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1、第一章第一章色谱法的基本原理色谱法的基本原理 10/26/202210/26/20221 1 色谱分析法是用来进行混合物中各组分的分离色谱分析法是用来进行混合物中各组分的分离色谱分析法是用来进行混合物中各组分的分离色谱分析法是用来进行混合物中各组分的分离和分析的一种物理化学分析方法。和分析的一种物理化学分析方法。和分析的一种物理化学分析方法。和分析的一种物理化学分析方法。1.1 1.1 1.1 1.1 色谱法概述色谱法概述色谱法概述色谱法概述1.1.1 1.1.1 1.1.1 1.1.1 色谱法发展史色谱法发展史色谱法发展史色谱法发展史固定相固定相固定相固定相流动相流动相流动相流动相110/2
2、6/202210/26/20222 2pp 19031903年，俄国植物学家年，俄国植物学家Tswett Tswett 利用吸附原理分离植物色素而利用吸附原理分离植物色素而 发明色谱法发明色谱法(chromatography)(chromatography)。pp 1941 1941年年Martin A J PMartin A J P和和Synge R L MSynge R L M发明液液分配色谱、获发明液液分配色谱、获19521952年年 诺贝尔化学奖。诺贝尔化学奖。pp 1952 1952年年Martin A J PMartin A J P和和James A TJames A T发明气相色
3、谱发明气相色谱(gas(gas chromatography,chromatography,GC)GC)pp 70 70年代发展了高效液相色谱年代发展了高效液相色谱(High-performance liquid(High-performance liquid chromaotgraphy,HPLC)chromaotgraphy,HPLC)成为重要分离分析技术成为重要分离分析技术pp 80 80年代年代Jorgenson J WJorgenson J W等的研究工作推动了高效毛细管电泳等的研究工作推动了高效毛细管电泳(High-(High-performance capillary elect
4、rophoresis,HPCE)performance capillary electrophoresis,HPCE)高速发展高速发展210/26/202210/26/20223 31.1.2 1.1.2 色谱法分类色谱法分类1 1、按两相所处的状态分类、按两相所处的状态分类气相色谱气相色谱 -用气体作流动相用气体作流动相液相色谱液相色谱 -用液体作流动相用液体作流动相 由于固定相可分为固体吸附剂和涂在固体担体上或毛由于固定相可分为固体吸附剂和涂在固体担体上或毛细管内壁上的液体固定相，故可将色谱法分为下述四类：细管内壁上的液体固定相，故可将色谱法分为下述四类：流动相流动相气体气体液体液体固体固
5、体液体液体固定相固定相气气-固色谱固色谱液液-液色谱液色谱气-液液-固310/26/202210/26/20224 42、按固定相形状分类、按固定相形状分类柱色谱柱色谱 固定相装在柱管内。它又可分为填充柱色谱和空心毛细固定相装在柱管内。它又可分为填充柱色谱和空心毛细管色谱。管色谱。GC 填充柱填充柱:长长110 m，24 mm空心毛细管空心毛细管:长长10100 m，0.5 mmLC:长长0.5 m，46 mm纸色谱纸色谱 用滤纸作固定相，试样溶液在纸上进行展开、分离。用滤纸作固定相，试样溶液在纸上进行展开、分离。薄层色谱薄层色谱 将固定相研磨成粉末，再压成薄膜或涂成薄膜。样品的将固定相研磨成
6、粉末，再压成薄膜或涂成薄膜。样品的分离形式类似纸色谱。分离形式类似纸色谱。(纸色谱和薄层色谱又统称作平板色纸色谱和薄层色谱又统称作平板色谱谱)410/26/202210/26/20225 53、按分离过程的物理化学原理分类、按分离过程的物理化学原理分类 吸附色谱吸附色谱(LS，GS)利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差异进行分离。利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差异进行分离。分配色谱分配色谱(LL，GL)利用不同组分在两相中分配系数的不同进行分离。利用不同组分在两相中分配系数的不同进行分离。离子交换色谱离子交换色谱(LS)利用组分离子与离子交换剂的交换能力不同进行分离。利用组分离子与
7、离子交换剂的交换能力不同进行分离。空间排阻色谱空间排阻色谱(LS)用多孔物质对不同大小分子的阻碍作用进行分离。用多孔物质对不同大小分子的阻碍作用进行分离。510/26/202210/26/20226 61.2 1.2 色谱分离原理色谱分离原理1.2.1 1.2.1 分配系数和分配比分配系数和分配比1.1.1.1.分配系数分配系数分配系数分配系数s s：固定相：固定相m m：流动相：流动相2.2.2.2.分配比分配比分配比分配比(保留因子保留因子保留因子保留因子)定义：在一定的温度、压力下，组分在气液两相间达平衡时，分配在液相中的质量与分配在气相中的质量之比。即610/26/202210/26/
