现代色谱幻灯片.ppt

《现代色谱幻灯片.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《现代色谱幻灯片.ppt（95页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。

1、现代色谱第1页，共95页，编辑于2022年，星期一HPLC仪器结构示意图仪器结构示意图贮液器输液泵梯度装置进样装置分离柱控温装置检测器第2页，共95页，编辑于2022年，星期一 首首先先高高压压泵泵将将贮贮液液器器中中流流动动相相溶溶剂剂经经过过进进样样器器送送入入色色谱谱柱柱，然然后后从从控控制制器器的的出出口口流流出出。当当注注入入欲欲分分离离的的样样品品时时，流流经经进进样样器器贮贮液液器器的的流流动动相相将将样样品品同同时时带带入入色色谱谱柱柱进进行行分分离离，然然后后依依先先后后顺顺序序进进入入检检测测器器，记记录录仪仪将将检检测测器器送送出出的的信信号号记记录录下下来来，由由此此得

2、得到到液液相相色谱图。色谱图。工作过程：工作过程：第3页，共95页，编辑于2022年，星期一一一.流程流程第4页，共95页，编辑于2022年，星期一（一）输液系统（一）输液系统1.1.溶剂贮存器溶剂贮存器溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为氟塑料制成，容量为1到到2L，用来贮存足，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。够数量、符合要求的流动相。二二.主要部件主要部件第5页，共95页，编辑于2022年，星期一主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（8万万46万万55万万74万万102万万第16页，共95页，编辑于

3、2022年，星期一2、色谱柱的使用和维护、色谱柱的使用和维护 良好的色谱实验习惯：拿到一根新色谱柱时，先测柱效保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件定期检测柱效定期检测仪器的谱带展宽 色谱柱的使用及操作：流动相的转换流速(压力)的变化幅度温度的变化幅度专用色谱柱样品及溶剂的要求第17页，共95页，编辑于2022年，星期一 色谱柱的保养（一）样品方面样品方面除去微粒及杂质了解样品在流动相中的溶解度如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用 色谱柱的保养（二）流动相方面流动相方面除去微粒纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含

4、量要低缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液（盐）的浓度溶剂：色谱纯，并与填料相匹配溶剂中的杂质含量流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例第18页，共95页，编辑于2022年，星期一 在线的保护装置 给色谱柱提供物理的保护除去样品及流动相中的颗粒除去样品及流动相中的颗粒 给色谱柱提供化学的保护防止分析柱被化学污染防止分析柱被化学污染 装置在线过滤器在线过滤器预装保护柱预装保护柱在线过滤器In-LineFilter防止颗粒在色谱柱头累积优点：基本不影响柱效在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析）保护柱 可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时。保护柱的种类：1、预

5、装保护柱 有各种填料的预装柱供选择，使用方便。填料容积较小，也引起柱效降低。第19页，共95页，编辑于2022年，星期一可换芯式保护柱第20页，共95页，编辑于2022年，星期一色谱柱的清洗对所做的样品要有充分的了解对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗硅胶柱的一般方法硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质先用甲醇洗去极性杂质用干燥的二氯甲烷、正庚烷用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化依次活化键合相柱键合相柱(烷基烷基)的一般方法的一般方法20倍柱体积的：甲醇倍柱体积的：甲醇:水水甲醇甲醇氯仿氯仿甲醇甲醇:水水依次冲洗依次冲洗第

6、21页，共95页，编辑于2022年，星期一色谱柱的存放存放前的处理存放前的处理除去杂质、盐除去杂质、盐合适的存放溶剂合适的存放溶剂避免色谱柱床的干枯避免色谱柱床的干枯避免机械震动避免机械震动防止细菌生长防止细菌生长注意存放的温度注意存放的温度第22页，共95页，编辑于2022年，星期一色谱柱常见毛病柱压过高柱压过高多少才算高多少才算高?不同色谱柱有差异不同色谱柱有差异不同系统有差异不同系统有差异不同溶剂有差异不同溶剂有差异柱效低柱效低重复性差重复性差不出峰，回收率低不出峰，回收率低第23页，共95页，编辑于2022年，星期一柱压过高为什么柱压会过高为什么柱压会过高微粒堵塞微粒堵塞样品样品流动相

