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1、色谱法基本原理 采用采用多级化、层析化多级化、层析化的的高效分离高效分离技术。技术。它不仅是复杂混合物的多组分分离技术。它不仅是复杂混合物的多组分分离技术。也是也是分离分析一体化分离分析一体化技术，实现多组分技术，实现多组分测定的测定的现代现代仪器分析方法。仪器分析方法。色谱分析法，你了解多少？色谱分析法，你了解多少？色谱法色谱法chromatography2 色谱历史色谱历史 色谱法定义色谱法定义 色谱图与色谱参数色谱图与色谱参数 色谱法分类色谱法分类 色谱分析的特点 色谱法发展趋势色谱法发展趋势色谱分析法概论色谱分析法概论3一、色谱法的由来一、色谱法的由来 19061906年，俄国植物学家
2、年，俄国植物学家TsweetTsweet，应用吸，应用吸附原理分离植物色素。附原理分离植物色素。色谱历史4组分组分1组分组分2石油醚石油醚（流动相）（流动相）组分组分1+2碳酸钙碳酸钙（固定相）（固定相）ylsfl植物色素的分离519031903（19061906）年，）年，Michael TswettMichael Tswett提出色谱法提出色谱法19311931年年，KuhnKuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素采用柱色谱分离了类胡萝卜素19411941年年，MartinMartin和和SyngeSynge提出分配色谱法提出分配色谱法 19441944年，年，MartinMartin等又提出纸
3、色谱法等又提出纸色谱法 19521952年年，MartinMartin和和JamesJames发明了气液色谱法发明了气液色谱法19551955年年，第第一一台台商商品品气气相相色色谱谱问问世世，标标志志着着现现代色谱分析的建立代色谱分析的建立19561956年，年，StahlStahl系统研究了薄层色谱法系统研究了薄层色谱法二、色谱法的发展二、色谱法的发展619571957年年，戈雷，戈雷(Golay)(Golay)发表发表“涂壁毛细管气液涂壁毛细管气液分配色谱理论和实践分配色谱理论和实践”论文，首先提出毛细管论文，首先提出毛细管速率方程，并第一次实现了毛细管气相色谱分速率方程，并第一次实现了
4、毛细管气相色谱分离。离。19581958年年，SteinStein和和MooreMoore研制出氨基酸分析仪，研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核酸的分子结构确定了核糖核酸的分子结构19671967年年，HorvvathHorvvath和和HuberHuber等研制了高效液相等研制了高效液相色谱仪色谱仪19751975年年，SmallSmall等提出离子色谱等提出离子色谱 72020世纪世纪8080年代年代，超临界色谱，超临界色谱2020世纪世纪9090年代，毛细管电泳（年代，毛细管电泳（18091809年年ReRessss第一次电泳实验）第一次电泳实验）2121世世纪纪，联联用用技技术术、大大分
5、分子子色色谱谱分分离离、制制备备色谱可望取得更大的发展色谱可望取得更大的发展8 固定相固定相：固体，液体固体，液体 流动相流动相：气体，液体，超临界流体气体，液体，超临界流体 色谱柱色谱柱：各种材质和尺寸各种材质和尺寸 被分离组分被分离组分：不再仅局限于有色物质不再仅局限于有色物质现在：一种重要的现在：一种重要的分离、分析技术分离、分析技术分离混合物各组分并加以分析分离混合物各组分并加以分析9色谱法定义色谱分析基本步聚色谱分析基本步聚试样试样选选固定相固定相进样进样洗脱洗脱收集收集组分组分分析分析important10BAABA溶剂溶剂A+B流动相流动相色谱柱色谱柱色谱分离过程示意图色谱分离过
6、程示意图BAB11是一种物理分析方法，是一种物理分析方法，物质在固定相和物质在固定相和流动相的流动相的分配系数分配系数有有微小微小差异，差异，当两相当两相做相对移动时，各组分在两相间进行做相对移动时，各组分在两相间进行反反复多次分配复多次分配，使各组分被流动相运载移，使各组分被流动相运载移动的速率不同，最终达到相互分离。动的速率不同，最终达到相互分离。色谱法：12分分配配系系数数是是广广义义的的，包包括括溶溶解解、吸吸附附、离离子子交交换、亲和力和分子体积等分离特性。换、亲和力和分子体积等分离特性。物物质质能能否否分分离离取取决决于于它它们们之之间间是是否否存存在在分分配配差差异异，这这是是一
