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1、细胞培养细胞污染问题第1页，共21页，编辑于2022年，星期一简简 介介introductionintroduction凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染分和造成细胞不纯的异物都应视为污染细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性频率和后果的严重性第2页，共21页，编辑于2022年，星期一细胞污染的分类细胞污染的分类物理污染物理污染化学污染化学污染生物污染（支原体污染）生物污染（支原体污染）提提 纲纲outlineoutline控制污染控制污染掌握良好的无菌操作技
2、术掌握良好的无菌操作技术建立细胞库建立细胞库合理应用抗生素合理应用抗生素保持工作区清洁保持工作区清洁建立良好的规章制度建立良好的规章制度检测细胞污染检测细胞污染第3页，共21页，编辑于2022年，星期一温度温度孵箱放在温度较恒定的房间中孵箱放在温度较恒定的房间中培养液从冰箱取出后在室温放置培养液从冰箱取出后在室温放置放射线放射线试剂周围不能放同位素试剂周围不能放同位素振动振动孵箱周围不能放引起振动的设备孵箱周围不能放引起振动的设备辐射辐射试剂不要放在带有玻璃门的冰箱中试剂不要放在带有玻璃门的冰箱中物物 理理 污污 染染PhysicalPhysicalcontaminationcontamina
3、tion第4页，共21页，编辑于2022年，星期一化学污染化学污染血清血清培养液及试剂培养液及试剂水水培养用器皿培养用器皿孵箱孵箱化化 学学 污污 染染chemicalchemicalcontaminationcontamination第5页，共21页，编辑于2022年，星期一化化 学学 污污 染染chemicalchemicalcontaminationcontamination培养液及试剂培养液及试剂选用纯度最高的试剂选用纯度最高的试剂经过权威机构认定经过权威机构认定正确的储存方法正确的储存方法血清血清新购买的血清用之前要试新购买的血清用之前要试应选用同一批次的血清应选用同一批次的血清第6
4、页，共21页，编辑于2022年，星期一水水用来配液和清洗容器用来配液和清洗容器传统用双蒸和三蒸水传统用双蒸和三蒸水现在用纯水仪现在用纯水仪millipore超纯水放置过久纯度下降超纯水放置过久纯度下降化化 学学 污污 染染chemicalchemicalcontaminationcontamination第7页，共21页，编辑于2022年，星期一容器容器生产过程中有毒物质残留生产过程中有毒物质残留消毒剂和清洗剂的残留消毒剂和清洗剂的残留铝箔和包裹纸残留铝箔和包裹纸残留化化 学学 污污 染染chemicalchemicalcontaminationcontamination孵箱孵箱co2混有有毒
5、气体混有有毒气体消毒剂和清洗剂的残留消毒剂和清洗剂的残留第8页，共21页，编辑于2022年，星期一生生 物物 污污 染染biologicalbiologicalcontaminationcontamination生物污染生物污染容易发现的生物污染包括细菌、霉菌和酵容易发现的生物污染包括细菌、霉菌和酵母母不容易被发现的生物污染包括病毒、原不容易被发现的生物污染包括病毒、原虫、昆虫、支原体和其它细胞系虫、昆虫、支原体和其它细胞系第9页，共21页，编辑于2022年，星期一生生 物物 污污 染染biologicalbiologicalcontaminationcontamination对实验人员是一个
6、潜在的危险因素对实验人员是一个潜在的危险因素细胞系交叉污染细胞系交叉污染污染在这是个错误的用词污染在这是个错误的用词难于发现难于发现若出现传代细胞的生长速度若出现传代细胞的生长速度异常异常，考虑交叉污染，考虑交叉污染同一时间只传同一种细胞同一时间只传同一种细胞每种细胞要有单独的液体每种细胞要有单独的液体建立细胞库每三个月更换一次建立细胞库每三个月更换一次细胞细胞细菌、霉菌和酵母细菌、霉菌和酵母无抗生素污染易被发现无抗生素污染易被发现抗生素存在易造成隐性污染抗生素存在易造成隐性污染隐性污染引起严重后果隐性污染引起严重后果病毒病毒最难发现和清除最难发现和清除严格的宿主性严格的宿主性自限性自限性第1
7、0页，共21页，编辑于2022年，星期一支原体（杂草）支原体（杂草）生生 物物 污污 染染biologicalbiologicalcontaminationcontamination污染严重污染严重难发现难发现 难去除难去除显微镜看不到显微镜看不到不引起培养液浑浊和不引起培养液浑浊和PHPH改变改变营养要求高不容易用传统的微生物培养营养要求高不容易用传统的微生物培养法检测到法检测到不能通过过滤清除不能通过过滤清除大多数抗生素对其无效大多数抗生素对其无效第11页，共21页，编辑于2022年，星期一支原体检测方法支原体检测方法生生 物物 污污 染染biologicalbiologicalconta
