北工大微生物学第2章.ppt

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1、第二章 微生 物的 纯培 养和 显微 技术培养物:在人为规定条件下培养,繁殖得到的微生物群体.纯培养物-而具有一种微生物的培养物.显微技术-显微标本的制作,观察,测定,分析及记录等.自然环境如土壤和水中，通常栖息自然环境如土壤和水中，通常栖息着的是许多不同微生物混杂在一起着的是许多不同微生物混杂在一起的群体。哪怕是一粒砂或尘土，也的群体。哪怕是一粒砂或尘土，也常含有多种细菌及其它微生物。常含有多种细菌及其它微生物。第一节 微生物的分离和纯培养一.无菌技术培养物的纯洁 污染 自身/环境1.微生物培养常用的器具及其灭菌试管 玻璃烧瓶 培养皿 培养基第一节 微生物的分离和纯培养2.接种操作二、用固体

2、培养基获得纯培养二、用固体培养基获得纯培养微微生生物物在在自自然然界界中中不不仅仅分分布布很很广广，而而且且都都是是混混杂杂地地生生活活在在一一起起。要要想想研研究究或或利利用用某某一一微微生生物物，必必须须把把混混杂杂的的微微生生物物类类群群分分离离开开来来，以以得得到到只只含含一一种种微微生生物物的的培培养养。微微生生物物学学中中将将在在实实验验室室条条件件下下从从一一个个细细胞胞或或一一种种细细胞胞群群繁繁殖殖得得到到的的后后代代称称为为纯纯培培养养。纯纯培培养养的的分分离离，是是研研究究和和利利用用微微生生物物的的第第一一步步，是是微微生生物物工工作作中中最最重重要要的的环环节之一。节

3、之一。最最常常用用的的方方法法有有涂涂布布平平板板法法、稀稀释释倒倒平平板板法法、平板划线法、平板划线法、稀释摇管法等分离法等。稀释摇管法等分离法等。二、用固体培养基获得纯培养二、用固体培养基获得纯培养涂布平板法涂布平板法-将已经熔化的培养基倒入将已经熔化的培养基倒入无菌培养皿无菌培养皿,制成无菌平板制成无菌平板,冷却凝固后冷却凝固后,将将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面板表面,再用无菌涂布棒将菌液均匀的分散再用无菌涂布棒将菌液均匀的分散至整个平板表面至整个平板表面,经培养后挑取单个菌落经培养后挑取单个菌落.涂布平板法涂布平板法:平板涂布分离法（平

4、板涂布分离法（Spread PlateSpread Plate）简单易行，但易造成机械损伤简单易行，但易造成机械损伤Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod.纯培养的分离方法纯培养的分离方法 稀释倒平板法稀释倒平板法 稀释倒平板法稀释倒平板法这这是是最最常常用用的的纯纯种种分分离离法法，先先将将待待分分离离的的材材料料作作一一系系列列的的稀稀释释(如如1 1：1010、1 1：100100、1 1：10001000、1 1：1010，000)000)，然然后后分分别别

5、取取不不同同稀稀释释液液少少许许，与与已已熔熔化化并并冷冷却却至至4545的的琼琼脂脂培培养养基基相相混混合合，摇摇匀匀后后，倾倾入入灭灭过过菌菌的的培培养养皿皿中中，待待琼琼脂脂凝凝固固后后，保保温温培培养养一一定定时时间间即即可可出出现现菌菌落落。如如果果稀稀释释得得当当，平平皿皿上上就就可可出出现现分分散散的的单单个个菌菌落落，这这个个菌菌落落可可能能就就是是由由一一个个细细胞胞繁繁殖殖形形成成的的。随随后后挑挑取取该该单单个个菌菌落落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。或重复以上操作数次，便可得到纯培养。稀释倒平板法分离微生物稀释倒平板法分离微生物平板划线法平板划线法将将已已熔熔化化

6、的的培培养养基基倒倒入入无无菌菌平平皿皿，冷冷却却凝凝固固后后，用用接接种种环环沾沾取取少少许许待待分分离离的的材材料料，在在培培养养基基表表面面进进行行平平行行划划线线、扇扇形形划划线线或或其其他他形形式式的的连连续续划划线线，微微生生物物将将随随着着划划线线次次数数的的增增加加而而分分散散，经经保保温温培培养养形形成成菌菌落落。划划线线开开始始的的部部分分细细菌菌分分散散度度小小，形形成成的的菌菌落落往往往往连连在在一一起起。由由于于连连续续划划线线，微微生生物物逐逐渐渐减减少少，划划到到最最后后，常常可可形形成成单单个个孤孤立立的的菌菌落落。这这种种单单个个菌菌落落可可能能由由一一个个细

