装置注射器进样装置高压定量进样阀第51页/共86页旋转式六通阀 六通进样阀结构示意图第52页/共86页 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约530cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。
24、进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。进样阀第53页/共86页 色谱柱是液相色谱仪的心脏部件，它包括色谱柱是液相色谱仪的心脏部件，它包括柱柱管管与与固定相固定相两部分两部分 柱柱管管材材料料有有玻玻璃璃、不不锈锈钢钢、铝铝、铜铜及及内内衬衬光光滑滑的的聚聚合合材材料料的的其其他他金金属属玻玻璃璃管管耐耐压压有有限限，故故金金属属管管用用得得较较多多，目目前前标标准准色色谱谱柱柱长长151530 30 cmcm，内径为，内径为4.6 mm4.6 mm或或3.9 mm3.9 mm，直型不锈钢柱，直型不锈钢柱4.分离系统色谱柱 第54页/共86页 柱子装填得好坏对
25、柱效影响很大。对于细粒度的填料（20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。第55页/共86页液相色谱柱发展趋势减小填料颗粒度（35 m），提高柱效；可以使用更短的柱（数cm），加快分析速度;减小柱径（内径3,内表面带负电荷，吸引缓冲液中的水合阳离子形成双电层，在高电场的作用下，双电层中的水合阳离子层向负极移动，将管内溶液整体拖向负极方向流动而形成电渗流。3-10 毛细管电泳 CE第84页/共86页 思考题1现需分离分析一氨基酸试样，拟采用哪种色谱？2提高液相色谱中柱效的最有效途径是什么？3.何谓反相液相色谱？何谓
26、正相液相色谱？4.在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种试样？5.在液相色谱中，范氏方程中的哪一项对柱效能的影响可以忽略不计？6.对下列试样，用液相色谱分析，应采用何种检测器：（l）长链饱和烷烃的混合物 （2）水源中多环芳烃化合物。7.对聚苯乙烯相对分子质量进行分级分析，应采用哪一种液相色谱法？8什么是化学键合固定相？它的突出优点是什么？9什么叫梯度洗脱？它与气相色谱中的程序升温有何异同？10.指出下列各种色谱法，最适宜分离的物质。（l）气液色谱；(2)正相色谱；（3）反相色谱；（4）离子交 换 色谱;（5）凝胶色谱；(6）气固色谱；(7）液固色谱。第85页/共86页感谢您的观看！第86页/共86页