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1、色谱技术第1页，共42页，编辑于2022年，星期二4/15/202311.3色谱的分类色谱的分类1.根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同机理不同的分类第2页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1522.2.根据固定相的形状不同的分类：根据固定相的形状不同的分类：第3页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1533 3 根据流动相的物态不同的分类根据流动相的物态不同的分类：液相色谱（LC）：LLC、LSC反相色谱：固定相极性小于流动相4 4 根据流动相与固定相的极性分类根据流动相与固定相的极性分类 ：正相色谱：固定相极性大于流动相气相色谱（GC）：GLC、GSC第4页
2、，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1542.色谱分离的基本原理任何色谱分离过程实质任何色谱分离过程实质上都是上都是溶质随流动相流溶质随流动相流动而迁移的过程动而迁移的过程，不同不同溶质在流动相和固定相溶质在流动相和固定相中的分配比例不同，中的分配比例不同，因因而随流动相迁移的速度而随流动相迁移的速度不同，从而使不同物质不同，从而使不同物质分离开来。分离开来。第5页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1552.1色谱分离的基本原理vv（1 1）分配系数：）分配系数：溶质在固定相与流动相浓度比值溶质在固定相与流动相浓度比值可由Langmuir方程得出Kd d-分配系数
3、q、c-溶质在固相和液相中的浓度溶质在固相和液相中的浓度第6页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/156vv（2）阻滞因子）阻滞因子R Rf 定义：阻滞因子定义：阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0=0）的迁移率之比 意义：在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小：在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小第7页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1572.2色谱图及基本概念v（1）色谱图：混合液中各组分经色谱柱分离后，随流）色谱图：混合液中各组分经色谱柱
4、分离后，随流动相依次流出色谱柱进入监测器，监测器的响应信号动相依次流出色谱柱进入监测器，监测器的响应信号时间（或流动相体积）曲线，称为色谱图或色谱流时间（或流动相体积）曲线，称为色谱图或色谱流出曲线。出曲线。v（2）基线：在操作条件下，色谱柱出口没有组分流出，仅）基线：在操作条件下，色谱柱出口没有组分流出，仅有流动相流过监测器，此时流出的曲线。有流动相流过监测器，此时流出的曲线。v（3）色谱峰：当样品中的组分随流动相流入监测器时，）色谱峰：当样品中的组分随流动相流入监测器时，监测器的响应信号随时间变化所形成的峰形图形。监测器的响应信号随时间变化所形成的峰形图形。v（4）峰形：对称于峰尖的正态分
5、布曲线。）峰形：对称于峰尖的正态分布曲线。v拖尾峰、前伸峰拖尾峰、前伸峰第8页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/158洗脱曲线返回返回第9页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/159vv（5 5）洗脱体积）洗脱体积vv色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积vv不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异第10页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1510（6）保留值保留值vv保留值：保留值：保留值：保留值：混合物中各组分在色谱柱中混合物中各组分在色谱柱中混合物中各组分在色谱柱中混合物中各组分在色谱柱中停留的时间或停留的时间
6、或停留的时间或停留的时间或将组分带出色谱将组分带出色谱将组分带出色谱将组分带出色谱柱所需柱所需柱所需柱所需流动相体积的流动相体积的流动相体积的流动相体积的数值数值数值数值vv保留时间保留时间保留时间保留时间（t t t tR R R R）：从）：从）：从）：从开始进样开始进样开始进样开始进样至柱至柱至柱至柱出口处出口处出口处出口处被测组分出现被测组分出现被测组分出现被测组分出现浓度最大值浓度最大值浓度最大值浓度最大值所需要的时间。所需要的时间。所需要的时间。所需要的时间。vv死时间死时间死时间死时间（t t t t0 0 0 0）：不被固定相滞留的组分（空气等），从开始进样至出）：不被固定相滞