7、细胞胞繁繁殖殖而而来来，故故可可获获得得纯纯培培养养。用用其其他他工工具具如如弯弯形形玻玻璃璃代代替替接接种种环环，在在培培养养基基表表面面涂涂布布，亦亦可得到同样结果。此法较为简便可得到同样结果。此法较为简便。平板划线法分离微生物平板划线法分离微生物平板划线分离法（平板划线分离法（Streak PlateStreak Plate）特点：快速、方便。特点：快速、方便。分区划线（适用于浓度较大的样品）分区划线（适用于浓度较大的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）An inoculating loop is used to thin out organisms o

8、n the surface of the agar.稀释摇管法稀释摇管法先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热,使琼脂使琼脂熔化后冷却并保持在熔化后冷却并保持在50500 0C C左右左右,将待分离的材料用将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释这些试管进行梯度稀释,试管迅速摇动均匀试管迅速摇动均匀,冷凝后冷凝后,在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡混合物混合物,将培养基和空气隔开将培养基和空气隔开.培养后培养后,菌落形成在菌落形成在琼脂柱的中间琼脂柱的中间.进行单菌落的挑取和移植进行单菌落的挑取和移植,需要先用需要

9、先用一灭菌针将液体石蜡一灭菌针将液体石蜡-固体石蜡盖取出固体石蜡盖取出,再用一只毛再用一只毛吸管插入琼脂和管壁之间吸管插入琼脂和管壁之间,吹入无菌无氧气体吹入无菌无氧气体,将琼将琼脂柱吸出脂柱吸出,置放在培养皿中置放在培养皿中,用无菌刀将琼脂柱切成用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植薄片进行观察和菌落的移植.微生物纯培养分离方法的比较微生物纯培养分离方法的比较涂布平板法涂布平板法:简单易行，但易造成机械损伤简单易行，但易造成机械损伤 稀释平板法稀释平板法 既可定性，又可定量，用途广泛既可定性，又可定量，用途广泛平板划线法平板划线法 方法简便，多用于分离细菌方法简便，多用于分离细菌稀释摇

10、管法稀释摇管法局限于高度专业化的科学研究局限于高度专业化的科学研究Viable cell count1.dilute sample1 ml9 ml10 100 1000 104 105 106 107cell no/ml2.plate out 0.1 ml Inoculating an agar plate to obtain single coloniesMixed culturePure cultureMixed cultureOral swabSwab from sole of shoeEach colony was examined microscopically三、用液体培养基获得纯

11、培养三、用液体培养基获得纯培养 个体大的细菌原生动物藻类稀释法-接种物在液体培养基中进行顺序稀释,以得到高度稀释效果,使一只试管中分配不到一个微生物.如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物.如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了,得到的纯培养物的概率就会下降.液体稀释法液体稀释法四四.单细胞挑取法分离单细胞挑取法分离这这种种方方法法是是从从待待分分离离的的材材料料中中挑挑取取一一个个细细胞胞来来培培养养，从从而而获获得得纯纯培培养养。具具体体方方法法是是将将显显微微镜镜挑挑取取器器装装置置在在显显微微镜镜上上，把把一一滴滴菌菌悬悬液液

12、置置于于载载玻玻片片上上，用用安安装装在在显显微微镜镜挑挑取取器器上上的的极极细细的的毛毛细细吸吸管管，在在显显微微镜镜下下对对准准某某一一个个单单独独的的细细胞胞挑挑取取，再再接接种种到到培培养养基基上上培培养养。此此法法需需要要非非常常熟熟练练的的操操作作人人员员，多多限限于于高高度度专专业化的科学研究中采用。业化的科学研究中采用。单细胞（单孢子）分离法单细胞（单孢子）分离法采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。毛细管法：

13、毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。显微操作仪：显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。得纯培养。小液滴法：小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。五五.利用选择培养基分离法利用选择培养基分离法不不不不同同同同微微微微生生生生物物物物需需需需要要要要不不不不同同同同的的的的营营营营养养养养物物物物质质质质。有有有有些些些些微微微微生