7、一切切分分离离的的必必要要条条件件，色色谱谱也也不不能例外。能例外。与与其其它它分分离离法法相相比比，色色谱谱法法的的高高效效率率在在于于独独特特的的“动动态态分分离离过过程程”，即即反反复复多多次次分分配配，它它大大大大扩扩大大了了原原来来分分配配系系数数的的差差异异，从从而而实实现混合物的分离。现混合物的分离。13色色谱谱分分析析法法是是一一种种十十分分重重要要和和应应用用广广泛泛的的仪仪器器分分析析方方法法。它它采采用用色色谱谱分分离离和和连连续续测测定定方方式式相相结结合合方方式式，实实现现了了对对复复杂杂体体系系中中的的多多组组分分（包包括括价价态态、性性质质相相近近的的元元素素或或
8、化合物）分析。化合物）分析。色谱法作用：色谱分析法的关键是实现分离分析色谱分析法的关键是实现分离分析系统化系统化/一体化。一体化。14 色谱过程中，流动相色谱过程中，流动相/固定相对物质起着下列哪种固定相对物质起着下列哪种作用？作用？A运输作用运输作用 B滞留作用滞留作用 C化学反应作用化学反应作用 D分解作用分解作用15（一（一 ）典型色谱流出曲线）典型色谱流出曲线色谱图（色谱流出曲线）色谱图（色谱流出曲线）由检测器输出的由检测器输出的电信号强度电信号强度对时间（对时间（t）或流动相体积（）或流动相体积（V）作图所得到的曲线。作图所得到的曲线。色谱图及常用术语important16tRVRt
9、MVMtR VRh电电信信号号(mV)(mA)时间（时间（t）体积（体积（V）W1/2Wb进样进样curve171.基线基线：实验条件下，只有纯流动相通过：实验条件下，只有纯流动相通过 检测器时所得到的流出曲线。检测器时所得到的流出曲线。噪声噪声：由于各种偶然因素，如固定液：由于各种偶然因素，如固定液 挥发、外界电信号干扰等引起挥发、外界电信号干扰等引起 的基线起伏。的基线起伏。2.峰高峰高 h:从峰从峰顶点到基线顶点到基线距离。距离。181）峰宽峰宽 Wb：2）半高峰宽）半高峰宽W1/2:0.5h对应的峰宽对应的峰宽3.区域宽度区域宽度4）峰面积峰面积AA=1.065 h W1/23）标准偏
10、差）标准偏差:0.607h对应峰宽的一半对应峰宽的一半19各组分在色谱柱中各组分在色谱柱中滞留状况滞留状况的一个指标的一个指标4.保留值保留值色谱峰在色谱图中的色谱峰在色谱图中的位置位置由色谱分离过程中的由色谱分离过程中的热力学因素热力学因素所决定。所决定。在一定条件下，保留值是定值。在一定条件下，保留值是定值。（t，v）important20（1 1）保留时间保留时间 t R（2 2）死时间）死时间 t M保留时间保留时间从进样开始到组分出现浓度极大点时所需从进样开始到组分出现浓度极大点时所需时间，即时间，即组分通过色谱柱所需要的时间组分通过色谱柱所需要的时间不被固定相溶解或吸附的组分不被固
11、定相溶解或吸附的组分通通过色谱柱过色谱柱所消耗的的时间所消耗的的时间（流动相流经色谱柱所需的时间流动相流经色谱柱所需的时间）21（3 3）调整保留时间调整保留时间 t R t R =t R t M在实验条件一定时，只取决于组分的性质。在实验条件一定时，只取决于组分的性质。实质：实质：组分在固定相中滞留的时间组分在固定相中滞留的时间V=t F（F：流动相流速：流动相流速,ml/min）22柱温、固定相、流动相条件不变，柱温、固定相、流动相条件不变，r ri,s i,s 不变不变r ri,si,s值越大值越大，分离越，分离越易易实现，实现，ri,si,s 1 1时，时，两组色谱峰重叠。两组色谱峰重
12、叠。（4）相对保留值）相对保留值 ri,s -选择性参数选择性参数组分i对组分s的相对保留值23相对保留值是指某组分2与某组分1的_。A.调整保留值之比 B.死时间之比 C.保留时间之比 D.保留体积之比24下列哪项数值反映了组分通过色谱柱所需的时间?A.保留时间 B.调整保留时间 C.保留体积 D.调整保留体积25色谱峰的色谱峰的保留值（保留值（t，v）-峰峰面积面积或峰或峰高高 -峰峰间距间距及及宽度宽度 -定性定性定量定量色谱柱分离效率（柱效）评价色谱柱分离效率（柱效）评价峰的峰的数目数目 -含组分的最少个数含组分的最少个数5.色谱图的作用色谱图的作用26（5 5）分分配配系系数数K K