7、流动相密封垫密封垫柱床膨胀柱床膨胀不可逆吸附不可逆吸附细菌生长细菌生长第24页，共95页，编辑于2022年，星期一柱效低为什么柱效低为什么柱效低?色谱柱被污染色谱柱被污染过滤片部分堵塞过滤片部分堵塞样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞色谱柱内的死体积色谱柱内的死体积流动相流动相pH值及组成不合适造成固定相流失值及组成不合适造成固定相流失流速急剧变化造成固定相物理损坏流速急剧变化造成固定相物理损坏机械震动造成固定相产生裂缝机械震动造成固定相产生裂缝柱床收缩或干枯柱床收缩或干枯第25页，共95页，编辑于2022年，星期一重复性差、回收率低实验的重复性差实

8、验的重复性差色谱柱被污染色谱柱被污染流动相流动相pH值及组成不合适造成键合相流失值及组成不合适造成键合相流失样品溶剂不同或样品本身不稳定样品溶剂不同或样品本身不稳定回收率低，不出峰回收率低，不出峰“不可逆不可逆”吸附吸附固定相过强或流动相过弱固定相过强或流动相过弱非特异性吸附非特异性吸附第26页，共95页，编辑于2022年，星期一色谱柱以外的因素（一）“柱效柱效”问题，不一定是色谱柱问题问题，不一定是色谱柱问题！仪器问题：连接不好造成死体积仪器问题：连接不好造成死体积进样器进样器检测器检测器管路，连接口管路，连接口保护柱保护柱在线过滤器堵塞在线过滤器堵塞流动相问题：色谱柱未平衡好流动相问题：色

9、谱柱未平衡好进样量太大进样量太大第27页，共95页，编辑于2022年，星期一色谱柱以外的因素（二）柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！系统反压问题系统反压问题阻尼器堵塞阻尼器堵塞进样器堵塞进样器堵塞管路或连接口堵塞管路或连接口堵塞在线过滤器不干净在线过滤器不干净保护柱保护柱压力传感器不准确压力传感器不准确流速是否错误流速是否错误?第28页，共95页，编辑于2022年，星期一色谱柱以外的因素（三）实验的重复性差实验的重复性差梯度实验时平衡时间不足梯度实验时平衡时间不足温度波动温度波动流动相组成改变流动相组成改变样品溶剂不同样品溶剂不同样品稳定性不好样品稳定性不好方

10、法的开发不好方法的开发不好缓冲液的缓冲液的pH值不合适值不合适缓冲液的缓冲能力不足缓冲液的缓冲能力不足#82.补充内容补充内容.柱切柱切换技术换技术columnswitching第29页，共95页，编辑于2022年，星期一灵敏度高灵敏度高噪音低噪音低重现性好重现性好线性范围宽线性范围宽适用范围广适用范围广容易使用及保养容易使用及保养各种检测器性能价格比较见书各种检测器性能价格比较见书P255P255表表4-164-16（三）（三）检测系统检测系统 浓度型浓度型 质量型质量型 专属型专属型 （紫外（紫外 荧光）荧光）通用型通用型 （示差（示差 折光）折光）对检测器的要求对检测器的要求第30页，共

11、95页，编辑于2022年，星期一衡量检测器的指标灵敏度灵敏度 S=R/Q S=R/QRR是检测器响应值的增量是检测器响应值的增量QQ是样品量的增量是样品量的增量噪音噪音 没有样品时检测器的最大输出信号没有样品时检测器的最大输出信号漂移漂移 检测器在一段时间内响应值的变化检测器在一段时间内响应值的变化最小检测限最小检测限样品产生两或三倍于噪音信号时的浓度样品产生两或三倍于噪音信号时的浓度第31页，共95页，编辑于2022年，星期一（1）紫外检测器紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：特点：灵敏度高；灵敏度高；线线范围宽；线线范围宽；流通池可做的很

12、小（流通池可做的很小（1mm10mm，容积容积8L）；）；对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。检测后不破坏样品，可用于制备，并能与任何检测器串联使用第32页，共95页，编辑于2022年，星期一紫外吸收检测器：常用氘灯作光源，并安装一个光栅型单色器，两个流通池，一个作参比，一个作测量用，当组分进入测量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管接受到的辐射强度不等，这时有信号输出，输出信号大小与组分浓度有关。局限性：具有紫外吸收的溶剂不能做流动相，紫外吸收检测器的测定波长不能小于溶剂的截止波长P256表4-