14、生生生物物物物生生生生长长长长适适适适于于于于酸酸酸酸性性性性环环环环境境境境，有有有有些些些些则则则则适适适适于于于于碱碱碱碱性性性性环环环环境境境境。各各各各种种种种微微微微生生生生物物物物对对对对不不不不同同同同的的的的化化化化学学学学试试试试剂剂剂剂如如如如消消消消毒毒毒毒剂剂剂剂(酚酚酚酚)、染染染染料料料料(结结结结晶晶晶晶紫紫紫紫等等等等)、抗抗抗抗生生生生素素素素及及及及其其其其他他他他物物物物质质质质等等等等具具具具有有有有不不不不同同同同的的的的抵抵抵抵抗抗抗抗能能能能力力力力。利利利利用用用用这这这这些些些些特特特特性性性性，便便便便可可可可配配配配制制制制成成成成适适适

15、适合合合合于于于于某某某某种种种种微微微微生生生生物物物物生生生生长长长长而而而而限限限限制制制制其其其其他他他他微微微微生生生生物物物物生生生生长长长长的的的的各各各各种种种种选选选选择择择择性性性性培培培培养养养养基基基基，以以以以达达达达到到到到纯纯纯纯种种种种分分分分离离离离的的的的目目目目的的的的。另另另另外外外外，也也也也可可可可以以以以将将将将待待待待分分分分离离离离的的的的样样样样品品品品先先先先进进进进行行行行适适适适当当当当处处处处理理理理，以以以以消消消消除除除除不不不不希希希希望望望望分分分分离离离离到到到到的的的的微微微微生生生生物物物物。对对对对一一一一些些些些生生

16、生生理理理理类类类类型型型型比比比比较较较较特特特特殊殊殊殊的的的的微微微微生生生生物物物物，为为为为了了了了提提提提高高高高分分分分离离离离机机机机率率率率，往往往往往往往往在在在在涂涂涂涂布布布布分分分分离离离离前前前前先先先先进进进进行行行行富富富富集集集集培培培培养养养养，其其其其目目目目的的的的是是是是提提提提供供供供一一一一个个个个特特特特别别别别设设设设计计计计的的的的培培培培养养养养环环环环境境境境，以以以以帮帮帮帮助助助助所所所所需需需需的的的的特特特特殊殊殊殊生生生生理理理理类类类类型型型型的的的的微微微微生生生生物物物物的的的的生生生生长长长长，而而而而不利于其他类型微生

17、物的生长。不利于其他类型微生物的生长。不利于其他类型微生物的生长。不利于其他类型微生物的生长。选择性培养分离法选择性培养分离法选择性培养分离法选择性培养分离法为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。件等，采用选择培养的方法进行分离。利用选择培养基进行直接分离利用选择培养基进行直接分离富集培养富集培养选择培养基分离法1.dilute sample1 ml9 ml10 100 1000 104 105 106 107牛肉膏培养基牛

18、肉膏培养基土豆培养基土豆培养基高氏培养基高氏培养基细菌在固体培养基中的生长情况光滑型菌落粗糙型菌落粘液型菌落细菌在液体培养基中的生长情况菌膜菌沉淀均匀浑浊对照细菌在半固体培养基中的生长情况六.微生物的保藏技术通过分离纯化得到的微生物纯培养物通过分离纯化得到的微生物纯培养物,必须通过保藏必须通过保藏技术使其在一定时间内不死亡技术使其在一定时间内不死亡,不会被其他微生物污不会被其他微生物污染染,不会因发生变异而丢失重要的生物学性状不会因发生变异而丢失重要的生物学性状,否则就否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行.生物的生长一般都需要一定的水分生物

19、的生长一般都需要一定的水分,适宜的温度和合适宜的温度和合适的营养适的营养,微生物也不例外微生物也不例外.菌种保藏就是根据菌种的菌种保藏就是根据菌种的特性及保藏目的的不同特性及保藏目的的不同,给微生物菌株以特定的条件给微生物菌株以特定的条件,使其存活而得以延续使其存活而得以延续.例如例如:培养基或宿主培养基或宿主菌株连续移种菌株连续移种 改变环境条件改变环境条件-干燥干燥,低温低温.缺氧缺氧.避光避光,缺乏营养缺乏营养 使菌株的代谢水平降低使菌株的代谢水平降低,乃至完全停止乃至完全停止.半休眠半休眠.休眠休眠.六.微生物的保藏技术 菌种是重要的生物资源，研究和选择良菌种是重要的生物资源，研究和选