8、20227 7k:随K和流动相、固定相体积的变化而变化，而K是由组分及固定液的热力学性质决定的。：相比 Vm：色谱柱中流动相体积，Vs：色谱柱中固定相体积710/26/202210/26/20228 81.2.2 1.2.2 分离原理分离原理810/26/202210/26/20229 91.3 1.3 色谱流出曲线色谱流出曲线、色谱峰、色谱峰、色谱峰、色谱峰流出曲线（色谱图）：电信号强度随时间变化曲线流出曲线（色谱图）：电信号强度随时间变化曲线色谱峰：流出曲线上突起部分色谱峰：流出曲线上突起部分910/26/202210/26/20221010 1.1.1.1.峰高峰高峰高峰高 色谱峰顶点与
9、基线之间的距离，以色谱峰顶点与基线之间的距离，以h h表示，如图中表示，如图中AB AB 2 2标准偏差标准偏差标准偏差标准偏差 处，拐点处，峰宽正好为处，拐点处，峰宽正好为22 3 3峰面积峰面积峰面积峰面积A A A A1/21/2 4 4半峰宽半峰宽半峰宽半峰宽Y Y1/21/2 Y Y1/21/2 5 5峰底宽峰底宽峰底宽峰底宽 Y=4 Y=4，拐点作切线与基线相交，相交两点，两点间距拐点作切线与基线相交，相交两点，两点间距 离为峰底宽，离为峰底宽，如图中如图中ABAB。、Y Y1/21/2、Y Y统称为区域宽度统称为区域宽度1010/26/202210/26/20221111 保留值
10、是用来描述待测试样中各组分在色谱柱中滞留情保留值是用来描述待测试样中各组分在色谱柱中滞留情况的物理量，通常用距离或将各组分带出色谱柱所需的载气况的物理量，通常用距离或将各组分带出色谱柱所需的载气体积（或时间）表示。在一定的固定相和操作条件下，任何体积（或时间）表示。在一定的固定相和操作条件下，任何一种物质都有一个固定的保留值，故组分的保留值可用于该一种物质都有一个固定的保留值，故组分的保留值可用于该组分的定性鉴定。组分的定性鉴定。1 1 1 1死时间死时间死时间死时间t t t tM M M M 不被固定相吸附或溶解的组分从进样开始到柱后出现响不被固定相吸附或溶解的组分从进样开始到柱后出现响应
11、信号极大值时所需时间。对于气相色谱，常把空气（热导应信号极大值时所需时间。对于气相色谱，常把空气（热导检测器）和甲烷（氢火焰离子化检测器）从进样到出峰的时检测器）和甲烷（氢火焰离子化检测器）从进样到出峰的时间称为死时间。间称为死时间。1.3.2 1.3.2 1.3.2 1.3.2 保留值保留值保留值保留值1110/26/202210/26/20221212 2 2 2 2保留时间保留时间保留时间保留时间t t t tR R R R 试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图称为保留时间，如图 OB OB。它相应于样品到达柱
12、末端。它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间。的检测器所需的时间。3.3.3.3.调整保留时间调整保留时间调整保留时间调整保留时间 扣除死时间后的保留时间。扣除死时间后的保留时间。t t t tR R R R=t=t=t=tR R R Rt t t tM M M M 4.4.4.4.流动相的流速流动相的流速流动相的流速流动相的流速Vc=qct1210/26/202210/26/202213135 5死体积死体积死体积死体积V VMM 不被保留的组分，即分配色谱中K=0的组分，可由死时间来确定。VM=tM qV,c 6 6保留体积保留体积保留体积保留体积V VR R 从进样开始到柱后出现待测组
13、分响应信号极大值时所通过的载气体积。VR=tRqV,c1310/26/202210/26/202214147 7调整保留体积调整保留体积调整保留体积调整保留体积V VR R 指扣除死体积后的保留体积。VR=VRVM 8 8相对保留值相对保留值相对保留值相对保留值r r2,12,1 指组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，是一个无因次量，只和柱温与固定相性质有关，故其可以作为一个定性指标。r2,1也可用表示，即，也叫做选择因子。1410/26/202210/26/20221515 9 9保留值与保留因子保留值与保留因子保留值与保留因子保留值与保留因子 间的关系间的关系间的关系间的关系151
14、0/26/202210/26/202216161610/26/202210/26/20221717从色谱流出曲线可以得到以下一些信息从色谱流出曲线可以得到以下一些信息：a样品所含最少组分(峰个数)b根据色谱峰的保留值可以进行定性分析c根据色谱峰的面积或峰高可以进行定量分析d根据色谱峰的位置和区域宽度可对色谱柱效能进行评价 1710/26/202210/26/202218181.4 1.4 塔板理论塔板理论实验实验实验实验验证验证验证验证假设假设假设假设理理理理论论论论模模模模型型型型(数数数数学学学学表达式表达式表达式表达式)修改修改修改修改模型模型模型模型完善完善完善完善模型模型模型模型1.