7、留的组分（空气等），从开始进样至出）：不被固定相滞留的组分（空气等），从开始进样至出）：不被固定相滞留的组分（空气等），从开始进样至出口处被测组分出现浓度最大值所需要的时间。口处被测组分出现浓度最大值所需要的时间。口处被测组分出现浓度最大值所需要的时间。口处被测组分出现浓度最大值所需要的时间。vv校正保留时间校正保留时间校正保留时间校正保留时间（t t t tR R R R）：扣除死时间后的保留时间。：扣除死时间后的保留时间。：扣除死时间后的保留时间。：扣除死时间后的保留时间。（t t t tR R R R t t t tR R R R-t t t t0 0 0 0）vv保留体积（保留体积（保
8、留体积（保留体积（V V V VR R R R）、死体积（、死体积（、死体积（、死体积（V V V V0 0 0 0）、校正保留体积（、校正保留体积（、校正保留体积（、校正保留体积（V V V VR R R R）vv相对保留值（相对保留值（相对保留值（相对保留值（r r r r2 2 2 2，1 1 1 1）：在相同操作条件下，待测组分与参比在相同操作条件下，待测组分与参比在相同操作条件下，待测组分与参比在相同操作条件下，待测组分与参比组分的校正保留值之比。组分的校正保留值之比。组分的校正保留值之比。组分的校正保留值之比。第11页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1511 (7
9、)(7)分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两组色谱峰峰底分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两组色谱峰峰底宽度平均值之比。宽度平均值之比。峰宽（峰宽（W W）：两侧拐点处所作的切线与峰底相交于两点，）：两侧拐点处所作的切线与峰底相交于两点，此两点此两点的距离。的距离。（见图见图）半高峰宽（半高峰宽（W W1/21/2)：1/21/2峰高处的峰宽。峰高处的峰宽。峰高：峰顶点与峰底的垂直距离。峰高：峰顶点与峰底的垂直距离。峰面积：峰与峰底之间的面积。峰面积：峰与峰底之间的面积。标准偏差（标准偏差（）：）：0.607h0.607h峰高处的峰宽的峰高处的峰宽的1/21/2区域宽度（峰宽、半高峰宽、标准偏差）
10、区域宽度（峰宽、半高峰宽、标准偏差）W=4 W=4 R1完全分离第12页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1512vv（8 8）色谱柱的理论塔板：流动相与固定相平均浓度达流动相与固定相平均浓度达传质平衡时的一段柱高传质平衡时的一段柱高（塔板高度）塔板高度）塔板高度）塔板高度）vv反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系高之间的关系vv理论塔板数的计算方法：理论塔板数的计算方法：理论塔板数的计算方法：理论塔板数的计算方法：vvN-N-N-N-理论塔板数理论塔板数 t t t tR R R R-保留时间保留时间vvW
11、W1/21/21/21/2-半峰宽半峰宽半峰宽半峰宽 Wb-Wb-Wb-Wb-峰底宽度峰底宽度峰底宽度峰底宽度vv理论塔板高度：理论塔板高度：H L-H L-H L-H L-柱长柱长柱长柱长第13页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/15133.色谱系统的基本组成色谱系统的基本组成第14页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1514 Pharmacia KTA Pharmacia KTA 层析系统层析系统 第15页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1515v调糊调糊v预装一定量的溶剂或缓冲液预装一定量的溶剂或缓冲液v连续加入悬胶液连续加入悬胶液v打开
12、出口阀：层析剂沉降打开出口阀：层析剂沉降v排除空气排除空气v检查均匀度检查均匀度4.4.色谱分离操作色谱分离操作（1）装柱与平衡）装柱与平衡第16页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1516（2）上样（吸附）v样品处理：样品处理：v(1(1）溶解）溶解vA.A.调整浓度调整浓度vB.B.盐盐vC.pH C.pH v(2)(2)过滤：除去不溶物过滤：除去不溶物v流速：流速：根据样品浓度与吸附速度而定根据样品浓度与吸附速度而定v上样量：上样量：80%80%吸附容量吸附容量第17页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1517（3）淋洗v盐浓度盐浓度vpH pH v表面活
