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1、III篇篇 分离方法分离方法第第19章章色谱法分离原理色谱法分离原理19-1 概概 述述n色谱法色谱法(Chromatography)(Chromatography)与蒸馏、重结晶、溶与蒸馏、重结晶、溶剂萃取、化学沉淀及电解沉积法一样是一种剂萃取、化学沉淀及电解沉积法一样是一种分分离分析方法离分析方法。n色谱法由俄国植物学家茨维特色谱法由俄国植物学家茨维特(Tsweet)(Tsweet)早在早在19031903年创立。年创立。n茨维特在研究植物叶子的色素成分时，将植物茨维特在研究植物叶子的色素成分时，将植物叶子的石油醚萃取物，倒入填有碳酸钙的直立叶子的石油醚萃取物，倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内
2、，然后加入石油醚使其自由流下，结玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分在玻璃管内互相分离，形成不果色素中各组分在玻璃管内互相分离，形成不同颜色的谱带，因看到色带与光谱一样，因此同颜色的谱带，因看到色带与光谱一样，因此取名为色谱法。取名为色谱法。n茨维特认为这是一种很好的分离方法，茨维特认为这是一种很好的分离方法，特别适合于易分解的植物成分，特别适合于易分解的植物成分，以后以后此法逐渐应用于无色物质的分离，现此法逐渐应用于无色物质的分离，现在在“色谱色谱”二字虽已失去原来二字虽已失去原来的含义，的含义，但仍被人们沿用至今。但仍被人们沿用至今。n在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管在
3、色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相固定相；n自上而下流动的一相（一般是气体或液自上而下流动的一相（一般是气体或液体）称为体）称为流动相流动相；n装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为称为色谱柱色谱柱。色谱法的分类色谱法的分类n按相系统的形式与特征分为柱色谱、平板色谱。按相系统的形式与特征分为柱色谱、平板色谱。n固固定定相相装装于于柱柱内内流流动动相相依依靠靠重重力力或或外外加加压压力力的的作作用用使使其其流流动动并并达达到到色色谱谱分分离离的的方方法法，称称为为柱柱色谱。色谱。n固固定
4、定相相均均匀匀的的铺铺在在玻玻璃璃板板上上或或直直接接利利用用多多孔孔滤滤纸纸作作固固定定相相，流流动动相相借借助助毛毛细细现现象象或或重重力力作作用用达达到到色色谱谱分分离离的的方方法法，因因这这类类方方法法固固定定相相呈呈平平板板状状，称称为为平平板板色色谱谱，它它又又可可分分为为薄薄层层色色谱谱和和纸色谱纸色谱。n依据两相物理状态分类依据两相物理状态分类n依据流动相的物理状态分为：依据流动相的物理状态分为：n气相色谱（气相色谱（GC）；）；n液相色谱（液相色谱（LC)；n超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱（SFC）。）。n气相色谱又可分为气固
5、色谱（气相色谱又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱）和气液色谱（GLC）。）。n液相色谱亦可分为液固色谱（液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱）和液液色谱（LLC）n按色谱动力学过程，可将色谱法分为：按色谱动力学过程，可将色谱法分为：n迎头法、顶替法和洗脱法色谱法。迎头法、顶替法和洗脱法色谱法。n洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂在固定相上的吸
6、附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。其流出曲线为其流出曲线为tCn顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。弱顺序，依次顶替出固定相。n迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，迎头法是将试样混合物连续通过色
