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1、色谱理论第1页，共46页，编辑于2022年，星期二内容内容 1 绪绪 论论 2 色谱理论基础色谱理论基础 3 色谱定性定量方法色谱定性定量方法4 气相色谱分析气相色谱分析 5 高效液相色谱分析高效液相色谱分析6 超临界流体色谱和毛细管电泳超临界流体色谱和毛细管电泳 7 色谱联用简介色谱联用简介8 计算机技术在色谱分析中的应用计算机技术在色谱分析中的应用第2页，共46页，编辑于2022年，星期二4 色谱理论基础色谱理论基础 n色谱流出曲线及相关术语n色谱柱效能n塔板理论、柱效能指标n速率理论、影响柱效能指标的因素n分离度、影响分离度的因素、分离度应用示例n色谱分离条件的选择（气相色谱）第3页，共
2、46页，编辑于2022年，星期二色谱流出曲线 n试样经色谱柱获得分离，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变成电信号，由记录仪记录下信号时间曲线，称为色谱流出曲线或色谱图。第4页，共46页，编辑于2022年，星期二色谱相关术语由色谱流出曲线可直接得到的相关术语：n 基线n 色谱峰n 色谱时间由色谱流出曲线可间接得到的相关术语：n 色谱体积n 相对保留值由色谱流出曲线可解决的问题第5页，共46页，编辑于2022年，星期二基线基线(Baseline)在色谱操作条件下，仅有流动相通过检测器时，由记录仪得到的信号时间曲线。n基线漂移(Baseline drift)：基线随时间定向
3、缓慢的变化。n基线噪声(Baseline noise)：由于各种原因引起的基线波动。不论有无组分流 出，其噪声均存在，它是一种背景信号。第6页，共46页，编辑于2022年，星期二色谱峰色谱峰(Chromatographic peak)n流动相带着组分通过检测器时，由记录仪得到的信号时间曲线。n峰底(Peak base)：从峰的起点到峰的终点之间连线。n峰高(Peak hight)：峰的顶点至峰底的垂直距离,通常用h表示。n峰面积（Peak area）：峰与峰底之间的面积，用A表示。n色谱峰区域宽度(Peak width)：第7页，共46页，编辑于2022年，星期二色谱峰区域宽度色谱峰区域宽度(
4、Peak width)n是色谱流出曲线的一个重要参数，它直接反映了分离条件的好坏。习惯上有下面三种表示方法：n1）标准偏差（Standard error）：峰高0.607处色谱峰宽度的一半,用表示。n2）峰宽（peak width）或基线宽度（Baseline width）：通过峰两侧的拐点作切线与峰底相交的宽度，用Y表示。与标准偏差的关系为：Y=4。n3）半峰宽（Peak width at half height）：峰高一半处色谱峰的宽度,用Y1/2表示。与标准偏差的关系为：Y1/2=2(2ln2)1/2。第8页，共46页，编辑于2022年，星期二色谱时间色谱时间色谱时间主要有：n死时间（D
5、ead time）：不被固定相吸附或溶解的惰性组分，从进样到出峰的峰顶点之间测得的时间,用tM表示。n保留时间（Retention time）：从进样到组分峰顶点之间测得的时间，用tR表示。n调整保留时间(Adjusted Retention Time)：调整保留时间指组分的保留时间扣除死时间后的时间，用tR表示。tR=tR-tM第9页，共46页，编辑于2022年，星期二色谱体积色谱体积色谱体积主要有：n死体积（Dead Volume）：死体积指色谱柱填充固定相后的空隙体积，又指在死时间内流动相流经色谱柱的体积。死体积通常用Vm表示。Vm=tMFC Fc表示流动相的体积流速（mL/min）n保