13、性剂（表面活性剂（0.1-0.5%)0.1-0.5%)v淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定v防止产物丢失又要除去杂质防止产物丢失又要除去杂质第18页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1518（4）洗脱方法v按操作方式按操作方式va a 恒定洗脱恒定洗脱(isocratic elution)(isocratic elution)vb b 分步洗脱分步洗脱(stage elution)(stage elution)vc c 梯度洗脱梯度洗脱(gradient elution)(gradient elution)按洗脱机理按洗脱机理专一性洗脱（专一性
14、洗脱（specific elutionspecific elution）非专一性洗脱（非专一性洗脱（nonspecific elutionnonspecific elution）添加剂：乙二醇添加剂：乙二醇,NaCNS,NaCNS、脲素、盐酸胍、脲素、盐酸胍 洗脱体积：洗脱体积：5 5倍床体积倍床体积第19页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1519（5）清洗与再生v弱酸：弱酸：HAcHAcv碱：氨水碱：氨水v促溶剂：促溶剂：1-3M KCNS1-3M KCNS，6-8 M 6-8 M 尿素，尿素，6 M6 M盐酸胍盐酸胍v极性溶剂：极性溶剂：20%20%乙醇乙醇v表面活性剂：
15、吐温表面活性剂：吐温-80-80v缓冲液平衡缓冲液平衡第20页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1520v离子交换色谱离子交换色谱v凝胶过滤凝胶过滤v吸附色谱吸附色谱v亲和色谱亲和色谱v分配色谱分配色谱v疏水作用层析疏水作用层析5 各种色谱技术介绍第21页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1521（1 1）离子交换色谱）离子交换色谱vv原理：以离子交换树脂作为固定相，选择合原理：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的缓冲液为流动相，使溶质按照其离子交适的缓冲液为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法。换亲合力的不同而得到分离的方法。第22页，共4
16、2页，编辑于2022年，星期二2023/4/1522常用的离子交换剂常用的离子交换剂vv葡聚糖凝胶型葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25DEAE-Sephadex A-25DEAE-Sephadex A-25DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25QAE-Sephadex A-25QAE-Sephadex A-25QAE-Sephadex A-25，CM-CM-CM-CM-Sephadex C-25Sephadex C-25Sephadex C-25Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25SP-Sephadex C-25SP-S
17、ephadex C-25SP-Sephadex C-25vv纤维素系列离子交换剂纤维素系列离子交换剂vv琼脂糖系列离子交换剂琼脂糖系列离子交换剂琼脂糖系列离子交换剂琼脂糖系列离子交换剂 SepharoseSepharoseSepharoseSepharose系列系列 Sepharose CL-6BSepharose CL-6B Bio-Gel A Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂系列交联琼脂糖离子交换剂vv大孔性离子交换剂大孔性离子交换剂 第23页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1523离子交换柱层析操作离子交换柱层析操作v树脂的选择树脂的选择v树脂的预处理及转型
18、树脂的预处理及转型v装柱及平衡装柱及平衡（要保持均匀、无气泡和断层）（要保持均匀、无气泡和断层）首先加入首先加入1/3h的起始缓冲液或水；其次加入树脂使树脂借助的起始缓冲液或水；其次加入树脂使树脂借助水的浮力缓慢自然沉降；最后用水或缓冲液平衡到所需要的条件，水的浮力缓慢自然沉降；最后用水或缓冲液平衡到所需要的条件，如特定如特定pH、离子强度等。、离子强度等。上样上样：将溶解在少量溶剂中的试样加到柱上部：将溶解在少量溶剂中的试样加到柱上部 洗涤与洗脱：洗涤与洗脱：改变改变pH或离子强度或离子强度 收集与检测收集与检测第24页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1524怛定洗脱怛定洗
19、脱 第25页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1525分步洗脱分步洗脱 第26页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1526(c)(c)梯度洗脱梯度洗脱第27页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1527（2）凝胶过滤）凝胶过滤原理：原理：凝胶过滤所用的基质具有凝胶过滤所用的基质具有立体网状结构立体网状结构，筛孔直径一筛孔直径一致，且呈珠致，且呈珠装颗粒物质，这种物质装颗粒物质，这种物质可以完全或部分排阻可以完全或部分排阻某某些大分子化合物于筛孔之外，而不能排阻某些小分子化些大分子化合物于筛孔之外，而不能排阻某些小分子化合物，但可让其在筛孔中自由扩散