7、谱柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先以纯物吸附或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出，其次则以第一组分和吸质的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。以此类推。AA+Bn按分离原理分类按分离原理分类n利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。n利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。达到分离的方法称为分配色谱法。n利用组分在离子交换剂（固定
8、相）上的亲和力利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。谱法。n利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。排阻色谱法。n最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。分离。19-2 线性
9、洗脱色谱及有关术语线性洗脱色谱及有关术语n洗脱色谱是洗脱色谱是基于样品组分在固定相和流动相之基于样品组分在固定相和流动相之间达到分配平衡，并随着流动相向前流动时，间达到分配平衡，并随着流动相向前流动时，反复多次的达到这种分配平衡。反复多次的达到这种分配平衡。n由于这个过程涉及到两相之间的分配平衡，所由于这个过程涉及到两相之间的分配平衡，所以可以用分配系数以可以用分配系数K来进行定量讨论。分配系来进行定量讨论。分配系数数K指在一定温度和压力下，组分在固定相和指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值流动相之间分配达平衡时的浓度之比值。分配等温线分配等温线n图图19-1
10、是溶质在是溶质在固定相和流动相中固定相和流动相中之间的分配等温线。之间的分配等温线。若分配系数若分配系数K与浓与浓度无关，则分配等度无关，则分配等温线是线性（图中温线是线性（图中C线）所进行的色线）所进行的色谱过程为线性色谱。谱过程为线性色谱。nA A、B B型曲线是一条典型的吸附等温线。吸附色谱法属型曲线是一条典型的吸附等温线。吸附色谱法属于这类线曲。于这类线曲。n从图从图19-119-1可以看出，溶质浓度低时可以看出，溶质浓度低时CsCs基本上正比于基本上正比于CmCm，曲线近似于直线，一般情况下由于色谱柱中溶质的，曲线近似于直线，一般情况下由于色谱柱中溶质的浓度较低因此可以认为浓度较低因
11、此可以认为K K为常数。为常数。K K为常数时所进行为常数时所进行的色谱过程称为线性色谱。的色谱过程称为线性色谱。n容易理解，溶质流过色谱柱时，分配系数容易理解，溶质流过色谱柱时，分配系数K K值大，则保值大，则保留时间就长，分配系数留时间就长，分配系数K K值小，则保留时间就短。由于值小，则保留时间就短。由于不同的组分这种分配系数上的差异，产生流动的速率不同的组分这种分配系数上的差异，产生流动的速率不同，最终实现组分的分离。不同，最终实现组分的分离。色谱法常用术语色谱法常用术语n（一）色谱流出曲线和色谱峰（一）色谱流出曲线和色谱峰 由检测器输出的电信号强度对时间作图，由检测器输出的电信号强度
12、对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰就是色谱峰。如果进样量很小，浓度很低，在吸附等如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。色谱流出曲线和色谱峰色谱流出曲线和色谱峰（二）基线（二）基线n色谱柱后仅有流动相流出，并通过检测器检测的信号。色谱柱后仅有流动相流出，并通过检测器检测的信号。稳定的基线应该是一条水平直线。稳定的基线应该是一条水平直线。（三）峰高（三）峰高n色谱峰顶点与基线之
13、间的垂直距离，以色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示。表示。（四）保留值（四）保留值 1.死时间死时间tM 不不被被固固定定相相吸吸附附或或溶溶解解的的物物质质进进入入色色谱谱柱柱时时，从从进进样样到到出出现现峰峰极极大大值值所所需需的的时时间间称称为为死死时时间间，它它正正比比于于色谱柱的空隙体积色谱柱的空隙体积。n因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速平均线速时，可用柱长时，可用柱长L与与t0的比值计算，即的比值计算，即 2.2.保留时间保留时间t tR R