20、择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。好的菌种保藏方法具有重要的意义。菌种保藏的目的菌种保藏的目的n菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研亡、不变异、不被污染，以达到便于研 究、交换和使用等诸方面的需要。究、交换和使用等诸方面的需要。菌种保藏的原理菌种保藏的原理首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。子、芽孢等。其次应人为地创造环境条件（如：干其次

21、应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。眠状态。尽可能多的采用不同的手段保藏尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株一些比较重要的微生物菌株菌种保藏方法菌种保藏方法各种微生物由于遗传特性不同，各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性

22、和设备的通用性、操作的简便性和设备的普及性。普及性。斜面低温保藏法斜面低温保藏法 石蜡油封藏法石蜡油封藏法 砂土管保藏法砂土管保藏法 麸皮保藏法麸皮保藏法 甘油悬液保藏法甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法 宿主保藏法宿主保藏法1.斜面低温保藏法斜面低温保藏法常用保藏法常用保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全 后，置于后，置于后，置于后，置于4444左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏左右的冰

23、箱中保藏，每隔一定时间（保藏左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏 期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。如此连续不断。如此连续不断。如此连续不断。此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏此法的主要保藏措施是低温。一般可保存此法的主要保藏措施是低温。一般可保存此法的主要保藏措施是低温。

24、一般可保存此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1 1 1 16 6 6 6 个月左右。个月左右。个月左右。个月左右。优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点 是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期 短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污

25、 染。染。染。染。2.石蜡油封藏法石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体 石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端上，石蜡油层高出斜面顶端上，石蜡油层高出斜面顶端上，石蜡油层高出斜面顶端1cm1cm1cm1cm，使培养物与空气隔绝，使培养物与空气隔绝，使培养

26、物与空气隔绝，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4444冰箱内冰箱内冰箱内冰箱内 保藏。保藏。保藏。保藏。此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保此法的主要保

27、藏措施是低温、阻氧。一般可保此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保 存存存存1 1 1 12 2 2 2年左右。年左右。年左右。年左右。3.砂土管保藏法砂土管保藏法一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的 微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的 细菌及酵母则不适用。细菌及酵母则不适用

28、。细菌及酵母则不适用。细菌及酵母则不适用。n n砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等 诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物 移接方便，经济简便。它的保藏期约移接方便，经济简便。它的保藏期约移接方便，经济简便。它的保藏期约移接方便，经济简便。它的保藏期约1 1 1 110101010年。年。年。年。n 该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装

29、该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约于小试管中，砂土的高度约1cm1cm，121121蒸汽灭菌蒸汽灭菌1 1，间歇灭间歇灭菌菌3 3次。次。5050烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约2 24h4h，用火焰用火焰熔封管口熔封管口(或用石蜡封口或用石蜡封口)，置于干燥器中，在室温或，置于干燥器中，在室温或44冰箱冰箱内保藏。内

30、保藏。4.麸皮保藏法麸皮保藏法又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然 后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水 以一定的比例拌匀，装量为试管体积以一定的比例拌匀，装量为试管体积以一定的比例拌匀，装量为试管体积以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/52/52/52/5，湿热灭菌后经，湿热灭菌后经，

31、湿热灭菌后经，湿热灭菌后经 冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将 试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干 燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管

32、用火焰熔 封，再保藏，则效果更好。封，再保藏，则效果更好。封，再保藏，则效果更好。封，再保藏，则效果更好。此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏 期在期在期在期在1 1 1 1年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较 多采用。多采用。多采用。多采用。5.甘油悬液保藏法甘油悬液保藏法此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下此法是将

33、菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用度若采用度若采用度若采用20202020，保藏期约为，保藏期约为，保藏期约为，保藏期约为1 1 1 1年，而采用年，而采用年，而采用年，而采用70707070，保藏期可达，保藏期可达，保藏期可达，保藏期可达10101010年。年。年。年。将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经将拟保藏

34、菌种对数期的培养液直接与经121121121121蒸汽灭菌蒸汽灭菌蒸汽灭菌蒸汽灭菌20min20min20min20min的甘油混合，并使甘的甘油混合，并使甘的甘油混合，并使甘的甘油混合，并使甘油的终浓度在油的终浓度在油的终浓度在油的终浓度在1010101015151515，再分装于小离，再分装于小离，再分装于小离，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。心管中，置低温冰箱中保藏。心管中，置低温冰箱中保藏。心管中，置低温冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法保藏。基因工程菌常采用本法保藏。基因工程菌常采用本法保藏。基因工程菌常采用本法保藏。6.冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简