13、18第33页，共95页，编辑于2022年，星期一(2)(2)光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第34页，共95页，编辑于2022年，星期一第35页，共95页，编辑于2022年，星期一光电二极管矩阵检测器示意图第36页，共95页，编辑于2022年，星期一第37页，共95页，编辑于2022年，星期一光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器第38页，共95页，编辑于2022年，星期一（3）荧光检测器荧光检测器P262（fluorescence detector）高高灵灵敏敏度

14、度:最最小小检检测测浓浓度度可可达达0.1ngml高选择性；高选择性；对对多多环环芳芳烃烃，维维生生素素B、黄黄曲曲霉霉素素、卟卟啉啉类类化化合合物物、农农药药、药药物物、氨氨基基酸酸、甾甾类类化化合合物物等等有有响响应；应；激光诱导荧光检测器具有很高的灵敏度，在痕量和超痕量分析中得激光诱导荧光检测器具有很高的灵敏度，在痕量和超痕量分析中得到广泛应用。到广泛应用。第39页，共95页，编辑于2022年，星期一荧光检测器第40页，共95页，编辑于2022年，星期一（4）示差折光检测器示差折光检测器P271（differential refractive index detector）除紫外检测器之

15、外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；第41页，共95页，编辑于2022年，星期一任意一束光由一种介质射入另一种介质时由于两种介质的折射率任意一束光由一种介质射入另一种介质时由于两种介质的折射率不同而发生折射现象。不同而发生折射现象。原理：原理：通过连续测定色谱柱流出液折射率的变化而对样品浓度进通过连续测定色谱柱流出液折射率的变化而对样品浓度进行检测。行检测。R=ZCi（nino）示差检测器的注意事项示差检测器的注意事项不能做梯度实验不能做梯度实验最大的池耐压

16、是最大的池耐压是 100 psi100 psi流速范围是流速范围是 0.3-10 ml/min0.3-10 ml/min.第42页，共95页，编辑于2022年，星期一（5）电化学检测器P268极谱库仑 以测量电解电流为基础安培电导 离子检测，以测量液体的电阻变化为根据电化学检测器的优点是：电化学检测器的优点是：灵敏度高，最小检测量般为灵敏度高，最小检测量般为ng级；级；选择性好，可测定大量非电活性物质中极痕量的电活性物质；选择性好，可测定大量非电活性物质中极痕量的电活性物质；线性范围宽，一般为线性范围宽，一般为45个数量级；个数量级；设备简单，成本较低；设备简单，成本较低；易于自动操作。易于自

17、动操作。第43页，共95页，编辑于2022年，星期一电导检测器Conductivity Detector第44页，共95页，编辑于2022年，星期一安培检测器P268工作原理 在电极间施加一恒定电位，活性组分在电极表面发生氧化还原反应（电极反应）电量Q的大小符合法拉第定律。组成（见书P269图4-79)参比电极：工作电极：辅助电极：碳或不锈钢材料作用：消除电化学反应的电流，维持 参比电极和工作电极 间恒定电位第45页，共95页，编辑于2022年，星期一使用注意问题1、流动相必须能导电 加支持电解质2、流速、温度、pH需十分稳定3、连续不断除气4、外加电压选择适当5、经常清洗第46页，共95页，

18、编辑于2022年，星期一（6）蒸发光检测器）蒸发光检测器P263HPLC-ELSD测定抗生素含量的方法被收入2005版中国药典 ELSD可以对所有挥发性低于流动相的物质作出准确检测，而与被检测物质的化学基团关系不大，物理性质类似的物质响应一致，响应值与样品的质量成正比。ELSD作为一种新型检测器，其理论知识和实践应用仍在不断发展中。第47页，共95页，编辑于2022年，星期一蒸发光散射检测器工作原理蒸发光散射检测器工作原理 检测三步曲检测三步曲雾化雾化蒸发蒸发检测检测第48页，共95页，编辑于2022年，星期一检测三步曲示意图检测三步曲示意图第49页，共95页，编辑于2022年，星期一原理：原

19、理：柱后液柱后液雾化器雾化器产生微小液滴产生微小液滴加热漂移管加热漂移管除去流除去流动相动相样品组分进入检测室用强光或激光照射检测室样品组分进入检测室用强光或激光照射检测室用光用光电二极管检测散射光。电二极管检测散射光。I=kmbKb为与实验条件有关的因素为与实验条件有关的因素适用：适用：糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸等。糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸等。第50页，共95页，编辑于2022年，星期一1.2ELSD构造与操作模式构造与操作模式A型所有液滴进入漂移管及流动池型所有液滴进入漂移管及流动池(又称又称“无无气溶胶分流气溶胶分流NoAerosolSplitting”)B型部