14、 试样从进样开始到柱后出现峰极大值时所经过的时间，试样从进样开始到柱后出现峰极大值时所经过的时间，称为保留时间。称为保留时间。3.3.调整保留时间调整保留时间t tR R n某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即保留时间，即 tR=tR tM n由由于于组组分分在在色色谱谱柱柱中中的的保保留留时时间间tM包包含含了了组组分分随随流流动动相相通通过过柱柱子子所所须须的的时时间间和和组组分分在在固固定定相相中中滞滞留留所所须须的的时间，所以时间，所以tM实际上是组分在固定相中保留的总时间。实际上是组分在固定相中保留的总时间。n保保留
15、留时时间间是是色色谱谱法法定定性性的的基基本本依依据据，但但同同一一组组分分的的保保留留时时间间常常受受到到流流动动相相流流速速的的影影响响，因因此此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。4.相对保留值相对保留值 2,1 某组分某组分2的调整保留值与组分的调整保留值与组分1的调整保留的调整保留值之比，称为相对保留值。值之比，称为相对保留值。2,1=tR2 /tR1 n由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中
16、，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。依据。n在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），），然后再求其它峰（然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可）对这个峰的相对保留值，此时可用符号用符号 表示，即表示，即 =tR(i)/tR (s)式中式中tR (i)为后出峰的调整保留时间，所以为后出峰的调整保留时间，所以 总是总是大于大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。指标，又称选择因子。（五）（五）区域宽度区域宽度n色谱峰
17、的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，它直接反映了色谱操作条件的动力学因之一，它直接反映了色谱操作条件的动力学因素，某时间点上的色谱峰的区域宽度越小，对素，某时间点上的色谱峰的区域宽度越小，对组分的分离越有利，因此该项指标可用于衡量组分的分离越有利，因此该项指标可用于衡量色谱柱的分离效率。表示色谱峰区域宽度通常色谱柱的分离效率。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。标准偏差有三种方法。标准偏差、半峰宽半峰宽W1/2、峰底、峰底宽度宽度W。1.标准偏差标准偏差 当当色色谱谱峰峰为为高高斯斯曲曲线线时时，标标准准偏偏差差 可可衡衡量量，该该曲曲线线的的离离散散
18、程程度度。理理论论上上0.607倍倍峰峰高高处处色色谱谱峰峰宽宽的的一一半半刚刚好好等于标准偏差等于标准偏差 。2.半峰宽半峰宽Y1/2 即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为 Y1/2=2.354 3.峰底宽度峰底宽度Y 即即色色谱谱峰峰两两侧侧拐拐点点上上的的切切线线在在基基线线上上截截距距间间的的距距离离。它与标准偏差它与标准偏差 的关系是的关系是 Y=4 从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：(i)根根据据色色谱谱峰峰的的个个数数，可可以以判判断断样样品品中中所所含含组组分分的的最最少少个数；个数；(i
19、i)根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；(iii)根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；(iv)色色谱谱峰峰的的保保留留值值及及其其区区域域宽宽度度，是是评评价价色色谱谱柱柱分分离离效能的依据；效能的依据；(v)色色谱谱峰峰两两峰峰间间的的距距离离，是是评评价价固固定定相相（或或流流动动相相）选选择是否合适的依据。择是否合适的依据。（六）分配比（六）分配比 k 分配比又称容量因子，它是指在一定温度和分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在压力下，组分在两相间分配达平衡时，
