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1、植物细胞培养技术植物细胞培养技术第1页，共32页，编辑于2022年，星期六植物细胞培养技术的概念植物细胞培养技术的概念 植物细胞培养：是指从植物体中获得 植物细胞，然后在一定的条件下培养，以获得所需的细胞或各种产物的技术过程。第2页，共32页，编辑于2022年，星期六植物细胞培养技术的理论基础 植物细胞的全能性：植物的每个细胞都包 含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。细胞分化：细胞在生长发育的过程中，在形态、结构、生理功能等方面发生某些特异性差异的过程。脱分化：在某些特定条件下，分化细胞的基因活动模式会发生可逆的变化，重新回到未分化状态，这个过程成为脱分化。第3页，共3
2、2页，编辑于2022年，星期六植物单细胞的获取一、从外植体直接分离细胞（一）、机械捣碎法 先将叶片等外植体轻轻捣碎，然后通过过滤和离心分离细胞。第4页，共32页，编辑于2022年，星期六 优点：1、获得的植物细胞没有经过酶 的作用，不会受伤害。2、不需要经过质壁分离，有利于进行生理生化研究。缺点：由于受到机械作用，细胞结构会受到一定的伤害，获得完整的细胞团或细胞数量少。第5页，共32页，编辑于2022年，星期六（二）、酶解法 利用果胶酶、纤维素酶等处理，分离出具有代谢活性的细胞。该法不仅能降解中胶层，还能软化细胞壁。所以，用该法分离细胞时，对细胞给予渗透压保护，如添加适量甘露醇。第6页，共32
3、页，编辑于2022年，星期六二、通过愈伤组织诱导获取植物细胞（一）、概念 愈伤组织：植物各种器官的外植体在离体的条件下，细胞经过脱分化等一系列过程，重新转化为未分化细胞，继而形成一种能快速增殖的无特定结构和功能的薄壁细胞团，称为愈伤组织。第7页，共32页，编辑于2022年，星期六（二）、影响愈伤组织诱导的因素1、要有合适的外植体。一般来说，外植体细胞分化程度越高，脱分化越困难，所需时间越长2、要有适宜的培养基和培养条件。植物激素的种类和浓度最为重要。3、光照和温度也影响愈伤组织的发生。4、NH4+/NO3-的浓度比对愈伤组织的诱导也有影响。浓度比为4:1时，诱导率最高。第8页，共32页，编辑于
4、2022年，星期六（三）、从愈伤组织分离得到植物细胞 诱导获得的愈伤组织可以用小刀或镊子分割得到植物小细胞团，也可以将愈伤组织转移到液体培养基中，加入杀菌的玻璃珠，振荡培养，使愈伤组织分散成小细胞团或单细胞，然后过滤，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。第9页，共32页，编辑于2022年，星期六三、通过原生质体获取植物细胞 原生质体：出去细胞壁后得到的微球体。（一）、原生质体的分离 1、机械法：使细胞发生质壁分离，然后切开细胞壁使原生质释放出来。特点：排除了外加酶对原生质体结构和代谢的不利影响，但产生的原生质体少，对于细胞质浓密、液泡小的分生组织不适用。第10页，共32页，编辑于2022年，
5、星期六 2、酶解法：将果胶酶和纤维素酶混合处理材料。特点：能在较短时间内获得大量原生质体，并能从分生组织获得原生质体，但是，酶可能对原生质体有毒害作用。3、影响因素：材料的种类与生理状况、酶的种类与浓度、酶解时间、渗透压稳定剂和质膜稳定剂等。第11页，共32页，编辑于2022年，星期六（二）、原生质体的纯化 供体体材料经酶处理后，除有完整的原生质体外还有未被消化的细胞、破碎的原生质体，叶绿体、线粒体等，可以用镍丝网除去较大碎屑，进一步纯化方法有下三种：1、沉降法：离心，使原生质体下沉，碎片留于上清液。2、漂浮法：根据密度不同，利用密度大的高渗溶液，离心后使原生质体漂浮其上，碎片等沉底。3、界面
6、法：采用两种不同密度的溶液，离心后使完整的原生质体处于两液相的界面。第12页，共32页，编辑于2022年，星期六（三）、原生质体再生形成植物细胞 原生质体分离后，经过技术和适当稀释，在一定条件下进行原生质体培养，使细胞壁再生，从而得到植物单细胞，单细胞培养，长成细胞团，再经过继代培养，形成由原生质体形成的细胞系。采用固体培养或者液体静止培养，形成植物细胞。第13页，共32页，编辑于2022年，星期六植物单细胞的培养方法（一）、看护培养法 1、概念；采用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单细胞，使单细胞持续分裂和增殖，而获得单细胞形成的细胞系的方法。第14页，共32页，编辑于2022年，星期六2、基
7、本过程：（1）、配制好宜于愈伤组织继代培养的固体培养基。（2）、将生长活跃的愈伤组织块植入固体培养基中间部位。（3）、愈伤组织上方放置一片面积为1平方厘米的滤纸，滤纸下方紧贴培养基和愈伤组织块。（4）、取一小滴经过稀释的单细胞悬浮液接种于滤纸上方。（5）、置于培养箱，在一定的温度和光照条件下培养若干天，单细胞在滤纸上进行持续分裂和增殖，形成细胞团（6）、将细胞团转移到新鲜的固体培养基中进行继代培养，获得由单细胞形成的细胞系。第15页，共32页，编辑于2022年，星期六（二）、微室培养法 1、概念；将接种有单细胞的少量培养基，置于微室中培养，使单细胞生长繁殖的方法。2、特点：使用培养基用量少，可