20、分液滴分流排掉；只有一部分进入漂型部分液滴分流排掉；只有一部分进入漂移管及流动池移管及流动池(“气溶胶分流气溶胶分流AerosolSplitting”)第51页，共95页，编辑于2022年，星期一A型蒸发光散射检测器示意图型蒸发光散射检测器示意图第52页，共95页，编辑于2022年，星期一B型蒸发光散射检测器示意图型蒸发光散射检测器示意图第53页，共95页，编辑于2022年，星期一两种操作模式的应用区别两种操作模式的应用区别A型型操操作作模模式式通通常常使使用用比比较较高高的的操操作作温温度度，较较适适合合于于高高有有机机含含量量和和低低流流速速流流动动相相。A型型仪仪器器通常灵敏度更高一些。

21、通常灵敏度更高一些。B型型操操作作模模式式在在较较低低的的操操作作温温度度下下效效果果较较好好。在在使使用用高高含含水水、高高流流速速流流动动相相时时，B型型ELSD通通过分流可以得到相对稳定的基线。过分流可以得到相对稳定的基线。在实际应用中采用何种模式在实际应用中采用何种模式ELSD，取决于样，取决于样品的性质和实验目的。品的性质和实验目的。第54页，共95页，编辑于2022年，星期一ELSD的基本特点的基本特点l蒸发光散射检测器的检测结果是一个受多因素影响的综合结果。仪器设计、化合物性质、实验条件的选择（载气流速、漂移管温度、流动相组成.）第55页，共95页，编辑于2022年，星期一主要优

22、势主要优势1.可检测挥发性低于流动相的任何样品；可检测挥发性低于流动相的任何样品；2.流动相低温雾化和蒸发，对热不稳定和挥发性化合物亦可测定；流动相低温雾化和蒸发，对热不稳定和挥发性化合物亦可测定；3.具溶剂兼容性可用于梯度洗脱，无溶剂峰干扰；具溶剂兼容性可用于梯度洗脱，无溶剂峰干扰；4.辅助载气提高了检测灵敏度，保持检测池内的清洁，避免污染；辅助载气提高了检测灵敏度，保持检测池内的清洁，避免污染；5.可与任何可与任何HPLC系统连接。系统连接。缺点：缺点：1.灵敏度较低灵敏度较低2.流动相必须具挥发性，且不含缓冲盐类流动相必须具挥发性，且不含缓冲盐类第56页，共95页，编辑于2022年，星期

23、一HPLC-ELSDHPLC-ELSD应用实例应用实例硫酸阿米卡星质量标准的修订硫酸阿米卡星质量标准的修订硫酸西索米星与硫酸奈替米星含量测定方法硫酸西索米星与硫酸奈替米星含量测定方法研究研究 硫酸庆大霉素组分硫酸庆大霉素组分C C组分含量测定方法组分含量测定方法HPLC-ELSDHPLC-ELSD法分析小诺霉素及其有关物质法分析小诺霉素及其有关物质某未知氨基糖甙类抗生素（某未知氨基糖甙类抗生素（N1N1，N2N2）组分分）组分分析析 第57页，共95页，编辑于2022年，星期一硫酸阿米卡星质量标准的修订硫酸阿米卡星质量标准的修订中国药典2000年版采用微生物检定法测定阿米卡星的含量，而国外药典

24、已经开始采用HPLC法进行阿米卡星含量测定。由于氨基糖甙类抗生素无紫外吸收，因此BP和EuP采用衍生化方法，USP采用电化学检测器检测。第58页，共95页，编辑于2022年，星期一硫酸阿米卡星质量标准的修订硫酸阿米卡星质量标准的修订 浙江省药检所采用HPLC-ELSD增修订中国药典中硫酸阿米卡星含量测定及有关物质测定方法，进行了详细的方法学研究，建立了HPLC-ELSD法测定硫酸阿米卡星中阿米卡星及有关物质的方法（图5-1A，图5-1B），并采用该方法对多家企业及多批产品中阿米卡星与有关物质的含量进行了比较研究，实验结果意义十分显著。第59页，共95页，编辑于2022年，星期一硫酸阿米卡星质量