20、分配在固定相和流动相中的质量比。即固定相和流动相中的质量比。即n式式中中Cs，Cm分分别别为为组组分分在在固固定定相相和和流流动动相相的的浓浓度度；Vm为为柱柱中中流流动动相相的的体体积积，近近似似等等于于死死体体积积。Vs为为柱柱中中固固定定相相的的体体积积，在在各各种种不不同同的的类类型型的的色色谱谱中中有有不不同同的的含含义义。例例如如：在在分分配配色色谱谱中中，Vs表表示示固固定定液液的的体体积积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。n分分配配比比k是是衡衡量量色色谱谱柱柱对对组组分分保保留留能能力力的的重重要要参参数数，k值值越越大大，说说
21、明明组组分分在在固固定定相相中中的的量量越越多多，相相当当于于柱柱的的容量大，因此又称分配容量或容量因子。容量大，因此又称分配容量或容量因子。nk值值也也决决定定于于组组分分及及固固定定相相热热力力学学性性质质。它它不不仅仅随随柱柱温温、柱柱压压变变化化而而变变化化，而而且且还还与与流流动动相相及及固固定定相相的的体体积有关。积有关。n分配比分配比 k 值可直接从色谱图中测得值可直接从色谱图中测得n（推导过程（推导过程 教材教材P.351 352）。）。(19-10)分配系数分配系数K与分配比与分配比 k 的关系的关系(推导过程推导过程 P.352)(19-11)n其中其中称为相比率，它是反映
22、各种色谱柱柱型特点的又称为相比率，它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其一个参数。例如，对填充柱，其值一般为值一般为635；对毛；对毛细管柱，其细管柱，其值为值为60600。n分配系数分配系数 K 及分配比及分配比 k 与选择因子与选择因子的关系的关系 对对A、B两组分的选择因子，用下式表示：两组分的选择因子，用下式表示：(19-13)n通过选择因子通过选择因子把实验测量值把实验测量值k与热力学性质与热力学性质的分配系数的分配系数K直接联系起来，直接联系起来，对固定相的对固定相的选择具有实际意义。选择具有实际意义。n如果两组分的如果两组分的K或或k值相等，则值相等，则 2,
23、1=1，两个，两个组分的色谱峰必将重合。两组分的组分的色谱峰必将重合。两组分的K或或k值值相差越大，则越可能分离得好。相差越大，则越可能分离得好。19-3 色谱法基本理论色谱法基本理论n图图19-3 示出了示出了A、B两组分沿色谱柱移动时，两组分沿色谱柱移动时，分离与浓度扩散的基本情况。分离与浓度扩散的基本情况。n由图可知：溶质由图可知：溶质A和和B在沿柱移动时，随着在沿柱移动时，随着两组分在色谱柱中移动距离的增加有两种现两组分在色谱柱中移动距离的增加有两种现象发生：象发生：两峰间的距离逐渐变大，同时，两峰间的距离逐渐变大，同时，每一组分的浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢每一组分的浓度轮廓（即区域
24、宽度）也慢慢变宽。显然，两峰间距离变大与区域扩宽是变宽。显然，两峰间距离变大与区域扩宽是一对矛盾。一对矛盾。n若要使若要使A、B组分完全分离，必须满足以下三点：组分完全分离，必须满足以下三点：n第一，两组分的分配系数必须有差异；第一，两组分的分配系数必须有差异；n第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；n第三，在保证快速分离的前提下，提供足够长的第三，在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。色谱柱。n一个完善的色谱理论应该能够较好的建立起能准一个完善的色谱理论应该能够较好的建立起能准确描述这两种情况变化的数学模型。确描述这两种情况变化的数学模型。
25、塔板理论与塔板理论与速率理论均以色谱过程中的分配系数恒定为前提速率理论均以色谱过程中的分配系数恒定为前提分别从不同的角度讨论了色谱分离问题，故都称分别从不同的角度讨论了色谱分离问题，故都称线性色谱理论。线性色谱理论。一、塔板理论一、塔板理论n将一根色谱柱比作一个精馏塔，即色谱柱的分将一根色谱柱比作一个精馏塔，即色谱柱的分离过程是在一系列连续、相等的水平塔板上进离过程是在一系列连续、相等的水平塔板上进行的精馏。每一块塔板的高度用行的精馏。每一块塔板的高度用H表示，称为表示，称为塔板高度，简称板高。塔板高度，简称板高。n塔板理论假设：塔板理论假设：在每一块塔板上，溶质在两相在每一块塔板上，溶质在两