15、4.1 1.4.1 塔板理论的假设塔板理论的假设 在自然科学上，科学理论：塔板理论思路源于精馏塔1810/26/202210/26/20221919塔板理论的假设：塔板理论的假设：1.柱分成柱分成n段，段，n为理论塔板数，每段高为为理论塔板数，每段高为H，H为塔板高为塔板高度，柱长为度，柱长为L，则，则n=L/H2.所有组分开始都加在第零号塔板上。所有组分开始都加在第零号塔板上。3.在每块塔板上被测物在气液间的平衡是瞬间建立的。在每块塔板上被测物在气液间的平衡是瞬间建立的。4.载气是以脉冲式载气是以脉冲式(塞子式塞子式)进入色谱柱进行冲洗的，每次进入色谱柱进行冲洗的，每次恰好为一个塔板体积恰好
16、为一个塔板体积V。5.在所有塔板上，同一组分的分配系数为常数，即和组分在所有塔板上，同一组分的分配系数为常数，即和组分的量无关。的量无关。6.沿色谱柱方向不存在塔板与塔板间被测物的纵向扩散。沿色谱柱方向不存在塔板与塔板间被测物的纵向扩散。1910/26/202210/26/20222020假定：K=1 Vs/Vm=1 k=1 n=5 进样量 m=10.50.50.50.50.250.250.250.250.250.250.250.250.1250.1250.250.250.1250.1250.1250.1250.250.250.1250.1250.06250.1880.1880.06250.0
17、6250.1880.1880.06250.031250.1250.1880.1250.031250.031250.1250.1880.1250.03125 m=1g1V2V3V4V 0 1 2 3 42010/26/202210/26/20222121 被测物流出色谱柱时流动相中被测物浓度随体积(或时间)的变化曲线。2110/26/202210/26/20222222这一理论得到结果这一理论得到结果1分布有一最大，两边逐渐减小2最大及整个分布曲线向后推移3流出曲线方程(也称塔板理论方程)，即数学表达式：C：不同流出体积时的组分浓度m：进样量 VR：保留体积n：塔板数 V：流出体积2210/26
18、/202210/26/20222323理论塔板数与色谱参数之间的关系为：理论塔板数与色谱参数之间的关系为：单位柱长的单位柱长的塔板数越多塔板数越多，表明，表明柱效越高柱效越高。用用不同物质不同物质计算可得到计算可得到不同的理论塔板数不同的理论塔板数。2310/26/202210/26/20222424有效塔板数和有效塔板高度有效塔板数和有效塔板高度有效塔板数和有效塔板高度有效塔板数和有效塔板高度 组组分分在在t t0 0时时间间内内不不参参与与柱柱内内分分配配，需需引引入入有有效效塔塔板板数数和和有效塔板高度：有效塔板高度：2410/26/202210/26/20222525塔板理论的成功与局
19、限塔板理论的成功与局限1成功 导出流出曲线数学表达式(模型)解释了流出曲线形状、浓度极大点 提出了评价柱效的参数(n)及其计算式2局限 仅考虑了热力学因素，没有考虑动力学因素。不能说明影响柱效的原因及谱带扩张的原理 不能说明流速对柱效的影响，实验测得流速不同时n 和H不同。2510/26/202210/26/20222626 19561956年年荷荷兰兰学学者者范范弟弟姆姆特特(Van(Van Deemter)Deemter)提提出出了了色色谱谱过过程程的动力学理论，导出了塔板高度的动力学理论，导出了塔板高度 H H与载气线速度与载气线速度u u 的关系式：的关系式：涡流扩散项涡流扩散项涡流扩
20、散项涡流扩散项纵向扩散项纵向扩散项纵向扩散项纵向扩散项传质阻抗项传质阻抗项传质阻抗项传质阻抗项1.5 1.5 速率理论速率理论1.5.1 1.5.1 1.5.1 1.5.1 气相色谱法气相色谱法气相色谱法气相色谱法2610/26/202210/26/20222727A A 涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项 A=2dp dpdp：固定相的平均颗粒直径：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子：固定相的填充不均匀因子 影响影响A的因素的因素：A与填充物颗粒大小与填充物颗粒大小dP和填充均匀性和填充均匀性(取决于填充物颗粒的大小分布和装柱情况取决于填充物颗粒的大小分布和装柱情况)有关有关
21、,与载气性与载气性质、线速和组分无关。质、线速和组分无关。减小涡流扩散提高柱效的有效途径：使用适当的粒度且减小涡流扩散提高柱效的有效途径：使用适当的粒度且颗粒均匀的担体，并尽量填充均匀。颗粒均匀的担体，并尽量填充均匀。2710/26/202210/26/20222828B B B B/u u u u 分子扩散项分子扩散项分子扩散项分子扩散项 B B=2=2D Dg g ：弯曲因子，填充柱色谱，弯曲因子，填充柱色谱，110时，对Rs改进已不明显，一般控制在110之间。1.6.3 1.6.3 1.6.3 1.6.3 影响分离度的因素影响分离度的因素影响分离度的因素影响分离度的因素4010/26/2