25、标准的修订硫酸阿米卡星质量标准的修订图5-1A 硫酸阿米卡星与卡那霉素的分离图谱（图中依次为硫酸根峰、卡那霉素A峰、阿米卡星峰和卡那霉素B峰）第60页，共95页，编辑于2022年，星期一硫酸阿米卡星质量标准的修订硫酸阿米卡星质量标准的修订图5-1B 硫酸阿米卡星与杂质K29的分离图谱（图中依次为硫酸根峰、阿米卡星峰和杂质K29峰）第61页，共95页，编辑于2022年，星期一硫酸阿米卡星质量标准的修订硫酸阿米卡星质量标准的修订色谱条件：Agilent1100高效液相色谱仪；Dikma Technologies SEDEX75 蒸发光散射检测器，漂移管温度50，载气压力3.5bar，检测器GAIN

26、值为4或7；以水-氨水-冰醋酸（96：3.6：0.4）（调节pH至10.0）为流动相，流速1.0 mL/min；Agilent ZORBAX Extend-C18（150mm4.6mm，5m）碱性色谱柱，柱温30。第62页，共95页，编辑于2022年，星期一硫酸西索米星与硫酸奈替米星含量硫酸西索米星与硫酸奈替米星含量测定方法研究测定方法研究 福建省药检所采用HPLC-ELSD对硫酸西索米星和硫酸奈替米星的含量测定方法进行了研究，建立了良好的色谱方法（图5-2，图5-3），并采用分段双对数转换线性方程，分别对硫酸西索米星和硫酸奈替米星的主成分以及有关物质进行了定量，取得了较好结果。第63页，共9

27、5页，编辑于2022年，星期一硫酸西索米星与硫酸奈替米星含量测定方硫酸西索米星与硫酸奈替米星含量测定方法研究法研究 图5-2 硫酸西索米星HPLC-ELSD色谱图 第64页，共95页，编辑于2022年，星期一硫酸西索米星与硫酸奈替米星含量测定方硫酸西索米星与硫酸奈替米星含量测定方法研究法研究图5-3 硫酸奈替米星HPLC-ELSD色谱图 第65页，共95页，编辑于2022年，星期一硫酸西索米星与硫酸奈替米星含量测定硫酸西索米星与硫酸奈替米星含量测定方法研究方法研究 色谱条件：以0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（90：10）为流动相，流速0.60 mL/min；检测器条件：Alltech 2000

28、，漂移管温度 110，载气流速2.6L/min；第66页，共95页，编辑于2022年，星期一20052005版药典附录版药典附录 V DV D20002000版对仪器的一般要求版对仪器的一般要求 “除另有规定外，检测器为紫外吸收检测器”20052005版对仪器的一般要求版对仪器的一般要求 “最常用的检测器为紫外检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。”第67页，共95页，编辑于2022年，星期一20052005版药典收载的抗生素品种版药典收载的抗生素品种品名品名位置位置项目项目流动相流动相参参考考ELSDE

29、LSD条条件件相关相关硫硫酸酸小小诺霉素诺霉素ChPIChPI-718-718鉴鉴别别、组组分分检检查查0.2M 0.2M TFA-TFA-M(94:6)M(94:6)T:110T:110C C F:2.8L/minF:2.8L/min口口服服液液、片片、注射液注射液硫硫酸酸卡卡拉霉素拉霉素ChPIChPI-724-724鉴鉴别别、卡卡拉拉B B检查、含测检查、含测0.2M 0.2M TFA-TFA-M(95:5)M(95:5)T:110T:110C C F:3L/minF:3L/min注注射射液液、滴滴眼眼液、注射用液、注射用硫硫酸酸庆庆大霉素大霉素ChPIChPI-730-730C C组分

30、检查组分检查0.2M 0.2M TFA-TFA-M(92:8)M(92:8)T:110T:110C C F:2.8L/minF:2.8L/min注射液注射液硫硫酸酸依依替米星替米星ChPIChPI-740-740鉴别、含测鉴别、含测0.2M 0.2M TFA-TFA-M(84:16)M(84:16)T:100T:100C C F:1.6L/minF:1.6L/min注注射射液液、注注射射用用第68页，共95页，编辑于2022年，星期一20052005版药典收载的中药品种版药典收载的中药品种品名品名位置位置项目项目流动相流动相黄芪黄芪ChPII-ChPII-212212含测（黄芪甲苷）含测（黄芪