20、和渗透。因此，混合合物，但可让其在筛孔中自由扩散和渗透。因此，混合物分子大小不同，通过介质所需阻力不同，从而被分离。物分子大小不同，通过介质所需阻力不同，从而被分离。流出顺序：流出顺序：大分子大分子中等分子中等分子小分子小分子第28页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1528第29页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1529vv在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离同，
21、使不同相对分子量的组分得以分离同，使不同相对分子量的组分得以分离同，使不同相对分子量的组分得以分离vv优点：优点：操作简便操作简便分离效果好，重复性高，回收率高分离效果好，重复性高，回收率高分离条件温和，不会使物质变性分离条件温和，不会使物质变性分离条件温和，不会使物质变性分离条件温和，不会使物质变性凝胶不用再生，可反复使用凝胶不用再生，可反复使用凝胶不用再生，可反复使用凝胶不用再生，可反复使用vv缺点：缺点：分离速度较慢、选择性低（仅分子量大小）、料液分离速度较慢、选择性低（仅分子量大小）、料液分离速度较慢、选择性低（仅分子量大小）、料液分离速度较慢、选择性低（仅分子量大小）、料液处理量少处
22、理量少处理量少处理量少第30页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1530v分配系数分配系数va.a.公式公式vb.b.大小排阻程度（大小排阻程度（0 0100%)100%)vVt(Vt(床体积）床体积）rr2 2h h 外水体积（外水体积（V V0 0）+内水体积（内水体积（V Vi i）+颗粒实际占有体积颗粒实际占有体积(Vg)(Vg)(i)(i)完全排阻组分完全排阻组分 KavKav0 Ve0 VeV0V0（iiii）部分排阻组分）部分排阻组分 KavKav（0-10-1）（iiiiii）完全进入胶孔组分）完全进入胶孔组分 KavKav1 Ve1 VeVtVt第31页，共4
23、2页，编辑于2022年，星期二2023/4/1531凝胶过滤介质凝胶过滤介质v葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（sephadexsephadex）由葡聚糖由葡聚糖+环氧氯丙烷交联而成环氧氯丙烷交联而成 sephadex G 10 15 25 50 75 100 200sephadex G 10 15 25 50 75 100 200v琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（SepharoseSepharose）天然凝胶）天然凝胶 Sepharose 2B 4BSepharose 2B 4Bv聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（BioBioGelGel）BioBioGel p2 p4 p100Gel p2 p4 p100等（
24、编号等（编号100100为排阻现）为排阻现）疏水性凝胶疏水性凝胶应用：分离、浓缩；脱盐；测定分子量应用：分离、浓缩；脱盐；测定分子量第32页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1532（3）吸附色谱vv原理原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实的差异而实现分离。（吸附解吸再吸附连续过程）现分离。（吸附解吸再吸附连续过程）vv分类：柱色谱和薄层色谱分类：柱色谱和薄层色谱vv分配系数（分配
25、系数（分配系数（分配系数（K K K K）与迁移率（）与迁移率（）与迁移率（）与迁移率（RfRfRfRf）关系）关系）关系）关系 K K K K大，大，RfRf小小小小 K K K K小，小，RfRf大大大大第33页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1533柱色谱的操作柱色谱的操作吸附剂的选择吸附剂的选择v（1 1）依据）依据a.a.比表面积大比表面积大b.b.颗粒均匀颗粒均匀c.c.稳定性强稳定性强d.d.成本低成本低e.e.分辨率高（对不同的物质有不同的解吸能力）分辨率高（对不同的物质有不同的解吸能力）如：极性吸附剂易吸附极性化合物；但便于解吸，极性化合如：极性吸附剂易吸附