26、相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。一个塔板的方式向前移动。n对于一根长为对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次的色谱柱，溶质平衡的次数应为：数应为：n=L/H n称为理论塔板数。与精馏塔一样，色称为理论塔板数。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，的增加而增加，随板高随板高H的增大而减小。的增大而减小。塔板理论指出：塔板理论指出：第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数板数n大于大于50时，可得到基本对称的峰形曲线。时，可得到基本对称的峰形曲线。在
27、色谱柱中，在色谱柱中，n值值一般很大，如气相色谱柱的一般很大，如气相色谱柱的n约为约为103 106，因而这时的流出曲线可趋近于，因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线。正态分布曲线。第二，当样品进入色谱柱后，只要各组分在第二，当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复多次两相间的分配系数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，仍可获得良好的分离。的分配平衡后，仍可获得良好的分离。n式中式中tR 与与Y1/2 (Y)应采用同一单位应采用同一单位(时间或距离时间或距离)。n从公式可以看出，在从公式可以看出，在tR 一定时，如果色谱峰很窄，则一定时，如果色谱峰很窄，则说明说
28、明n越大，越大，H越小，柱效能越高。越小，柱效能越高。n在实际工作中，由上式在实际工作中，由上式计算出来的计算出来的n和和H值，有时并不值，有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用tR计算时，计算时，没有扣除死时间没有扣除死时间tM。第三，第三，n与半峰宽及峰底宽的关系式为：与半峰宽及峰底宽的关系式为：（19-17）n有效板高有效板高：H有效有效=L/n有效有效 因为在相同的色谱条件下，用不同的物质测量后计算因为在相同的色谱条件下，用不同的物质测量后计算出来的塔板数不一定相同。因此，在说明柱效时，除出来的塔板数不一定相同。因此，在说明柱效时，除注明色
29、谱条件外，还应指出用什么物质进行测量。注明色谱条件外，还应指出用什么物质进行测量。所以常用有效塔板数所以常用有效塔板数n有效有效表示柱效：表示柱效：（19-18）（19-19）例例 已知某组分峰的峰底宽为已知某组分峰的峰底宽为40 s，保留时间为，保留时间为400 s，计算此色谱柱的理论塔板数。，计算此色谱柱的理论塔板数。解：解：n=16(tR/W)2=16 (400/40)2=1600 块块n例例2 P354n塔板理论是一种半经验性理论。它用热力学的塔板理论是一种半经验性理论。它用热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流出曲线的形状，并
30、提出了计算和评价解释了流出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效高低的参数。柱效高低的参数。n但是，色谱过程不仅受热力学因素的影响，而但是，色谱过程不仅受热力学因素的影响，而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，因此塔板理论只能定性地给出板高的概念，却因此塔板理论只能定性地给出板高的概念，却不能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为不能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数，因而限制了它的应用。板数，因而限制了它的应用。二、速率理论二、速率理论 1956年荷兰学者年荷兰学者va
31、n Deemter（范第姆特）等在研究（范第姆特）等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论速率理速率理论。他吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了论。他吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。上较好地解释了影响板高的各种因素。n该该理理论论模模型型对对气气相相、液液相相色色谱谱都都适适用用。van Deemter方方程的数学简化式为程的数学简化式为 H=A+B/u+C u n式式中中u为为流流动动相相的的线线速速度度；A、B、C