35、称冻干法。它通常是用保护剂制又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥

36、的固体菌块。并在真空条件下立脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。处于休眠状态，而得以长期保藏。处于休眠状态，而得以长期保藏。处于休眠状态，而得以长期保藏。n 此法适用于各大类微生物。此法适用于各大类微生物。n 此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂

37、，保藏此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂，保藏期一般长达期一般长达5 51515年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。用的一种较理想的保藏方法。n 该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。7.液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（保护剂

38、，在液氮超低温（保护剂，在液氮超低温（保护剂，在液氮超低温（196196196196）下保藏的方法。其主要原）下保藏的方法。其主要原）下保藏的方法。其主要原）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰

39、晶而使细胞损伤。成冰晶而使细胞损伤。成冰晶而使细胞损伤。成冰晶而使细胞损伤。此法适用于各种微生物菌种的保藏。此法适用于各种微生物菌种的保藏。此法适用于各种微生物菌种的保藏。此法适用于各种微生物菌种的保藏。此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般可达到一般可达到一般可达到一般可达到15151515年以上，是目前公认的最有效的菌种年以上，是目前公认的最有效的菌种年以上，是目前公认的最有效的菌种年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。长期保藏技术之一。

40、长期保藏技术之一。长期保藏技术之一。此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。形式的微生物进行保藏。形式的微生物进行保藏。形式的微生物进行保藏。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。操作费用较高。操作费用较高。操作费用较高。8.宿主保藏法宿主保藏法此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病

41、毒、此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克次氏体等）。立克次氏体等）。立克次氏体等）。立克次氏体等）。植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻或干燥保存。或干燥保存。或干燥保存。或干燥保存。噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。直接保存。直接保存

42、。直接保存。动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，然后分装于试管中密封，低温保存。然后分装于试管中密封，低温保存。然后分装于试管中密封，低温保存。然后分装于试管中密封，低温保存。在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保 藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简 便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬 液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法

43、和 液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效 果最好。应用时，可根据实际需要选用。果最好。应用时，可根据实际需要选用。美国采用冷冻干燥保藏法和美国采用冷冻干燥保藏法和 液氮保藏法来保藏所有菌种。液氮保藏法来保藏所有菌种。我国采用斜面低温保藏法、我国采用斜面低温保藏法、冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进 行菌种保藏。行菌种保藏。第二节 显微镜和显微技术微生物微生物-显微镜观察显微镜观察显微镜观察的因素显微镜观察的因素-1.-1.分辨率分辨率:能辨别两点之间最能辨别两点之间最小距离的能力小距离的能力;2.;2.反差反差:指样品区别于背景的程度指

44、样品区别于背景的程度,他们与显微镜的自身特点有关他们与显微镜的自身特点有关,但也决定于进行显但也决定于进行显微镜观察时对显微镜的正确使用以及良好的标本微镜观察时对显微镜的正确使用以及良好的标本制作和观察技术制作和观察技术.这就是显微技术这就是显微技术.现代显微技术现代显微技术-不仅是观察物体的形态不仅是观察物体的形态.结构结构,而且而且发展到对物体的组成成分定性和定量发展到对物体的组成成分定性和定量,特别是与计特别是与计算机科学技术的结合出现的图象分析算机科学技术的结合出现的图象分析.模拟仿真等模拟仿真等技术技术,为探索微生物的奥秘增添了强大的武器为探索微生物的奥秘增添了强大的武器.第二节 显

45、微镜和显微技术一.显微镜的种类和原理显微镜-将微小物体或物体的微细部分高倍放大，以便观察的仪器或设备。1.普通光学显微镜以可见光为光源的显微镜。普通的光学显微镜在结构上可分为光学系统和机械装置两个部分。光学系统主要包括目镜、物镜、聚光器、光阑及光源等部分。机械装置主要包括镜筒、镜柱、载物台、镜座、粗细调节螺旋等部分 第二节 显微镜和显微技术目镜位于显微镜筒的上方，一般由两个凸透镜构成。它除了进一步扩大物镜所形成的实像之外，也限制了眼睛所观察的视野。按放大率分,常用目镜有5倍、10倍和15倍三种。第二节 显微镜和显微技术物镜一般位于显微镜筒的下方，接近所观察的物体。由810片透镜组成。其作用一是