8、minationcontamination方法敏感性优点缺点直接DNADNA染色(如Hoechst33258)Hoechst33258)低快速，便宜需要荧光显微镜结果不易解释指示细胞上间接DNADNA染色(如 Vero)Vero)中放大污染结果易解释费时免疫荧光单克隆抗体易操作灵敏需要荧光显微镜肉汤和琼脂培养高灵敏慢 需要专业解释ELISAELISA中快速检查种类有限PCRPCR中-高特异性强快速需要PCRPCR设备第12页，共21页，编辑于2022年，星期一1 1 分子量对照分子量对照2 22 2 阴性对照阴性对照3-8 3-8 原有细胞的悬液原有细胞的悬液9 9 阳性对照阳性对照1 1 分
9、子量对照分子量对照2 22 2 阴性对照阴性对照3-8 3-8 新细胞的悬液新细胞的悬液9 9 阳性对照阳性对照VenorGeM试剂盒试剂盒第13页，共21页，编辑于2022年，星期一生生 物物 污污 染染biologicalbiologicalcontaminationcontamination支原体支原体树树 立立“预预 防防 为为 主主”的的 思思 想想保证细胞来源干净保证细胞来源干净确保基质和器材无菌确保基质和器材无菌严格无菌操作严格无菌操作细胞培养时避免交谈细胞培养时避免交谈操作结束时消毒台面操作结束时消毒台面每船每船1515代的细胞应更换代的细胞应更换所有细胞培养材料丢弃前应高压消
10、毒所有细胞培养材料丢弃前应高压消毒第14页，共21页，编辑于2022年，星期一控控 制制 污污 染染controlcontrolcontaminationcontamination良好的无菌操作良好的无菌操作合理利用抗生素合理利用抗生素建立细胞库建立细胞库保持工作区清洁保持工作区清洁良好的规章制度良好的规章制度细胞污染的检测细胞污染的检测第15页，共21页，编辑于2022年，星期一良好的无菌操作良好的无菌操作所有玻璃器皿和培养液与试剂的配制应严格无菌所有玻璃器皿和培养液与试剂的配制应严格无菌避免溢出、溅出和气溶胶；避免溢出、溅出和气溶胶；吸入或吸出液体时避免倾倒；吸入或吸出液体时避免倾倒；吸入
11、或吸出液体时，不要触碰细胞培养瓶的瓶口；吸入或吸出液体时，不要触碰细胞培养瓶的瓶口；液体应分装并置液体应分装并置4-84-8o oC C保存；保存；每种细胞应使用单独的液体；每种细胞应使用单独的液体；清洁区和污染区的材料应单独处理；清洁区和污染区的材料应单独处理；控控 制制 污污 染染controlcontrolcontaminationcontamination第16页，共21页，编辑于2022年，星期一合理利用抗生素合理利用抗生素过度依赖抗生素会使人们忽略无菌操作过度依赖抗生素会使人们忽略无菌操作滥用抗生素常导致耐药菌的产生滥用抗生素常导致耐药菌的产生牢记抗生素不能代替无菌操作牢记抗生素不
12、能代替无菌操作控控 制制 污污 染染controlcontrolcontaminationcontamination第17页，共21页，编辑于2022年，星期一建立细胞库建立细胞库减少从主管单位获得细胞的运输费减少从主管单位获得细胞的运输费 冻存的细胞生物性状不发生改变冻存的细胞生物性状不发生改变消除了隐蔽污染的潜在危害消除了隐蔽污染的潜在危害控控 制制 污污 染染controlcontrolcontaminationcontamination第18页，共21页，编辑于2022年，星期一良好的规章制度良好的规章制度只有相关人员才可进入细胞培养区只有相关人员才可进入细胞培养区 细胞培养区必须和其
13、他区域分开细胞培养区必须和其他区域分开 每个细胞培养区应布局合理，保证所需物品就近放置，在处理细每个细胞培养区应布局合理，保证所需物品就近放置，在处理细胞时避免不必要的走动胞时避免不必要的走动 细胞培养区应避免使用水池，从而避免微生物污染细胞培养区应避免使用水池，从而避免微生物污染 控控 制制 污污 染染controlcontrolcontaminationcontamination第19页，共21页，编辑于2022年，星期一控控 制制 污污 染染controlcontrolcontaminationcontamination保持工作区清洁保持工作区清洁常规清洗地面和台面常规清洗地面和台面CO
14、CO2 2孵箱孵箱每每2-32-3个月消毒清洗孵箱个月消毒清洗孵箱所有溅出或溢出的液滴应立即所有溅出或溢出的液滴应立即擦拭并消毒擦拭并消毒 每周孵箱内水盘需彻底消毒每周孵箱内水盘需彻底消毒清洗清洗定期清洁水浴箱定期清洁水浴箱生物安全柜生物安全柜每次使用后应清洁和消毒安每次使用后应清洁和消毒安全柜的内表面全柜的内表面定期消毒安全柜工作面下层的盘定期消毒安全柜工作面下层的盘子；子；及时清理废弃物，高压感染材料及时清理废弃物，高压感染材料第20页，共21页，编辑于2022年，星期一控控 制制 污污 染染controlcontrolcontaminationcontamination细胞污染的检测细胞污染的检测支原体的检测支原体的检测其它生物污染的检测其它生物污染的检测使用传统的微生物学检测方使用传统的微生物学检测方法法化学污染的检测化学污染的检测常被误认为生物污染常被误认为生物污染要靠逐一替换的方法确定化要靠逐一替换的方法确定化学污染的来源学污染的来源 第21页，共21页，编辑于2022年，星期一