32、、为为常常数数，分分别别代代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。1、涡流扩散项、涡流扩散项（A）n在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动，故称涡流扩散。成紊乱的类似涡流的流动，故称涡流扩散。n 由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱柱中路径长短不一，因匀性，使组分在色谱柱
33、中路径长短不一，因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不一致，引起了色谱峰的变宽。不一致，引起了色谱峰的变宽。n色谱峰变宽的程度由下式决定：色谱峰变宽的程度由下式决定：A=2dp n上式表明，上式表明，A与填充物的平均直径与填充物的平均直径dp的大小和的大小和填充不规则因子填充不规则因子有关，与流动相的性质、线有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。速度和组分性质无关。n为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。n对于空心毛细管色谱柱，不存在涡流
34、扩散。对于空心毛细管色谱柱，不存在涡流扩散。n因此因此 A=0。2.2.分子扩散项分子扩散项 B/u（纵向扩散项）（纵向扩散项）n 纵纵向向分分子子扩扩散散是是由由浓浓度度梯梯度度造造成成的的。组组分分从从柱柱入入口口加加入入，其其浓浓度度分分布布的的构构型型呈呈“塞塞子子”状状。它它随随着着流流动动相相向向前前推推进进，由由于于存存在在浓浓度度梯梯度度，“塞塞子子”必必然然自自发发的的向前和向后扩散，造成谱带展宽。向前和向后扩散，造成谱带展宽。n分子扩散项系数为分子扩散项系数为 B=2 Dgn是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反
35、映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。的阻碍情况。n D Dg g为组分在流动相中扩散系数（为组分在流动相中扩散系数（cmcm3 3ss-1-1）,分子扩散分子扩散项与组分在流动相中扩散系数项与组分在流动相中扩散系数D Dg g成正比。成正比。nDg与流动相及组分性质有关：与流动相及组分性质有关：(a)相对分子质量大的组分相对分子质量大的组分Dg小，小，Dg反比于流动相相对反比于流动相相对分子质量的平方根，所以采用相对分子质量较大的流分子质量的平方根，所以采用相对分子质量较大的流动相，可使动相，可使B项降低；项降低；(b)Dg随柱温增高
36、而增加，但反比于柱压。随柱温增高而增加，但反比于柱压。n另外纵向扩散与组分在色另外纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关，流动谱柱内停留时间有关，流动相流速小，组分停留时间长，纵向扩散就大。因此为相流速小，组分停留时间长，纵向扩散就大。因此为降低纵向扩散影响，要加大流动相速度。对于液相色降低纵向扩散影响，要加大流动相速度。对于液相色谱，组分在流动相中纵向扩散可以忽略。谱，组分在流动相中纵向扩散可以忽略。3.传质阻力项传质阻力项 Cu 由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同。流动相，它们的传质过程不完全相同。（1 1
37、）气液色谱气液色谱 传质阻力系数传质阻力系数C包括气相传质阻力系数包括气相传质阻力系数Cg和液相传质和液相传质阻力系数阻力系数C1两项，即两项，即 C=Cg+C1 气气相相传传质质过过程程是是指指试试样样组组分分从从气气相相移移动动到到固固定定相相表表面面的的过过程程。这这一一过过程程中中试试样样组组分分将将在在两两相相间间进进行行质质量量交交换换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，n就被气相带走；有的则进入两相界面又来不及返回气就被气相带走；有的则进入两相界面又来不及返回气相。这样使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平相。这样使得试样
