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1、实验实验 1 1颊粘膜上皮细胞基因组颊粘膜上皮细胞基因组DNADNA的抽的抽提及提及ACEACE基因多态性分析基因多态性分析一、实验目的一、实验目的掌握从微量来源的组织细胞中掌握从微量来源的组织细胞中抽提抽提基因组基因组DNADNA掌握掌握PCRPCR技术原理技术原理了解了解基因多态性分析基因多态性分析的方法。的方法。二、原理二、原理基因组基因组DNA抽提抽提 碱裂解法抽提基因组碱裂解法抽提基因组DNA（本实验）（本实验）用蛋白酶用蛋白酶K K和苯酚提取大分子和苯酚提取大分子DNA 裂解裂解-蛋白酶蛋白酶K-K-沉淀法沉淀法快速提取快速提取DNAACE基因多态性分析基因多态性分析 PCR方法分
2、析基因多态性方法分析基因多态性真核生物基因组中非编码序列多于编码序列真核生物基因组中非编码序列多于编码序列基因组基因组编码序列编码序列非编码序列非编码序列调控序列调控序列重复序列重复序列高重复序列高重复序列（串联排列，大卫星、小卫星、微卫星）（串联排列，大卫星、小卫星、微卫星）中重复序列中重复序列（散在分布散在分布；部分编码；部分编码；Alu家族家族）低重复序列或单低重复序列或单拷贝拷贝 Alu家族家族重复单位：重复单位：300bp左右；左右；130+31+130bp具具Alu酶切位点酶切位点30-50万次万次功能：基因调控功能：基因调控Alu元件的插入、删除和重组与许多先天性元件的插入、删除
3、和重组与许多先天性遗传疾病和癌症相关遗传疾病和癌症相关 ACE基因多态性分析基因多态性分析(血管紧张素转换酶血管紧张素转换酶,Angiotesin converting enzyme,ACE)基因诊断基因诊断：利用现代分子生物学和分子遗传学的方法，：利用现代分子生物学和分子遗传学的方法，从从DNADNA、RNARNA水平检测基因的存在、结构异常和表达状水平检测基因的存在、结构异常和表达状态，从而对疾病做出诊断的方法。态，从而对疾病做出诊断的方法。基因多态性基因多态性：指在一随机婚配的群体中，染色体同一：指在一随机婚配的群体中，染色体同一基因座位点上有两种或两种以上的基因型，它可决定基因座位点上
4、有两种或两种以上的基因型，它可决定人体对疾病的人体对疾病的易感性易感性、临床表现多样性和对药物治疗、临床表现多样性和对药物治疗反应的差异性。反应的差异性。理论基础理论基础 ACEACE基基因因第第1616内内含含子子存存在在一一段段长长度度为为287bp287bp（Alu序序列列）的的插插入入/缺缺失失（I/DI/D）多多态态性性片片段段，I/DI/D多多态态性性与与血血液液ACEACE水水平平有有明明确确关关系系，DDDD型型ACEACE水水平平最最高高，IDID次次之之，IIII最最低低。左左室室肥肥大大患患者者中中DDDD型频率明显增高。型频率明显增高。实验原理实验原理 以以DNADNA
5、为为模模板板，ACEACE基基因因特特异异的的引引物物序序列列位位于于287bp287bp插插入入/缺缺失失片片段段的的两两侧侧进进行行PCRPCR扩扩增增，故故IIII型型扩扩增增片片段段长长度度约约为为490bp490bp，DDDD型型扩扩增增片片段段长长度度约约为为190bp190bp，IDID型型扩扩增增片片段段为为个个，分分别别为为190bp190bp和和490bp490bp。根据。根据PCRPCR扩增片段的大小可进行多态性分析。扩增片段的大小可进行多态性分析。插入片段插入片段插入型插入型缺失型缺失型490bp190bp操作步骤操作步骤基因组基因组DNADNA抽提抽提PCRPCR反应
6、反应琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测1.1.基因组基因组DNADNA抽提抽提溶液溶液 10 ml 10 ml 漱口漱口2020秒秒 收集漱口水；收集漱口水；3000g5minRT3000g5minRT，弃上清；，弃上清；溶液溶液 250 ul 250 ul 重悬沉淀；重悬沉淀；3000g1min3000g1min，弃上清；，弃上清；溶液溶液 250 ul 250 ul 重悬沉淀，振荡重悬沉淀，振荡1010秒；（秒；（变性变性）转至转至0.5 ml0.5 ml离心管，离心管，995min995min；加溶液加溶液IV 50 ul IV 50 ul 振荡振荡5 5秒；（秒；（中和中和）3000
7、g1min3000g1min，上清转移至新上清转移至新0.5 ml0.5 ml离心管，取离心管，取5 ul5 ul用于用于PCR.PCR.2.PCR2.PCR反应反应取消毒的取消毒的0.5 ml0.5 ml离心管，加入下列成分：离心管，加入下列成分：10PCR Buffer10PCR Buffer dNTP(2.5 mM each)dNTP(2.5 mM each)mix:10l10l Taq DNA polymerase Taq DNA polymerase DNADNA模板模板 5 l5 l 引物混合物引物混合物(10M each)2 l(10M each)2 l ddH ddH2 2O 3 lO 3 l 总体系总体系 20 l20 l扩增程序为：扩增程序为：9494变性变性30s30s，5555复性复性30s30s，7272延伸延伸40s40s，共反应，共反应3535个个循环。循环。琼脂糖电泳检测琼脂糖电泳检测制备制备1 1琼脂糖凝琼脂糖凝点样，电泳点样，电泳紫外灯下观察结果紫外灯下观察结果ACEACE基因多态性电泳图基因多态性电泳图2k1k750bp500bp250bp100bp