31、甲苷）乙腈乙腈-水水(32:68)(32:68)炙黄芪炙黄芪ChPII-ChPII-213213同黄芪同黄芪同黄芪同黄芪银杏叶银杏叶ChPII-ChPII-220220含测（萜类内酯）含测（萜类内酯）银杏内酯银杏内酯A/B/CA/B/C、白果内酯白果内酯甲甲醇醇-四四氢氢呋呋喃喃-水水(25:10:65)(25:10:65)知母知母ChPII-ChPII-148148含测（菝含测（菝 皂苷元）皂苷元）甲醇甲醇-水水(95:5)(95:5)薏苡仁薏苡仁ChPII-ChPII-260260含含测测（甘甘油油三三油油酸酸酯）酯）乙乙 腈腈-二二 氯氯 甲甲 烷烷（65:3565:35）第69页，共9

32、5页，编辑于2022年，星期一应用小结应用小结与微生物检定法比较与微生物检定法比较 尽管HPLC-ELSD结果受多因素影响，通常实验结果不太理想，但与微生物检定法比较，其操作的简便性、定量结果的准确性，HPLC-ELSD法存在明显优势。而且，对多组分的分离分析，以及对药品中有关物质的检查，生物检定法无能为力。第70页，共95页，编辑于2022年，星期一应用小结应用小结与一般与一般HPLCHPLC方法比较方法比较 一般HPLC方法主要指紫外检测的HPLC。HPLC-ELSD方法的重现性、稳定性、精密度等等，目前还达不到HPLC-UVD水平。目前ELSD重点应用在UVD不适用的情况下，可以视为UV

33、D的有力补充。第71页，共95页，编辑于2022年，星期一ELSDELSD计算方案计算方案三点随行二次曲线是指以待测样品为中心，采取高、中、低三个浓度的对照品随行实验，以三个浓度对照品进样量与峰面积进行二次曲线拟和，得到随行二次曲线方程，即：（1）其中：为峰面积 为进样量 （当 时，三点成一条直线）再将供试品峰面积代入（1）式，计算供试品进样量，由于 均大于零，二次求解取正值 所以：（2）通过（2）式的计算结果可以得出供试品中的相对含量。第72页，共95页，编辑于2022年，星期一（7）.化学发光检测器化学发光检测器P266原理原理:是基于某些物质在常温下进行化学反应，生成处于激发态势是基于某

34、些物质在常温下进行化学反应，生成处于激发态势反应中间体或反应产物，当它们从激发态返回基态时，就发射出反应中间体或反应产物，当它们从激发态返回基态时，就发射出光子。光子。这种检测器不需要光源，也不需要复杂的光学系统，只要有这种检测器不需要光源，也不需要复杂的光学系统，只要有恒流泵，将化学发光试剂以一定的流速泵入混合器中，使之与柱恒流泵，将化学发光试剂以一定的流速泵入混合器中，使之与柱流出物迅速而又均匀地混合产生化学发光，通过光电倍增管将光流出物迅速而又均匀地混合产生化学发光，通过光电倍增管将光信号变成电信号，就可进行检测。这种检测器的最小检出量可达信号变成电信号，就可进行检测。这种检测器的最小检

35、出量可达10-12g。P267表表-20图图4-77第73页，共95页，编辑于2022年，星期一与检测器有关的故障及排除1、流动相的气泡、流动相的气泡2、流动池被污染、流动池被污染3、光源灯出故障、光源灯出故障4、倒峰、倒峰第74页，共95页，编辑于2022年，星期一（四）（四）.数据处理系统数据处理系统色谱工作站的功能色谱工作站的功能:色谱参数的选择和设定：色谱参数的选择和设定：自动化操作仪器；自动化操作仪器；色谱数据的采集和存储，并作色谱数据的采集和存储，并作“实时实时”处理；处理；对采集和存储的数据进行后处理；对采集和存储的数据进行后处理；自动打印，给出一套完整的色谱分析数据和图谱。同时