13、 -相相平平衡衡参参数数注：注：K K为热力学常数为热力学常数 实验条件固定，实验条件固定，K K 仅与仅与组分性质组分性质有关有关在一定温度和压力下，组分在色谱柱在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定相与流动相中达分配平衡后，在固定相与流动相中的中的浓度比浓度比27（6）分配比）分配比-容量因子容量因子 k k =K K随随固定相的量固定相的量而变化而变化由由组分和两相组分和两相的性质决定的性质决定衡量色谱住对衡量色谱住对被分离组分保留能力被分离组分保留能力的的重要参数重要参数 tR/tM=VR/VM 28注意：注意：K K 或或 k k 反映的是某一组分在两相反映的是某一组
14、分在两相间的分配；间的分配；当两组分当两组分 K K 或或 k k 相同时，两相同时，两组分不能分开；当两组分组分不能分开；当两组分 K K 或或 k k 相差越相差越大时，分离得越好。大时，分离得越好。两组分在两相间的分配系数不同，是色两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。谱分离的先决条件。29流流动动相相液相色谱法液相色谱法(LC)气相色谱法气相色谱法(GC)液液-固色谱法固色谱法,液液-液色谱法液色谱法气气-固色谱法固色谱法,气气-液色谱法液色谱法色谱法分类（一）按两相所处的状态（一）按两相所处的状态30（二）按操作形式分类（二）按操作形式分类平面平面色谱色谱 纸纸色谱色谱
15、 薄层薄层色谱色谱 薄膜薄膜色谱色谱柱柱色谱色谱 填充填充柱色谱柱色谱 毛细管毛细管柱色谱柱色谱 微填充微填充柱色谱柱色谱 31（三）按分离机理分类（三）按分离机理分类1.1.吸附色谱法吸附色谱法2.2.气气-固、液固、液-固色谱固色谱 分离机理：分离机理：基于固定相对样品中各组分基于固定相对样品中各组分的的吸附能力吸附能力不同而分离。不同而分离。固定相固定相:具有大表面积的具有大表面积的多孔吸附剂多孔吸附剂。例：硅胶，例：硅胶，AlAl2 2O O3 3 ，活性炭，活性炭32分离机理：分离机理：2.2.分配色谱法分配色谱法：气气-液、液液、液-液色谱液色谱基于不同组分在流动相和固基于不同组分
16、在流动相和固定相之间的定相之间的溶解分配能力溶解分配能力的的差异而实现。差异而实现。液体固定相涂布或吸附在载体表面。液体固定相涂布或吸附在载体表面。33液固液固/气固色谱分析中，首先流出色谱柱的组气固色谱分析中，首先流出色谱柱的组分是分是()A.吸附能力大的吸附能力大的 B.吸附能力小的吸附能力小的 C.溶解度大的溶解度大的 D.溶解度小的溶解度小的34气液气液/液液色谱分析中，首先流出色谱柱的组液液色谱分析中，首先流出色谱柱的组分是：分是：A.吸附能力大的吸附能力大的 B.吸附能力小的吸附能力小的 C.溶解度大的溶解度大的 D.溶解度小的溶解度小的35气液色谱法，其分离原理是：气液色谱法，其
17、分离原理是：液液-固色谱法，其分离原理是：固色谱法，其分离原理是：A.吸附平衡吸附平衡 B.离子交换平衡离子交换平衡C.分配平衡分配平衡 D.渗透平衡渗透平衡363.3.离子交换色谱法离子交换色谱法具有具有离子交换功能离子交换功能团团的材料的材料利用各组分与固定相进行利用各组分与固定相进行离离子交换能力子交换能力的差异而实现。的差异而实现。分离机理：分离机理：固定相：固定相：例：纯净水的制备例：纯净水的制备R RSOSO3 3H H，R RNRNR3 3ClCl37lzjh38在在R-SO3H型的离子交换树脂上选择型的离子交换树脂上选择性最大的是？性最大的是？ALi+BMg2+CCe3+DTh
18、4+394.4.分子排阻色谱法分子排阻色谱法5.5.凝胶凝胶(gel)(gel)色谱或空间排阻色谱色谱或空间排阻色谱 利用各组分利用各组分分子的大小不同分子的大小不同而在凝胶上产生的而在凝胶上产生的阻滞作用阻滞作用不同实现的。不同实现的。分离机理分离机理:适合分离分子量大于适合分离分子量大于20002000的化合物。的化合物。40Dong-241体积排阻色谱中，先流出来的物质是？体积排阻色谱中，先流出来的物质是？A.分子量较小的物质 B.分子量较大的物质 C.极性较小的物质 D.极性较大的物质 42能用于测量组分分子量的液相色谱法是能用于测量组分分子量的液相色谱法是()A离子交换色谱离子交换色