6、留体积（Retention Volume）：保留体积指从进样开始，到检测器中样品浓度最大时，流动相流经色谱柱的体积。通常用VR表示。VR=tRFCn调整保留体积(Adjusted Retention Volume)：调整保留体积指保留体积扣除死体积后的体积。通常用VR 表示。VR=tRFC第10页，共46页，编辑于2022年，星期二相对保留值（相对保留值（Relative Retention Value）n相对保留值指某组分i与基准组分s的调整保留值之比。通常用ris表示。第11页，共46页，编辑于2022年，星期二色谱的流出曲线图可以解决的主要问题色谱的流出曲线图可以解决的主要问题 n1）色
7、谱峰出现的位置决定于物质的性质，根据色谱峰的位置可对组分进行定性；n2）色谱峰的面积和峰高是组分浓度或含量的量度，故根据色谱峰的面积或峰高，可对组分进行定量；n3）根据色谱峰的位置及其宽度，可以对色谱柱的分离情况进行评价。第12页，共46页，编辑于2022年，星期二色谱柱效能 n色谱分析首先要求把各组分彼此分离，然后再对分离后的单组分进行定性定量。两相邻组分怎样才算达到完全分离？第一是两峰之间必须有足够的距离。但若两峰之间有一定的距离，而每一个峰很宽，以致彼此严重交叠，如下图3-21A，则二组分仍无法分离。所以第二是峰必须很窄。只有同时满足两个条件，二组分才算达到完全的分离，如下图3-21B。
8、第13页，共46页，编辑于2022年，星期二n两峰间的距离由两组分在两相间的分配系数所决定。对于确定的组分，在一定的温度条件下，分配系数的大小取决于固定相的性质。即两峰间的距离受热力学因素控制。色谱峰宽度由色谱柱效能所决定。即：n两峰间距离受色谱柱内热力学因素控制n谱峰宽度受色谱柱内动力学因素决定n柱效能的高低与组分在色谱柱中的运动情况有关，它取决于分离操作条件的选择，即色谱峰宽度受色谱动力学因素所控制。显然，为了控制组分的分离，必须全面考虑色谱热力学和色谱动力学这两个因素，正确的选择固定相和色谱分离操作条件。第14页，共46页，编辑于2022年，星期二n在色谱技术发展的早期，马丁等人将色谱过
9、程比拟作蒸馏过程，因而直接引用蒸馏过程的概念、理论和方法来处理色谱过程。即连续的色谱过程看作是许多小段平衡过程的重复，从而提出了塔板理论。这个半经验性的理论把色谱柱比作一个分馏塔，柱子由若干想象的塔板组成，在这个塔板高度间隔内，试样中个组分在气液两相间达成分配平衡，经过若干次的分配平衡后，具有不同分配系数的各组分彼此分离，分配系数小的组分（挥发性大的组分）最先从塔顶逸出。塔板理论第15页，共46页，编辑于2022年，星期二柱效能指标n在塔板理论中，把每一块塔板的高度，即组分在柱内达成一次分配平衡所需要的柱长称为理论塔板高度。n理论塔板数的计算公式为：设色谱柱的长度为L，则理论塔板高度H为：虽然
10、，色谱柱的理论塔板数越大，理论塔板高度越小，则柱效越高，因而和可作为描述柱效能的一个指标。第16页，共46页，编辑于2022年，星期二n由于死时间的存在，常用有效塔板（n有效）或有效塔板高度（H有效）作为色谱柱的效能指标，其计算公式为：n色谱柱的有效塔板数越多，表示组分在色谱柱内达到分配平衡的次数越多，柱效越高，对分离越有利。但它不能决定各组分是否有被分离的可能，因为分离的可能性决定于各组分的分配系数的差别，因此只能把它看作是在一定条件下柱分离能力发挥的程度标志。n同一根色谱柱对不同物质的柱效能是不一样的，当用这些指标表示柱效能时，必须说明是对什么物质而言的。第17页，共46页，编辑于2022