36、也可把一自动打印，给出一套完整的色谱分析数据和图谱。同时也可把一些常用色谱参数、操作程序，及各种定量计算方法存入存储器些常用色谱参数、操作程序，及各种定量计算方法存入存储器中，需用时调出直接使用。中，需用时调出直接使用。第75页，共95页，编辑于2022年，星期一（五）（五）.超高效液相色谱法超高效液相色谱法(UPLC)UPLC)P271 (ultraperformanceliquidchromatograph)2001年美国年美国UNC大学大学Groove教授教授,用用351.6MPa(51000psi)的超高压的超高压,进行分离进行分离分析的探索。随后分析的探索。随后21世纪初世纪初,Wa

37、ters公司公司推出了超高效液相色谱仪推出了超高效液相色谱仪(ACQUITY ACQUITY UPLCUPLC)主要由主要由超高压输液泵超高压输液泵、超高效液相超高效液相色谱柱、快速自动进样器、高速检测器及色谱柱、快速自动进样器、高速检测器及工作站等组成。工作站等组成。第76页，共95页，编辑于2022年，星期一UPLC与与HPLC比较比较UPLCHPLC色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱 柱长(cm)510常用2025 柱内径(cm)1.02.1常用4.6 固定相(m)常用1.7常用35 柱效(104/m)15 20 85输液泵输液泵输液泵输液泵 泵压(MPa)高达103高达40 流量(mL/min)

38、任意常用 1高速检测器高速检测器高速检测器高速检测器池体积(L)0.5 8分析时间分析时间分析时间分析时间 缩短一倍以上峰容量峰容量峰容量峰容量 增加一倍以上第77页，共95页，编辑于2022年，星期一UPLC与与HPLC分析的比较分析的比较 t/min 图 20-17 某样品的HPLC与UPLC分析对比 A.2.1mm100mm,5m Hybrid C18柱 B.2.1mm100mm,1.7m Hybrid C18柱A.HPLC B.UPLC第78页，共95页，编辑于2022年，星期一3.高分离快速液相色谱仪（高分离快速液相色谱仪（RRLC）Agilent近来推出的 1200系列高分离快速液

39、相色谱仪(RRLC),色谱柱用Agilent Zorbar 1.8m填料,5cm短柱,0.4min分离9个烷基酮个烷基酮的同系物,都达到基线分离,效果很好。第79页，共95页，编辑于2022年，星期一（七）仪器性能测试（七）仪器性能测试P272第80页，共95页，编辑于2022年，星期一 完第81页，共95页，编辑于2022年，星期一补充内容补充内容.柱切换技术柱切换技术columnswitching柱切换技术柱切换技术：是指能用阀来改变流动相走向及：是指能用阀来改变流动相走向及流动相组成，使洗脱液在特定时间内从预处流动相组成，使洗脱液在特定时间内从预处理柱切换到分析柱上的一种技术。理柱切换到

40、分析柱上的一种技术。常用在线预柱切换净化技术，其基本原理是首常用在线预柱切换净化技术，其基本原理是首先在预柱上实现生物体液样品中干扰大分子先在预柱上实现生物体液样品中干扰大分子与被测药物的分离，与被测药物的分离，然后用柱切换将待测药然后用柱切换将待测药物从预柱转移到分析柱上完成色谱分析。物从预柱转移到分析柱上完成色谱分析。这种将预处理柱和分析柱直接连接的方式称这种将预处理柱和分析柱直接连接的方式称“在线在线”连接。切换阀（六通阀或十通阀）的连接。切换阀（六通阀或十通阀）的驱动通常由电脑时间程序控制。驱动通常由电脑时间程序控制。第82页，共95页，编辑于2022年，星期一柱切换装置柱切换装置第8

41、3页，共95页，编辑于2022年，星期一柱切换（柱切换（columnswitching）技术在现代液相色谱的文献中亦被技术在现代液相色谱的文献中亦被称为顺序色谱（称为顺序色谱（sequentialchromatography），），多柱色谱（多柱色谱（multiplecolumnchromatography），），偶合柱色谱（偶合柱色谱（coupledcolumnchromatography），），分流色谱（分流色谱（splitchromatography）。）。此外，此外，多维色谱（多维色谱（multipledimentionalchromatography），），自动高效液相色谱（自动高效