22、02210/26/202241412.2.选择性的影响选择性的影响 增增大大 是是提提高高分分离离度度的的最最有有效效方方法法。在在相相同同分分离离度度下下当当 增加一倍，需要的增加一倍，需要的n n有效有效 减小减小1000010000倍。倍。增大增大 的最有效方法是选择合适的固定相。的最有效方法是选择合适的固定相。4110/26/202210/26/202242421.6.1 1.6.1 1.6.1 1.6.1 色谱定性鉴定方法色谱定性鉴定方法色谱定性鉴定方法色谱定性鉴定方法1.1.1.1.利用纯物质定性的方法利用纯物质定性的方法利用纯物质定性的方法利用纯物质定性的方法 利利用用保保留留值
23、值定定性性：通通过过对对比比试试样样中中具具有有与与纯纯物物质质相相同同保保留留值值的的色色谱谱峰峰，来来确确定定试试样样中中是是否否含含有有该该物物质质及及在在色色谱谱图图中的位置。中的位置。利利用用加加入入法法定定性性：将将纯纯物物质质加加入入到到试试样样中中，观观察察各各组组分分色谱峰的相对变化。色谱峰的相对变化。1.6 1.6 定性和定量分析定性和定量分析4210/26/202210/26/20224343与其他分析仪器联用的定性方法与其他分析仪器联用的定性方法 小型化的台式色质谱联用仪（小型化的台式色质谱联用仪（小型化的台式色质谱联用仪（小型化的台式色质谱联用仪（GC-MSGC-MS
24、GC-MSGC-MS；LC-MSLC-MSLC-MSLC-MS）色谱色谱色谱色谱-红外光谱仪联用仪；红外光谱仪联用仪；红外光谱仪联用仪；红外光谱仪联用仪；组分的结构鉴定组分的结构鉴定组分的结构鉴定组分的结构鉴定SampleSampleSampleSampleSampleSampleSampleSample 589058901.0 1.0 DEG/MIDEG/MIN NHEWLETTHEWLETTPACKARDPACKARDHEWLETHEWLETT T PACKARPACKARD D5972A5972AMass Mass SelectivSelective e DetectoDetector
25、rD DC CB BA A A A A AB B B BC C C CD D D DGasChromatograph(GC)GasChromatograph(GC)GasChromatograph(GC)GasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)MassSpectrometer(MS)MassSpectrometer(MS)MassSpectrometer(MS)SeparationSeparationSeparationSeparationIdentificationIdentificationIdentificationIdentificationB
26、B B BA A A AC C C CD D D D4310/26/202210/26/202244441.6.2 1.6.2 色谱定量分析方法色谱定量分析方法1.峰面积的测量 （1）峰高（h）乘半峰宽（Y 1/2）法：近似将色谱峰当作等腰三角形。此法算出的面积是实际峰面积的倍：A=1.065 hY1/2 （2）峰高乘平均峰宽法：当峰形不对称时，可在峰高和处分别测定峰宽，由下式计算峰面积：A=h（Y +Y ）/2 4410/26/202210/26/202245452 定量校正因子2.1 绝对校正因子 由于受到仪器及操作条件的影响程度很大，实际定量分析时，基本上不使用4510/26/20221
27、0/26/20224646 相对校正因子相对响应值（灵敏度）4610/26/202210/26/202247471.6.3 1.6.3 常用的几种定量方法常用的几种定量方法（1 1）归一化法：）归一化法：）归一化法：）归一化法：特点及要求：特点及要求：归一化法简便、准确；归一化法简便、准确；进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大；进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大；仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。4710/26/202210/26/20224848%100%1=niAisiAisiifAfAmi4810/26/202210/26/20224949（2 2）外标法）外标法）外标法）外标法外标法也称为标准曲线法。外标法也称为标准曲线法。1 2 3 4 5 6 Sample4910/26/202210/26/20225050(3)(3)(3)(3)内标法内标法内标法内标法SampleStandardsiAssssAisiifAmfAm=AsssAisisifAfAmm=%100%=AisssiifmmAAm5010/26/202210/26/20225151三种定量方法的对比三种定量方法的对比三种定量方法的对比三种定量方法的对比5110/26/202210/26/20225252