11、年，星期二n塔板理论在解释色谱流出曲线的形状及计算评价柱效高低的塔板数和塔板高度方面是成功的，但由于塔板理论假设的某些错误，如它认为组分在两相间能瞬间达到平衡，纵向扩散可以忽略等，使得塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下可以测得不同的理论塔板数这一实验事实，无法找出影响塔板高度的因素。第18页，共46页，编辑于2022年，星期二速率理论n荷兰学者范第姆特（Van Deemter）等人，于1956年提出了速率理论。此理论指出，涡流扩散、分子扩散及组分在气相中和液相中的传质阻力是造成色谱峰扩张使得柱效下降的原因。并从理论上归纳出了联系各影响因素的速率理论方程式：式中A、B、C为三个常数，其
12、中A称为涡流扩散项，B称为分子扩散系数，C为传质阻力系数。U为载气的线速度，即：u=载气体积流速/色谱柱的截面积，单位为cm/秒。第19页，共46页，编辑于2022年，星期二影响柱效能的因素nA-涡流扩散项n分子扩散项（气液色谱）n传质阻力项（气液色谱）n速率理论的完整表达式（气液色谱）n速率理论的完整表达式（液液色谱）n毛细管色谱柱速率理论方程第20页，共46页，编辑于2022年，星期二A涡流扩散项涡流扩散项 A=2dpn其中是与填充均匀性有关的因素，称填充不规则因子。dp为担体的平均颗粒直径，即担体粒度，单位为厘米。n该式说明涡流扩散项所引起的峰形变宽与固定相颗粒平均直径dp和固定相的填充
13、不规则因子有关。显然，使用直径小、粒度均匀的固定相，并尽量填充均匀，可以减小涡流扩散，降低塔板高度，提高柱效。第21页，共46页，编辑于2022年，星期二分子扩散项（分子扩散项（B/u）nB/u=2Dg/u 可知B与和Dg有关。为弯曲因子，它反映了固定相对分子扩散相的阻碍程度。通常小于1，对常用的硅藻土担体，在0.50.7之间。Dg为组分在气相中的扩散系数，与组分的性质、柱温、柱压以及载气的性质有关。为为载气的线性速度，u越小，组分在气相中停留时间越长，分子扩散也就越大。所以，实际过程中若加快载气流速，可以减小由于分子扩散而产生的色谱峰扩张。由于组分在气相中的扩散系数Dg近似地与载气的摩尔质量
14、的平方根成反比，即：Dg(1/M载气)1/2 所以实际过程中使用摩尔质量大的载气可以减小分子扩散相。第22页，共46页，编辑于2022年，星期二传质阻力项传质阻力项 nCu相为传质阻力相，它包括气相传质阻力相cg.u和液相传质阻力相cl.u两项，即：Cu=（cg+cl）un式中，cg、cl分别为气相相传质阻力系数和液相传质阻力系数。n速率理论指出了影响柱效能的因素，为色谱分离操作条件的选择提高了理论指导。第23页，共46页，编辑于2022年，星期二气相传质阻力相气相传质阻力相n气相传质阻力是表示气液或气固两相进行质量交换时所受到传质阻力，这个阻力会使柱横断面上的浓度分配不均匀。阻力越大，浓度分
15、配就越不均匀，峰扩散就越严重。由于：所以实际过程中若采用小颗粒的固定相，以低分子量气体作载气如H2、He等，以利于增大Dg，提高柱效。第24页，共46页，编辑于2022年，星期二液相传质阻力相液相传质阻力相n液相传质项是表示组分从气液界面移动到液相内部，进行质量交换达到分配平衡，然后又返回气液界面时所受到的传质阻力。n由于：所以实际过程中若采用液膜薄的固定液则有利于液相传质，但不宜过薄，否则会减少样品的容量，降低柱的寿命。第25页，共46页，编辑于2022年，星期二气液色谱速率理论的完整表达式气液色谱速率理论的完整表达式第26页，共46页，编辑于2022年，星期二液液色谱速率理论的完整表达式液
16、液色谱速率理论的完整表达式 高效液相色谱由于流动相与气相色谱不同，液体的扩散系数只有气体的万分之一至十万分之一，液体的粘度比气体大一百倍，而密度为气体的1000倍左右。其速率理论方程式为：其中：Cd为填充系数，为一常数；Cm是容量因子k的函数，为一常数，其值取决于柱直径、形状和填充状况，当柱填充均匀紧密时，其值下降；Csm是与固定相颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数以及容量因子k有关，为一常数；Cs是与容量因子k有关的常数；Dm为组分在流动相中的扩散系数，比气相扩散系数小45个数量级；Ds为组分分子在固定液内的扩散系数；其余参数含义与范第姆特方程中的意义一致。上式与范第姆特方程式的形式是一致的