42、液相色谱（automatedHPLC），），在线（在线（on-line）前处理等过程中都隐含使用了柱切换技术。前处理等过程中都隐含使用了柱切换技术。第84页，共95页，编辑于2022年，星期一使用柱切换的主要目的可概括为：使用柱切换的主要目的可概括为：（1）增加色谱的分辨率及选择性。）增加色谱的分辨率及选择性。（2）在线净化样品）在线净化样品，使前处理自动化；，使前处理自动化；（3）富集微量组分；）富集微量组分；（4）在一个色谱网络中达到多个分离目标；）在一个色谱网络中达到多个分离目标；（5）在线衍生化，提高检测灵敏度及衍生化重现性；）在线衍生化，提高检测灵敏度及衍生化重现性；第85页，共95

43、页，编辑于2022年，星期一如图所示是一典型如图所示是一典型的切换示意图，主的切换示意图，主要用于在线净化样要用于在线净化样品。品。111“正冲正冲”模式：将模式：将样品进入一级柱后，样品进入一级柱后，用二级流动相以同用二级流动相以同方向将一级柱上的方向将一级柱上的组分冲入二级柱。组分冲入二级柱。“反冲反冲”模式：二模式：二级流动相以反方向级流动相以反方向将组分冲入二级柱。将组分冲入二级柱。第86页，共95页，编辑于2022年，星期一图图 全二维液相色谱全二维液相色谱-质谱联用装置原理示意图质谱联用装置原理示意图 第87页，共95页，编辑于2022年，星期一图图 川芎甲醇提取液的二维分离色谱图

44、川芎甲醇提取液的二维分离色谱图第88页，共95页，编辑于2022年，星期一第89页，共95页，编辑于2022年，星期一柱切换高效液相色谱系统简介柱切换高效液相色谱系统简介柱切换高效液相色谱一般有三种系统：柱切换高效液相色谱一般有三种系统：（1 1）.双柱双泵系统双柱双泵系统（2 2）.三柱三泵系统三柱三泵系统（3 3）.复杂偶合系统复杂偶合系统第90页，共95页，编辑于2022年，星期一第91页，共95页，编辑于2022年，星期一柱切换技术近十多年来迅速发展，该技术已被广柱切换技术近十多年来迅速发展，该技术已被广泛应用于分析的各领域，如体内药物分析、制剂泛应用于分析的各领域，如体内药物分析、制

45、剂分析、农药残留监测分析、农药残留监测、食品检验、生化分析、环、食品检验、生化分析、环境样品分析等。其中在体内药物分析中的应用最境样品分析等。其中在体内药物分析中的应用最为广泛，所发表的有关文章最多。为广泛，所发表的有关文章最多。第92页，共95页，编辑于2022年，星期一典型应用：典型应用：（一）样品沉淀蛋白后进样（一）样品沉淀蛋白后进样（二）体液直接进样（在线去蛋白）（二）体液直接进样（在线去蛋白）（三）血或组织匀浆直接进样（三）血或组织匀浆直接进样（四）在线衍生化（四）在线衍生化（五）在线透析（五）在线透析第93页，共95页，编辑于2022年，星期一HPLC柱切换在临床药物分析中的应用柱

46、切换在临床药物分析中的应用样品的纯化与富集样品的纯化与富集利用柱切换技术进行生物样品纯化，首先在利用柱切换技术进行生物样品纯化，首先在柱柱1实现体液中干扰大分子与待测药物的分离，实现体液中干扰大分子与待测药物的分离，排除内源性物质的干扰，然后将药物从柱排除内源性物质的干扰，然后将药物从柱1转转移至柱移至柱2完成色谱分离，一般仅需样品离心、完成色谱分离，一般仅需样品离心、过滤、进样、切换阀等四个步骤。过滤、进样、切换阀等四个步骤。第94页，共95页，编辑于2022年，星期一样品除需要纯化之外，由于在生物体液中含样品除需要纯化之外，由于在生物体液中含量极低，痕量样品的富集也十分重要。柱切量极低，痕量样品的富集也十分重要。柱切换技术对样品的富集，是利用预柱将所测痕换技术对样品的富集，是利用预柱将所测痕量物质保留压缩在柱顶端的狭窄区域内，然量物质保留压缩在柱顶端的狭窄区域内，然后改变洗脱液强度使待测组分进入分析柱分后改变洗脱液强度使待测组分进入分析柱分离。通过优化流动相、选择适当的预柱填料，离。通过优化流动相、选择适当的预柱填料，避免色谱带扩散，达到富集的目的。避免色谱带扩散，达到富集的目的。#35.幻幻灯片灯片35第95页，共95页，编辑于2022年，星期一