8、通过显微镜观察个体细胞的生长、分裂、分化、发育情况。利于对单细胞全过程进行跟踪。第16页，共32页，编辑于2022年，星期六（三）、单细胞培养法 1、概念：将单细胞接种于固体培养基，在培养皿中进行培养，使细胞生长繁殖，获得由单细胞形成的细胞系的培养方法。第17页，共32页，编辑于2022年，星期六2、基本过程（1）、单细胞悬浮液的密度调整（2）、固体培养基的配制（3）、接种单细胞（4）、培养（5）、继代培养第18页，共32页，编辑于2022年，星期六（四）、条件培养法 将单细胞接种于条件培养基中进行培养，使细胞生长繁殖，而获得有单细胞形成的细胞系的培养方法。第19页，共32页，编辑于2022年
9、，星期六植物单细胞培养的条件（一）、培养基。不同种类植物单细胞对营养成分的要求各不相同，要根据不同的要求配置培养培养基。（二）、细胞密度。单细胞培养要求接种的细胞有一定的密度。过低，不利于细胞生长繁殖，过高，则难得到单细胞系。（三）、植物生长激素。主要是生长素和分裂素。第20页，共32页，编辑于2022年，星期六（四）、温度。一般控制在25度左右，许可范围内适当提高温度可加快单细胞生长速度。（五）、PH。一般控制在5.26.0（六）、CO2含量。植物细胞培养系统中CO2含量对细胞生长繁殖有一定影响。第21页，共32页，编辑于2022年，星期六细胞悬浮培养细胞悬浮培养 （一）含义及特点（一）含义
10、及特点2 2、特点、特点 1 1）细胞可不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于）细胞可不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；大规模培养；2 2）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。的生长、分化创造方法和条件。1 1、含义：、含义：将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养进行的无菌培养第22页，共32页，编辑于2022年，星期六3、悬浮培养类型和方法、悬浮培养类型和方法成批培养成批培养连续培养连续培养第23页，共32页，编辑于2022年，星期六 （1）、成批培养）、成批培养/分
11、批培养分批培养 含义：含义：将愈伤组织培养在一定容积的密闭将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中进行培养。它是进行细胞生容器中进行培养。它是进行细胞生 长和细长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。第24页，共32页，编辑于2022年，星期六A、成批培养特点（1）培养基体积固定；（2）必须适当搅拌；（3）培养过程中，细胞生长，其数目不 断发生变化，呈S增长；（4）但要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移。第25页，共32页，编辑于2022年，星期六B、成批培养的方法(1)旋转培养旋转培养(2)往返震荡培养往返震荡培养(3)旋转震荡培养旋转震荡培养(
12、4)搅动培养搅动培养第26页，共32页，编辑于2022年，星期六（2）、连续培养）、连续培养含义：含义：指在培养过程中，以不断抽取悬浮培指在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。到养分补充，保持其恒定体积的培养。第27页，共32页，编辑于2022年，星期六A、连续培养的特点：（1）新鲜培养基的不断加入,保证了养分的充分供应；（2）可使细胞保持在增殖旺盛的对数生长期中；（3）适于大规模工业化生产第28页，共32页，编辑于2022年，星期六(1)(1)半连续培养半连续培养：每隔一定时间倒出一定量
13、的：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液(2)(2)连续培养连续培养：封闭式和开放式封闭式和开放式B、连续培养的种类：、连续培养的种类：Production of anthocyanin第29页，共32页，编辑于2022年，星期六（二）、细胞悬浮培养主要应用1 1、植物有用物质的生产植物有用物质的生产2 2、诱发和筛选突变体、诱发和筛选突变体3 3、原生质体培养和细胞分离、原生质体培养和细胞分离4 4、食品生产、食品生产。第30页，共32页，编辑于2022年，星期六植物细胞培养技术的应用（一）、在细胞转化方面的应用 1、药物的合成。手性药物、天然药物的合成以及现有药物的修饰改造。2、食品添加剂的合成。辣椒素、香兰素等的合成。（二）、在农业上的应用 1、植物种质的保存。2、人工种子的制备。3、植物的快速繁殖。第31页，共32页，编辑于2022年，星期六植物细胞培养技术的意义 与从植物中提取分离产物相比，植物组织培养生产天然产物具有以下显著优点：产率高、周期短、产品质量高、易于管理，减轻劳动强度。因此对于农业产品的工业化生产具有深远意义。第32页，共32页，编辑于2022年，星期六