17、，主要区别在于分子扩散项可以忽略不计，影响塔板高度的主要因素是传质阻力项。第27页，共46页，编辑于2022年，星期二毛细管色谱柱速率理论方程毛细管色谱柱速率理论方程对于空心毛细管柱和多孔层毛细管柱，由固定相阻碍作用产生的涡流扩散项不存在，其范第姆特方程中的A=0；分子扩散项中的弯曲因子=1。1958年戈雷（Golay）提出了毛细管色谱柱的速率理论方程式：第28页，共46页，编辑于2022年，星期二分离度（色谱柱的总分离效能-R）n分离度又称分辨率，定义定义为相邻二组分色谱峰的调整保留时间之差，与二组分色谱峰宽总和之半的比值。即：式中：、分别为组分1、2的调整保留时间；Y1、Y2为组分1、2色
18、谱峰的峰宽。显然两组分色谱峰的保留时间差值越大，峰越窄，R则越大，相邻两组分分离得越好。第29页，共46页，编辑于2022年，星期二 n对于等面积的色谱峰，n当R=1.5时，二组分分离程度可达99.7%，可认为二组分已完全分离；n当R=1.0时，二组分分离程度可达98%，只有很少部分重合，可认为二组分刚好分开；n当R=0.8时，二组分分离程度可达89%。n具体需多大的R值才合适，应根据分离分析的具体目的而定。如需收集高纯度的组分时，R值越大越好；如需要定量分析一个组分时的误差小，R刚好完全分离就行，即R1.5；如只需进行定性分析，则要求各组分在色谱图上露出一个峰尖便可。第30页，共46页，编辑
19、于2022年，星期二n由于分离度概括了实现组分分离的热力学和动力学（即峰间距和峰宽）两方面的因素，定量地描述了相邻二组分实际分离的程度，因而用它作为色谱柱的总分离效能总分离效能指标指标。第31页，共46页，编辑于2022年，星期二分离度的影响因素 分分离离度度R的定义并没有反映影响分离度的诸因素。实际上，分离度受理论柱效（n）、选择因子()和容量因子（k）三个参数的控制。对于难分离物质对，由于它们的分配系数差别小，可合理地假设k1k2=k,W1W2W。由定义式，得：第32页，共46页，编辑于2022年，星期二n在实际应用中，往往用n有效代替n,处理上式可得分离度的又一表达式：n由上式可得：分离
20、度与柱效（n）的关系 分离度与选择因子()的关系 分离度与容量因子（k）的关系 分离度与分析时间（t）的关系第33页，共46页，编辑于2022年，星期二分离度与柱效的关系分离度与柱效的关系 由分离方程式看出，具有一定相对保留值的物质对，分离度直接和有效塔板数有关，说明有效塔板数能正确地代表柱效能。而分离方程式表明分离度与理论塔板数的关系还受热力学性质的影响。当固定相确定，被分离物质对的确定后，分离度将取决于n。这时，对于一定理论板高的柱子，分离度的平方与柱长成正比，即：虽说用较长的柱可以提高分离度，但延长了分析时间。因此提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子，通过降低板高，以提高分离度。
21、第34页，共46页，编辑于2022年，星期二分离度与选择因子的关系分离度与选择因子的关系 n由基本色谱方程式判断，当=1时，R=0，这时，无论怎样提高柱效也无法使两组分分离。显然，大，选择性好。研究证明，的微小变化，就能引起分离度的显著变化。一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可有效增大值。第35页，共46页，编辑于2022年，星期二分离度与容量因子的关系分离度与容量因子的关系如果设：,则分离方程式写成第36页，共46页，编辑于2022年，星期二 当k1O时，随容量因子增大，分离度的增长是微乎其微的。一般取k为210最宜。对于GC，通过提高温度，可选择合适的k值，以改进分离度。而