26、极性化合物；但便于解吸，极性化合物，应选择极性较小的吸附剂物，应选择极性较小的吸附剂第34页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1534vv（2 2 2 2）吸附剂）吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH-OH-OH-OH和和和和-NH2-NH2vv色谱柱的选择色谱柱的选择色谱柱的选择色谱柱的选择a.a.a.a.平直、均匀；平直、均匀；D D：L L L L1 1：1010101040404040；砂芯或玻璃棉；砂芯或玻璃棉b.b.b.b.分辨率低
27、，选长柱；分辨率低，选长柱；D D大，大，大，大，L L大大第35页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1535v柱色谱的操作柱色谱的操作洗脱剂的选择洗脱剂的选择（1 1）原则）原则 纯度高、稳定性好、对样品溶解度大，易与其它组分分纯度高、稳定性好、对样品溶解度大，易与其它组分分纯度高、稳定性好、对样品溶解度大，易与其它组分分纯度高、稳定性好、对样品溶解度大，易与其它组分分开开开开（2 2）常用）常用硅胶、硅胶、氧化铝氧化铝：洗脱剂：洗脱剂 极性小极性小极性大极性大极性大极性大活性炭或非极性大孔树脂：洗脱剂极性活性炭或非极性大孔树脂：洗脱剂极性大大极性极性小小羟基磷灰石（吸附蛋白
28、质）：盐缓冲液洗脱羟基磷灰石（吸附蛋白质）：盐缓冲液洗脱第36页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1536薄层吸附色谱展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果的分离的效果展开剂选择的原则：展开剂选择的原则：展开剂选择的原则：展开剂选择的原则：（1 1 1 1）对被分离组分应具有一定的）对被分离组分应具有一定的）对被分离组分应具有一定的）对被分离组
29、分应具有一定的解吸附解吸附解吸附解吸附能力，极性应比被能力，极性应比被分离物质的极性略小分离物质的极性略小（2 2）展开剂应对被分离物质具有一定的）展开剂应对被分离物质具有一定的）展开剂应对被分离物质具有一定的）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力溶解能力溶解能力溶解能力第37页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1537薄层吸附色谱（操作）v制板制板：硅胶：硅胶G G板，硅胶板，硅胶CMCCMC板板v点样点样：少量多次、：少量多次、D D3mm、边、边 1.52cmv展开展开：密闭容器、提前配好展开剂；溶剂不能浸没样品点；：密闭容器、提前配好展开剂；溶剂不能浸没样品点；展完后
30、划前沿及样品移动距离展完后划前沿及样品移动距离v检测检测：紫外线照射；喷雾显色；碘蒸汽等：紫外线照射；喷雾显色；碘蒸汽等第38页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1538（4）分配色谱）分配色谱vv原理：固定相为因吸附等作用而滞留于固体原理：固定相为因吸附等作用而滞留于固体载体表面的一薄层液体，利用溶质在固定相载体表面的一薄层液体，利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法和流动相之间的分配系数不同而分离的方法vv要素：固定相、载体、流动相要素：固定相、载体、流动相第39页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1539vv载体：通常为惰性材料，能吸附固定
31、相液体载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体vv载体种类：载体种类：硅胶硅胶:含水量大于含水量大于17或以水为展开剂时，硅胶或以水为展开剂时，硅胶失去了直接吸附溶质的能力，在硅胶表面附着的失去了直接吸附溶质的能力，在硅胶表面附着的水作为固定相，因而为分配色谱水作为固定相，因而为分配色谱硅藻土硅藻土纤维素纤维素葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶第40页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1540（5）亲和色谱 利用高分子化合物可以和与它们相对应的配基，利用高分子化合物可以和与它们相对应的配基，进行特异并可逆结合的特点来进行分离的，进行特异并可逆结合的特点来进行分离的，把相应的一对配基中的一个通过物理吸附或把相应的一对配基中的一个通过物理吸附或化学共价键作用，固定在载体上使它变成固化学共价键作用，固定在载体上使它变成固相，装在层析柱中来提纯其相对应的配基。相，装在层析柱中来提纯其相对应的配基。第41页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1541（6）正相/反相层析(6.1)根据极性a.正相色谱:流动相极性固定相极性b.反相色谱:流动相极性固定相极性(6.2)洗脱顺序a.正相色谱:极性小极性大的化合物b.反相色谱：极性大极性小的化合物第42页，共42页，编辑于2022年，星期二2023/4/1542