46、放大(给物体造成一个放大的实像）,二是保证像的质量,三是提高分辨率。常用物镜可按放大率分为低倍(4)、中倍(10或20)、高倍(40)和油浸物镜(100)。多个物镜共同镶在换镜转盘上，可以按需要转动转盘选择不同倍数的物镜。第二节 显微镜和显微技术显微镜的放大倍数为目镜倍数乘物镜倍数，如目镜为显微镜的放大倍数为目镜倍数乘物镜倍数，如目镜为1010倍，倍，物镜为物镜为4040倍倍,则放大倍数为则放大倍数为40104010倍（放大倍（放大400400倍）。优良倍）。优良的显微镜可放大的显微镜可放大20002000倍，可分辨相距倍，可分辨相距110cm110cm的两点。的两点。普通光学显微镜的照明光源

47、位于聚光器的下方，为特制的普通光学显微镜的照明光源位于聚光器的下方，为特制的照度均匀的强光灯泡，并且配有可变电阻，可以改变光线照度均匀的强光灯泡，并且配有可变电阻，可以改变光线的强度。的强度。第二节 显微镜和显微技术由于普通光学显微镜的光源光线自镜体下方向上透射，通过聚光镜、物镜，达到目镜，因此在医学及生物学研究中必须将被观察的样品切成能透过光线的、厚约6mm 的薄片，并且要进行染色以显示不同的组织和细胞等细微结构。第二节 显微镜和显微技术整个加工过程称常规组织制片技术，包括选取适当的组织材料经甲醛（福尔马林）液固定，逐级酒精脱水，石蜡包埋，用切片机将组织切成薄片裱在玻璃片上，再经苏木素伊红染

48、料着色，最后将组织玻片封固在光学树脂胶内。制好的组织玻片可长期保存。第二节 显微镜和显微技术显微镜的目镜和物镜安装在镜筒的两端，它们的距离是固定的。将组织玻片放在载物台上，旋转粗调螺旋使载物台接近物镜。组织切片进入物镜第一焦平面，目镜内即可见标本内的组织影像。然后用细调螺旋使目镜内的影像清晰即可进行观察。改换放大倍数时就要调换目镜或物镜。第二节 显微镜和显微技术暗视野显微镜-在普通光学显微镜台下配一个暗视野聚光器,来自下面光源的光线被抛物面聚光器反射，形成了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。因此视野是暗的，视野中直径大于 的微粒将光线散射，其大小和形态可清楚看到。甚至可看到普通明视野显微镜

49、中看不见的几个毫微米的微粒。因此在某些细菌、细胞等活体检查中常常使用。第二节 显微镜和显微技术荧光显微镜-在短光波(紫外光或紫蓝色光,波长250400nm）照射下，某些物质吸收光能，受到激发并释放出一种能量降级的较长的光波（蓝、绿、黄或红光，波长400800nm），这种光称荧光。第二节 显微镜和显微技术某种物质在短光波照射下即可发生荧光，如组织内大部分脂质和蛋白质经照射均可发出淡蓝色荧光，称为自发性荧光。但大部分物质需要用荧光染料（如吖啶橙、异硫氰酸荧光素等）染色后，在短光波照射下才能发出荧光。第二节 显微镜和显微技术荧光显微镜的光源为高压汞灯，发出的紫外光源荧光显微镜的光源为高压汞灯，发出的

50、紫外光源经过激发滤光片经过激发滤光片(此滤光片可通过对标本中荧光物此滤光片可通过对标本中荧光物质合宜的激发光质合宜的激发光)过滤后射向普勒姆氏分色镜过滤后射向普勒姆氏分色镜,分色分色镜将激发光向下反射镜将激发光向下反射,通过物镜投射向经荧光染料通过物镜投射向经荧光染料染色的标本。染色的标本。染料被激发并释放出荧光染料被激发并释放出荧光,通过物镜通过物镜,穿过分色镜和穿过分色镜和目镜即可进行观察。目镜下方安置有屏障滤片目镜即可进行观察。目镜下方安置有屏障滤片(只只允许特定波长的荧光通过允许特定波长的荧光通过)以保护眼睛及降低视野以保护眼睛及降低视野暗度暗度 第二节 显微镜和显微技术荧光显微镜的特