38、在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。n对于填充柱，气相传质阻力系数对于填充柱，气相传质阻力系数Cg为：为：Cg=0.01k2/(1+k)2 dp/Dg 式中式中k为容量因子。由上式看出，气相传质阻力与填为容量因子。由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度充物粒度dp的平方成正比，与组分在载气流中的扩散的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数系数Dg成反比。因此，采用粒度小的填充物和相对分成反比。因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使子质量小的气体（如氢气）做载气，可使Cg减小，提减小，提高柱效。高柱效。
39、n液相传质过程液相传质过程是指试样组分从固定相的气是指试样组分从固定相的气/液液界面移动到液相内部，并发生质量交换，达到界面移动到液相内部，并发生质量交换，达到分配平衡，然后又返回气分配平衡，然后又返回气/液界面的传质过程。液界面的传质过程。这个过程也需要一定的时间，此时，气相中组这个过程也需要一定的时间，此时，气相中组分的其它分子仍随载气不断向柱口运动，于是分的其它分子仍随载气不断向柱口运动，于是造成峰形扩张。液相传质阻力系数造成峰形扩张。液相传质阻力系数 C1为：为：C1=2/3 k/(1+k)2 df2/Dl 由由上上式式看看出出，固固定定相相的的液液膜膜厚厚度度df薄薄，组组分分在在液
40、相的扩散系数液相的扩散系数D1大，则液相传质阻力就小。大，则液相传质阻力就小。n降降低低固固定定液液的的含含量量，可可以以降降低低液液膜膜厚厚度度，但但k值值随随之之变变小小，又又会会使使C1增增大大。当当固固定定液液含含量量一一定定时时，液液膜膜厚厚度度随随载载体体的的比比表表面面积积增增加加而而降降低低，因因此此，一一般般采采用用比比表表面面积积较较大大的的载载体体来来降降低低液液膜膜厚厚度度。但但比比表表面面太太大大，由由于于吸吸附附造造成成拖拖尾尾峰峰，也也不不利利于于分分离离。虽虽然然提提高高柱柱温温可可增增大大D1，但但会会使使k值值减减小小，为为了了保保持持适适当当的的C1值值，
41、应应控制适宜的柱温。控制适宜的柱温。板高方程的作用板高方程的作用n 板高方程对选择色谱分离条件具有实际板高方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义。它指出了色谱柱填充的均匀指导意义。它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料粒度的大小，流动相的种类程度，填料粒度的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。但是应该指出，除上述造成谱峰影响。但是应该指出，除上述造成谱峰扩宽的因素外，还应该考虑柱外的谱峰扩宽的因素外，还应该考虑柱外的谱峰展宽、柱径、柱长等因素的影响。柱径展宽、柱径、柱长等因素的影响。柱径的影响如图的影响如图19-519-5n一、柱效和选择性一
42、、柱效和选择性n理论塔板数理论塔板数n(或或n有效有效)是衡量柱效的指标，它是衡量柱效的指标，它反映了色谱分离过程动力学性质。反映了色谱分离过程动力学性质。n在色谱法中。常用色谱图上两峰问的距离衡量在色谱法中。常用色谱图上两峰问的距离衡量色谱柱的选择性，其距离越大说明柱子的选择色谱柱的选择性，其距离越大说明柱子的选择n性越好，一般用选择因子性越好，一般用选择因子 表示两组分在给定表示两组分在给定柱子上的选择性。柱子的选择性主要取决于组柱子上的选择性。柱子的选择性主要取决于组n分在固定相上的热力学性质。分在固定相上的热力学性质。19-4 分离度分离度n二、分离度二、分离度n分离度分离度R是一个综
43、合性指标。是一个综合性指标。分分离离度度是是既既能能反反映映柱柱效效率率又又能能反反映映选选择择性性的的指指标标，称称总分离效能指标。总分离效能指标。n分分离离度度又又叫叫分分辨辨率率，它它定定义义为为相相邻邻两两组组分分色色谱谱峰峰保保留留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即：值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即：（19-26）nR值值越越大大，表表明明相相邻邻两两组组分分分分离离越越好好。一一般般说说，当当R1时时，两两峰峰有有部部分分重重叠叠；当当R=1时时，分分离离程程度度可可达达98%；当当R=1.5时时，分分离离程程度度 可可 达达 99.7%。通通 常常 用用R=1.