22、对于LC，只要改变流动相的组成，就能有效地控制k值。它对LC的分离能起到立竿见影的效果（见下图）。第37页，共46页，编辑于2022年，星期二分离度与分析时间的关系分离度与分析时间的关系n下式表示了分析时间与分离度及其他因素的关系。从上式，设则可得：第38页，共46页，编辑于2022年，星期二由图中RQ或trQ对k的曲线可见，当k在25时，可在较短的分析时间，取得良好的分离度。第39页，共46页，编辑于2022年，星期二分离度应用示例n例1：有一根 lm长的柱子，分离组分1和2得到如图。图中横坐标l为记录笔走纸距离。若欲得到 R=1.2的分离度，有效塔板数应为多少？色谱往要加到多长？第40页，
23、共46页，编辑于2022年，星期二解：先求出组分2对组分1的相对保留值r2，1（即值）第41页，共46页，编辑于2022年，星期二求有效塔板数neffneff16（0.8）21.1/(1.1-1)21239若使R=1.2,所需塔板数可计算,即因此,欲使分离度达到1.2,需有效塔板数为2788块,则所需柱长为L=2788/13291m=2.25m第42页，共46页，编辑于2022年，星期二例例2 已知某色谱柱的理论塔板数为已知某色谱柱的理论塔板数为3600,组分组分A和和B在该柱上的保留时间在该柱上的保留时间为为27mm和和30mm,求两峰的峰半宽和分离度求两峰的峰半宽和分离度.解:w1/2=w
24、/1.7w1=27/(3600/16)1/2=1.8mm(w1)1/21.8/1.71.06mmw2=30/(3600/16)1/2=2.0mm(w2)1/22.0/1.71.18mmR2(30-27)/(1.8+2)6/3.81.6第43页，共46页，编辑于2022年，星期二例例3 已知一色谱柱在某温度下的速率方程的已知一色谱柱在某温度下的速率方程的A=0.08cm;B=0.65cm2/s;C=0.003s,求最佳线速度求最佳线速度u和最小塔板高和最小塔板高H.解:欲求 u最佳和H最小,要对速率方程微分,即 dH/dud(A+B/u+Cu)/du -B/u2+C0 而,最佳线速:u最佳(B/
25、C)1/2 最小板高:H最小A+2(BC)1/2 可得 u最佳(0.65/0.003)1/214.7cm/s H最小0.08+2(0.650.003)1/20.1683cm第44页，共46页，编辑于2022年，星期二例4已知物质A和B在一个30.0cm柱上的保留时间分别为16.40和17.63min.不被保留组分通过该柱的时间为1.30分钟.峰宽为1.11和1.21min,计算:(1)柱分辨本领;(2)柱的平均塔板数目;(3)塔板高度;(4)达到1.5分离度所需的柱长度;(5)在较长柱上把物质B洗脱所需要的时间.第45页，共46页，编辑于2022年，星期二 解解:(1)R=2(17.63-16.40)/(1.11+1.21)=1.06 (2)nA=(16.40/1.11)2=3493 nB=16(17.63/1.21)2=3397 nav=(3493+3397)/2=3445=3.44103 (3)H=L/n=30.0/3445=8.70810-3cm =8.7110-3cm (4)n2=34452.25/1.124=6.90103 源于源于(n1/n2=R1/R2)2 L=nH=6.901038.7110-3=60.1cm (5)tr2=tr1(R2/R1)2=17.631.52/1.062 =35.3min 第46页，共46页，编辑于2022年，星期二