19、谱 B化学键合相色谱化学键合相色谱C凝胶色谱凝胶色谱 D反相色谱反相色谱43如果样品的相对分子量大于如果样品的相对分子量大于2000，一般可考，一般可考虑使用虑使用_进行分离。进行分离。A.气相色谱法气相色谱法 B.空间排阻色谱法空间排阻色谱法C.液相色谱法液相色谱法 D.以上都不是。以上都不是。445.5.亲和色谱法亲和色谱法ACAC固定相固定相将具有将具有生物活性生物活性（酶、辅酶、（酶、辅酶、抗体）的配位基键合到基质表抗体）的配位基键合到基质表面上面上分离机理分离机理利用利用生物大分子或蛋白质生物大分子或蛋白质与与配配基基的的亲和力亲和力专用于分离与纯化蛋白质等生化样品专用于分离与纯化蛋
20、白质等生化样品456.6.毛细管电色谱法毛细管电色谱法分离机理分离机理靠靠色谱与电场两种作用力色谱与电场两种作用力，依据样品组分的分配系数及依据样品组分的分配系数及电泳速度差别而分离电泳速度差别而分离特点特点快速、经济、应用广快速、经济、应用广46色谱分析的特点优点：优点：“高高”、“快快”、“广广”47(1)(1)高选择性高选择性 对对于于那那些些性性质质极极为为相相似似的的组组分分,如如同同位位素素、同同分分异异构构体体,采采用用高高选选择择性性固固定定相相，使使它它们们之之间间的的分分配配系系数数产产生生足足够够大大的的差差异异,从而实现良好分离。（色谱的热力学性质）从而实现良好分离。（
21、色谱的热力学性质）48 (2)(2)高柱效高柱效 在在良良好好的的操操作作条条件件下下，色色谱谱柱柱能能使使复复杂杂或或相相似似的的多多组组分分样样品品,在在两两相相间间进进行行多多次次的分配的分配(10(103 3-10-106 6)而实现分离。而实现分离。49(3)(3)高灵敏度：高灵敏度：多多种种高高灵灵敏敏检检测测器器，痕痕量量杂杂质质分分析析的的有有力力工具。工具。与检测原理一样同类仪器方法相比，色与检测原理一样同类仪器方法相比，色谱分析法的灵敏度是高还是低？为什么？谱分析法的灵敏度是高还是低？为什么？50(4)(4)分析速度快：分析速度快：复杂多组分样品分析仅复杂多组分样品分析仅几
22、几几十分钟几十分钟(5)(5)定量准确：定量准确：分分离离检检测测一一体体化化，仪仪器器实实现现自自动动化化、微机化，保证分析结果的准确性。微机化，保证分析结果的准确性。(6)(6)应用范围广应用范围广(7)(7)试样用量少试样用量少51色谱分析的局限性对分析对象的对分析对象的鉴定功能较差鉴定功能较差单次单次分析周期可能分析周期可能较长较长浓度检测浓度检测灵敏度可能较灵敏度可能较低低仪器及费用也许较仪器及费用也许较贵贵实验影响因素较多，需要有实验影响因素较多，需要有较高的专业知识较高的专业知识52色谱法发展趋势1.色谱色谱智能化智能化例：薄层色谱法例：薄层色谱法自动自动点样点样自动程序多次自动
23、程序多次展开展开薄层薄层扫描扫描532.联用技术联用技术气气-质质联用（联用（LC-MS）气气相相-傅里叶变换傅里叶变换红外红外光谱（光谱（GC-FTIR）超临界流体超临界流体色谱色谱-质质谱（谱（SFC-MS）高效高效液液相色谱相色谱-质质谱（谱（HPLC-MS）可绘制光谱、色谱三维图谱。可绘制光谱、色谱三维图谱。可得到定性、定量信息。可得到定性、定量信息。色谱分离色谱分离光谱和质谱鉴定光谱和质谱鉴定543.多维色谱多维色谱 将将两种或两种以上两种或两种以上色谱法联用色谱法联用气液气液-气固联用气固联用（GLC-GSC）高效液相高效液相-气相气相（HPLC-GC）高效液相高效液相-离子交换色谱离子交换色谱（HPLC-IEC）高效液相高效液相-尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱（HPLC-SEC）色谱图为多维色谱图，色谱分析信息多。色谱图为多维色谱图，色谱分析信息多。554.高效能高效能色谱柱和色谱柱和高灵敏度高灵敏度、通用型通用型检测器检测器键合相色谱、离子色谱、手性色谱柱键合相色谱、离子色谱、手性色谱柱56此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