44、5作作为为相相邻邻两两组组分分已已完完全分离的标志。全分离的标志。分离度受柱效（分离度受柱效（n）、选择因子（）、选择因子（）和容量因子（）和容量因子（k）三）三个参数的控制。对于难分离物质对，由于它们的分配个参数的控制。对于难分离物质对，由于它们的分配系数差别小，可合理地假设系数差别小，可合理地假设 k1 k2=k，Y1Y2=Y。由由 n=16(tR/Y)2 得：得：1/Y=（n/4）（1/tR）分离度分离度R为：为：上式即为基本色谱分离方程式。上式即为基本色谱分离方程式。（19-27）在实际应用中，往往用在实际应用中，往往用neff代替代替n。基本的色谱方程的表达式：基本的色谱方程的表达式
45、：19-5 色谱定性和定量分析色谱定性和定量分析 一一、色谱的定性分析、色谱的定性分析 色谱定性分析任务就是确定色谱峰所代表的组分。色谱定性分析任务就是确定色谱峰所代表的组分。任一物质在一定的色谱条件下均有确定的保留值，因任一物质在一定的色谱条件下均有确定的保留值，因此保留值可作为色谱定性的依据。但不同的组分在同此保留值可作为色谱定性的依据。但不同的组分在同一色谱条件下，可能有相近或相同的保留值，即保留一色谱条件下，可能有相近或相同的保留值，即保留值并非专属的。因此仅根据保留值对一个完全未知的值并非专属的。因此仅根据保留值对一个完全未知的样品定性是困难的。如果将色谱与质谱或其它光谱法样品定性是
46、困难的。如果将色谱与质谱或其它光谱法联用，则是目前解决复杂混合物中未知物定性分析的联用，则是目前解决复杂混合物中未知物定性分析的最有效的技术。如果在了解样品的来源、性质、分析最有效的技术。如果在了解样品的来源、性质、分析目的的基础上，对样品组成作初步的判断，再结合下目的的基础上，对样品组成作初步的判断，再结合下列的方法则也可确定色谱峰所代表的化合物。列的方法则也可确定色谱峰所代表的化合物。（一）利用纯物质对照定性（一）利用纯物质对照定性 在一定的色谱条件下，一个未知物只有一个确定在一定的色谱条件下，一个未知物只有一个确定的保留时间。因此将已知纯物质在相同的色谱条件下的保留时间。因此将已知纯物质
47、在相同的色谱条件下的保留时间与未知物的保留时间进行比较，就可以定的保留时间与未知物的保留时间进行比较，就可以定性鉴定未知物。若二者相同，则未知物可能是已知的性鉴定未知物。若二者相同，则未知物可能是已知的纯物质；不同，则未知物就不是该纯物质。纯物质；不同，则未知物就不是该纯物质。纯物质对照法定性只适用于组分性质已有所了解，纯物质对照法定性只适用于组分性质已有所了解，组成比较简单，且有纯物质的未知物。组成比较简单，且有纯物质的未知物。（二）相对保留值法（二）相对保留值法 相对保留值相对保留值 i,s 是指组分是指组分i i与基准物质与基准物质s s调整保留值调整保留值的比值的比值 i,s =tRi
48、 /tRs i,s仅随固定液及柱温变化而变化，与其它操作条件无关。仅随固定液及柱温变化而变化，与其它操作条件无关。n用已求出的相对保留值与文献值比较即可定性。用已求出的相对保留值与文献值比较即可定性。通常选容易得到纯品的，而且与被分析组分相近的通常选容易得到纯品的，而且与被分析组分相近的物质作基准物质，如正丁烷、环己烷、正戊烷、苯、物质作基准物质，如正丁烷、环己烷、正戊烷、苯、对二甲苯、环己醇、环己酮等。对二甲苯、环己醇、环己酮等。（三）加入已知物增加峰高法（三）加入已知物增加峰高法 当未知样品中组分较多，所得色谱峰过密，当未知样品中组分较多，所得色谱峰过密，用上述方法不易辨认时，或仅作未知样
49、品指定用上述方法不易辨认时，或仅作未知样品指定项目分析时均可用此法。首先作出未知样品的项目分析时均可用此法。首先作出未知样品的色谱图，然后在未知样品加入某已知物，又得色谱图，然后在未知样品加入某已知物，又得到一个色谱图。峰高增加的组分即可能为这种到一个色谱图。峰高增加的组分即可能为这种已知物。已知物。二、定量分析二、定量分析n色谱定量的依据是，在一定的条件下，被测组色谱定量的依据是，在一定的条件下，被测组分的质量（或浓度）与检测器给出的响应信号分的质量（或浓度）与检测器给出的响应信号成正比。即：成正比。即：mi=fiA Ai mi=fih hi 式中式中mi为被测组分为被测组分i的质量；的质量
50、；Ai为被测组分为被测组分i的峰面积；的峰面积；fi为被测组分为被测组分i的校正因子。的校正因子。(19-30)(19-31)（一）峰面积测量方法（一）峰面积测量方法 峰面积是色谱图提供的基本定量数据，峰面积峰面积是色谱图提供的基本定量数据，峰面积测量的准确与否直接影响定量结果。对于不同测量的准确与否直接影响定量结果。对于不同峰形的色谱峰采用不同的测量方法。峰形的色谱峰采用不同的测量方法。（1）对称形峰面积的测量）对称形峰面积的测量 峰高乘以半峰宽法峰高乘以半峰宽法 对称峰的面积对称峰的面积 A=1.065 h Y1/2（2）不）不对称形峰面积的测量对称形峰面积的测量 峰高乘平均峰宽峰高乘平均